漢氏菱形藻生理特性對硝基苯脅迫的響應(yīng)

杜慶才 石先陽 胡春香

摘要：研究不同質(zhì)量濃度硝基苯（nitrobeneze）對漢氏菱形藻（Nitzschia hantzschia）生長、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、葉綠素a含量和藻細(xì)胞導(dǎo)電率的影響。結(jié)果表明，隨著硝基苯質(zhì)量濃度的升高，漢氏菱形藻的生長受到抑制，處理5 d時藻培養(yǎng)液依次由深黃色逐漸變?yōu)闇\黃色;2 d后可溶性糖含量升高，1 d時100 mg/L硝基苯處理組可溶性蛋白含量為對照組的89.1%，為最低值，之后呈現(xiàn)逐漸上升趨勢。低質(zhì)量濃度硝基苯對藻細(xì)胞葉綠素a含量有促進(jìn)作用，中、高質(zhì)量濃度有抑制作用，而50 mg/L處理3 d后葉綠素a含量逐漸恢復(fù);藻細(xì)胞的電導(dǎo)率隨硝基苯質(zhì)量濃度的升高而逐漸升高，低質(zhì)量濃度處理3 d后電導(dǎo)率逐漸恢復(fù)，而高質(zhì)量濃度傷害藻細(xì)胞，導(dǎo)致漢氏菱形藻逐漸死亡。

關(guān)鍵詞：硝基苯;漢氏菱形藻;生理;電導(dǎo)率;環(huán)境脅迫

中圖分類號： X172 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號：1002-1302（2020）17-0302-05

硝基苯類是被廣泛應(yīng)用的化工原料，據(jù)統(tǒng)計(jì)每年大約有因硝基苯類產(chǎn)生的3萬t以上污染物流入環(huán)境中[1]，但隨經(jīng)濟(jì)發(fā)展該類化合物的需求呈明顯上升趨勢。美國環(huán)境保護(hù)局（EPA）調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在有機(jī)化學(xué)品廠的廢水中硝基苯含量最高可達(dá)190 mg/L，調(diào)查案例中有3%以上的工廠廢水中的硝基苯含量在100 mg/L以上[2]。2005年，國內(nèi)突發(fā)龍騰化工廠硝基苯車間爆炸、海門港化工廠硝基苯裝置爆炸、中石油吉林石化公司雙苯廠爆炸等事故導(dǎo)致硝基苯直接泄露[3-4]。硝基苯是高毒性物質(zhì)，可通過接觸或食物鏈富集危害生物[5-6]。國內(nèi)外對硝基苯類化合物的研究主要集中于它們在生物體內(nèi)的富集與毒性毒理機(jī)制方面[7-11]。藻類是水生態(tài)系統(tǒng)的重要初級生產(chǎn)者，漢氏菱形藻（Nitzschia hantzschia）是淡水生態(tài)系統(tǒng)中的廣適物種，硝基苯對其生理特性的脅迫響應(yīng)未見報道。本研究針對硝基苯污染對水生態(tài)環(huán)境中漢氏菱形藻的生理指標(biāo)進(jìn)行測定，探究硝基苯對其的生理響應(yīng)機(jī)制，旨在為探索污染物硝基苯對環(huán)境影響情況提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

漢氏菱形藻由中國科學(xué)院水生生物研究所淡水藻類藻種庫提供。取對數(shù)生長期的漢氏菱形藻接種于250 mL三角瓶中，加 100 mL HB-D1培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為溫度（25±1） ℃，連續(xù)24 h光照培養(yǎng)，光照度約2 000 lx[40 μmol/（m2·s）]，置培養(yǎng)箱中定時搖動：5次/d。無菌臺依次加10、50、100 mg/L硝基苯，各處理組設(shè)3個平行樣，分別在0、24、48、72、96、120 h時取樣測定各生理指標(biāo)。

1.2 測定項(xiàng)目和方法

1.2.1 硝基苯處理對藻細(xì)胞生長的影響 從轉(zhuǎn)接藻種開始用紫外分光光度計(jì)測定吸光度，每隔24 h測定經(jīng)硝基苯處理的藻液的吸光度，連續(xù)測定5 d，取3個平行樣的平均值。

1.2.2 可溶性蛋白含量的測定 取5 mL樣品離心后，加去離子水2 mL超聲波破碎，4 ℃離心上清液待測?？扇苄缘鞍缀康臏y定采用考馬斯亮藍(lán) G-250 法并參照Bradford等的方法[12-13]。

1.2.3 可溶性糖含量的測定 可溶性糖含量的測定采用蒽酮比色法。

1.2.4 葉綠素a含量的測定 取一定藻液4 ℃離心后，加入體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇，避光4 ℃下提取24 h，4 ℃離心、轉(zhuǎn)速為8 000 r/min，上清液用紫外分光光度計(jì)測定吸光度。根據(jù)公式Ca=13.95D665 nm-6.88D649 nm;計(jì)算葉綠素的含量[14]。

1.2.5 藻細(xì)胞電導(dǎo)率的測定 取藻液8 mL室溫下5 000 r/min用去離子水洗滌3次，加入16 mL去離子水，室溫避光放置24 h，在20～25 ℃恒溫下，用電導(dǎo)儀測定溶液的電導(dǎo)率。測過電導(dǎo)率后，再放入100 ℃沸水浴中15 min，冷卻后再在20～25 ℃室溫下測定其煮沸電導(dǎo)率，傷害率=處理電導(dǎo)率/煮沸電導(dǎo)率×100%[15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 硝基苯對藻細(xì)胞生長的影響

不同的硝基苯質(zhì)量濃度脅迫漢氏菱形藻的生長動力學(xué)曲線見圖1。低質(zhì)量濃度 10 mg/L 硝基苯處理，對漢氏菱形藻生長抑制作用不明顯;50 mg/L處理在2 d內(nèi)表現(xiàn)輕度的抑制生長，2 d后開始逐漸恢復(fù)生長;而100 mg/L硝基苯脅迫對漢氏菱形藻生長抑制顯著。5 d 后藻液由深黃色轉(zhuǎn)變?yōu)闇\黃色后接近透明現(xiàn)象，具體情況見圖2。與對照相比藻液顏色變化效果很明顯，硝基苯對漢氏菱形藻生長的影響呈現(xiàn)較為明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系，與萊茵衣藻影響結(jié)果一致[15]，不同的是50 mg/L硝基苯脅迫下，漢氏菱形藻2 d后逐漸恢復(fù)生長，而萊茵衣藻需要4 d后才能逐步恢復(fù)生長，在相同脅迫條件下漢氏菱形藻表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐受性。

2.2 硝基苯對可溶性糖含量的影響

由圖3可知，硝基苯處理使得漢氏菱形藻的可溶糖含量在2 d下降到最低點(diǎn)，之后藻細(xì)胞內(nèi)可溶性糖含量隨硝基苯質(zhì)量濃度升高呈現(xiàn)梯度升高現(xiàn)象?？赡苁菨h氏菱形藻的自身物質(zhì)被降解成可溶性糖從而緩解了對藻細(xì)胞的傷害。在試驗(yàn)處理組內(nèi)，藻細(xì)胞可溶性糖含量增加越迅速硝基苯質(zhì)量濃度越高，5 d時，50、100 mg/L質(zhì)量濃度處理組高于對照，10 mg/L質(zhì)量濃度處理組低于對照?？赡苁?0、100 mg/L質(zhì)量濃度硝基苯脅迫下，藻細(xì)胞為應(yīng)對不利環(huán)境分解自身物質(zhì)應(yīng)對，而10 mg/L質(zhì)量濃度脅迫下，藻細(xì)胞質(zhì)量濃度弱于對照且受傷害程度較弱，因此藻細(xì)胞分解自身糖類物質(zhì)較少。

2.3 硝基苯對可溶性蛋白含量的影響

由圖4可知，在1 d時，10、50、100 mg/L的硝基苯處理組均呈現(xiàn)最低的可溶性蛋白含量，依次是對照含量的63.7%、71.7%、93.6%，而且在1～3 d呈現(xiàn)出明顯的回升趨勢。3 d后10 mg/L硝基苯處理與對照相比無明顯差異。10、50 mg/L質(zhì)量濃度處理組與對照在4 d后，樣品可溶性蛋白含量處于穩(wěn)定狀態(tài)，100 mg/L質(zhì)量濃度處理有上升趨勢，說明藻細(xì)胞逐漸適應(yīng)環(huán)境脅迫。

2.4 硝基苯對葉綠素a含量的影響

由圖5可知，質(zhì)量濃度為10 mg/L硝基苯處理對漢氏菱形藻葉綠素a含量有促進(jìn)作用;50 mg/L硝基苯在處理2 d之前有抑制作用，處理3 d后藻細(xì)胞葉綠素a含量有增加趨勢;而100 mg/L硝基苯對漢氏菱形藻葉綠素a含量抑制作用比較明顯且沒有恢復(fù)的跡象，與漢氏菱形藻呈現(xiàn)淺黃色生長現(xiàn)象相吻合。

2.5 硝基苯對藻細(xì)胞的電導(dǎo)率情況

在正常情況下，生物細(xì)胞膜對物質(zhì)具有選擇性透過能力，當(dāng)處于硝基苯脅迫條件下，漢氏菱形藻的藻細(xì)胞膜受到破壞，膜通透性變大，導(dǎo)致胞內(nèi)細(xì)胞質(zhì)外滲，所以直接表現(xiàn)在細(xì)胞浸提液的導(dǎo)電率增強(qiáng)，細(xì)胞浸提液導(dǎo)電率增大與膜通透性增大密切相關(guān)，而膜通透性程度增加與環(huán)境脅迫強(qiáng)度有直接關(guān)系。由圖6可知，漢氏菱形藻細(xì)胞經(jīng)過處理后，各處

理組與對照相比，隨硝基苯的質(zhì)量濃度增大，對藻類的傷害率呈現(xiàn)梯度上升。10 mg/L硝基苯處理，3 d 時藻細(xì)胞基本恢復(fù)正常狀態(tài);50 mg/L硝基苯處理3 d后逐漸恢復(fù)，到處理后5 d時基本上恢復(fù)到正常狀態(tài);而100 mg/L硝基苯處理，對漢氏菱形藻藻細(xì)胞的傷害是不能恢復(fù)的，與前面的生長影響情況測定得出的情況一致。

3 討論

漢氏菱形藻生理特性對硝基苯脅迫的響應(yīng)與脅迫質(zhì)量濃度密切相關(guān)。10 mg/L硝基苯對漢氏菱形藻的生長無明顯影響，而100 mg/L硝基苯則對漢氏菱形藻生理生長有明顯的抑制效應(yīng)，直至導(dǎo)致藻細(xì)胞死亡。雖然自然界水體環(huán)境中的硝基苯濃度通常較低，但藻細(xì)胞暴露于100 mg/L硝基苯質(zhì)量濃度下還是完全有可能的[16-17]。因?yàn)橄趸奖粡V泛應(yīng)用，世界各地主要河流水系中普遍存在污染物硝基苯[18-21]，而當(dāng)硝基苯污染事件爆發(fā)時，在小環(huán)境內(nèi)，硝基苯的污染往往高出100 mg/L，藻類可能遭受更高濃度的硝基苯脅迫，從而被抑制生長，進(jìn)一步影響淡水生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性。

本研究顯示，10 mg/L硝基苯脅迫下對漢氏菱形藻吸光度幾乎沒有抑制作用，而100 mg/L硝基苯質(zhì)量濃度下6 d后顯微鏡很難檢測到有活的藻細(xì)胞，與對萊茵衣藻的研究結(jié)果相似。通過50 mg/L質(zhì)量濃度硝基苯處理發(fā)現(xiàn)，處于脅迫環(huán)境下漢氏菱形藻藻細(xì)胞通過自身釋放可溶性糖、可溶性蛋白等有機(jī)物的應(yīng)激反應(yīng)適應(yīng)環(huán)境。漢氏菱形藻的可溶性糖含量下降表明，高質(zhì)量濃度硝基苯脅迫下能夠影響藻類的能量代謝與利用，并且高質(zhì)量濃度脅迫下可能導(dǎo)致漢氏菱形藻藻細(xì)胞葉綠素a含量降低進(jìn)而影響光合作用的性能[15]。

硝基苯對漢氏菱形藻的脅迫研究發(fā)現(xiàn)，在處理48 h內(nèi)可能由于環(huán)境脅迫的原因，藻細(xì)胞對培養(yǎng)基營養(yǎng)物質(zhì)利用較低，表現(xiàn)出漢氏菱形藻藻細(xì)胞轉(zhuǎn)接培養(yǎng)48 h內(nèi)自身的可溶性糖含量一直在減少。在 48 h 時處理組與對照組相比，漢氏菱形藻可溶性糖含量分別是對照組的81.82%、67.93%、62.64%。而再持續(xù)培養(yǎng)48 h后，尤其在3 d后藻細(xì)胞的可溶性糖含量回升最快，說明漢氏菱形藻對100 mg/L硝基苯含量以下脅迫條件下，48 h是其逐步恢復(fù)生理生長的臨界點(diǎn)。4 d后可溶性糖含量回升到 170 mg/L 左右并逐漸趨于穩(wěn)定，表明藻細(xì)胞適應(yīng)后能利用培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)并有效地進(jìn)行物質(zhì)如糖類的合成。可能是藻細(xì)胞生長后期細(xì)胞吸收培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)的能力下降，另一因素可能是培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)被逐步利用減少而受限制。漢氏菱形藻和萊茵衣藻在硝基苯脅迫的逆境條件下[15]，漢氏菱形藻表現(xiàn)出較強(qiáng)較快的適應(yīng)能力，100 mg/L硝基苯脅迫條件下，萊茵衣藻逐步快速死亡，6 d時幾乎檢測不到存活的藻細(xì)胞，而漢氏菱形藻通過分解自身細(xì)胞質(zhì)如可溶性糖、可溶性蛋白被動適應(yīng)逆境脅迫，2 d后可以逐步恢復(fù)生理生長。研究還表明，24 h內(nèi)低、中、高質(zhì)量濃度硝基苯脅迫下漢氏菱形藻細(xì)胞可溶性蛋白質(zhì)含量與對照相比明顯下降，而3 d后各質(zhì)量濃度處理組基本上恢復(fù)穩(wěn)定狀態(tài)?？扇苄缘鞍着c可溶性糖均是藻細(xì)胞內(nèi)主要的細(xì)胞質(zhì)，在硝基苯脅迫下，漢氏菱形藻通過自身物質(zhì)分泌出可溶性蛋白到細(xì)胞外起到很好緩沖與保護(hù)作用，如果脅迫環(huán)境進(jìn)一步增強(qiáng)，由于藻細(xì)胞分泌蛋白達(dá)到極限會直接影響藻細(xì)胞的生理功能，就會使?jié)h氏菱形藻生長受阻直至因細(xì)胞破損死亡。漢氏菱形藻光合作用場所在葉綠體上，光合色素是物質(zhì)基礎(chǔ)。研究表明，漢氏菱形藻對不同質(zhì)量濃度硝基苯脅迫，光合色素中葉綠素a含量有不同的響應(yīng)。較高質(zhì)量濃度硝基苯脅迫下光合色素含量明顯降低，可能是細(xì)胞膜系統(tǒng)功能在硝基苯脅迫下遭到破壞，有研究表明25 mg/L硝基苯可以傷害植物膜系統(tǒng)[9]，也可能是硝基苯上的硝基官能團(tuán)與葉綠體捕光復(fù)合體系中的蛋白質(zhì)結(jié)合[22]，導(dǎo)致漢氏菱形藻的葉綠體中捕光復(fù)合體受抑制，使其葉綠素a含量降低，光合作用能力下降，從而影響漢氏菱形藻光合色素含量，與纖細(xì)裸藻、萊茵衣藻影響有相似性[23]。藻細(xì)胞光合色素含量與藻細(xì)胞生長中的吸光度也呈現(xiàn)較好的一致性。本研究表明，硝基苯對藻類的毒性可能主要是先通過分解自身的可溶性糖類、蛋白質(zhì)減輕毒害，當(dāng)硝基苯質(zhì)量濃度較高時，藻類自身通過分解較多自身物質(zhì)以及部分細(xì)胞器中的蛋白質(zhì)變性，從而失去繼續(xù)生長的可能。

高質(zhì)量濃度的硝基苯使?jié)h氏菱形藻細(xì)胞膜受到的損傷加劇，其選擇透過性增大導(dǎo)致細(xì)胞的電解質(zhì)外泄加劇，致使其傷害率上升，以至于在測試時間內(nèi)細(xì)胞沒有恢復(fù)正常的生理跡象。

4 結(jié)論

（1）漢氏菱形藻暴露在質(zhì)量濃度為100 mg/L硝基苯環(huán)境下1～6 d內(nèi)，對藻細(xì)胞的傷害是很難恢復(fù)的，即導(dǎo)致細(xì)胞死亡。（2）硝基苯質(zhì)量濃度為10、50 mg/L時，處理后1 d漢氏菱形藻的可溶性蛋白含量降至最低點(diǎn)，2 d時的可溶性糖含量降到最低點(diǎn)，之后恢復(fù)到穩(wěn)定值，這種變化趨勢反映了漢氏菱形藻對硝基苯脅迫下的響應(yīng)機(jī)制。（3）通過對硝基苯脅迫下漢氏菱形藻細(xì)胞生長、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、葉綠素a含量、電導(dǎo)率等生理生化響應(yīng)模式研究，結(jié)果表明10、50 mg/L硝基苯脅迫下影響漢氏菱形藻細(xì)胞的正常生理態(tài)勢，經(jīng)響應(yīng)后可以逐步恢復(fù)到正常生理生長狀態(tài)，而100 mg/L硝基苯脅迫下，對藻細(xì)胞的傷害是難以恢復(fù)的。

參考文獻(xiàn)：

[1]Hankenson K，Schaeffer D J. Microtox assay of trinitrotoluene，diaminonitrotoluene，and dinitromethylaniline mixtures[J]. Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology，1991，46（4）：550-553.

[2]Cai Z Q，F(xiàn)u J，Du P H，et al. Reduction of nitrobenzene in aqueous and soil phases using carboxymethyl cellulose stabilized zero-valent Iron nanoparticles[J]. Chemical Engineering Journal，2018，332：227-236.

[3]Wang C，F(xiàn)eng Y J，Zhao S，et al. A dynamic contaminant fate model of organic compound：a case study of nitrobenzene pollution in Songhua River，China[J]. Chemosphere，2012，88（1）：69-76.

[4]Zhu L Y，Ma B L，Lei Z，et al. The study of distribution and fate of nitrobenzene in a water/sediment microcosm[J]. Chemosphere，2007，69（10）：1579-1585.

[5]Holder J W. Nitrobenzene carcinogenicity in animals and human hazard evaluation[J]. Toxicology and Industrial Health，1999，15（5）：445-457.

[6]Beauchamp R O，Richard D I，Douglas E R，et al. A critical review of the literature on nitrobenzene toxicity[J]. CRC Critical Reviews in Toxicology，1982，11（1）：33-84.

[7]Fletcher J S，Mcfarlane J C，Pfleeger T，et al. Influence of root exposure concentration on the fate of nitrobenzene in soybean[J]. Chemosphere，1990，20（5）：513-523.

[8]劉 宛，李培軍，周啟星，等. 氯苯類脅迫對蠶豆幼苗超氧化物歧化物活性的影響[J]. 農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報，2004，23（3）：432-436.

[9]徐應(yīng)明，袁志華，李軍幸，等. 氯苯、硝基苯脅迫對小麥種子萌發(fā)和幼苗生理特性的影響[J]. 灌溉排水學(xué)報，2004，23（5）：6-9.

[10]李秀霞，邵 紅，王 仲，等. 硝基苯脅迫對水稻種子萌發(fā)和幼苗生理特性的影響[J]. 種子，2007，26（2）：39-40.

[11]Dunnivant F M，Schwarzenbach R P，Macalady D L. Reduction of substituted nitrobenzenes in aqueous solutions containing natural organic matter[J]. Environmental Science & Technology，1992，26（11）：2133-2141.

[12]Bradford M M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding[J]. Analytical Biochemistry，1976，72（2）：248-254.

[13]黃文敏，邢 偉，李敦海，等. 外源抗壞血酸對煙草細(xì)胞生長及衰老的影響[J]. 農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報，2006，25（5）：1157-1161.

[14]李合生. 植物生理生化實(shí)驗(yàn)原理和技術(shù)[M]. 北京：高等教育出版社，2000：134-137.

[15]杜慶才，張德祿，王高鴻，等. 萊茵衣藻生長和光合作用對硝基苯的響應(yīng)[J]. 西北師范大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2007，43（3）：71-74.

[16]仲建強(qiáng)，張?zhí)m英，孫立波，等. 模擬地下水原位修復(fù)高濃度硝基苯污染的研究[J]. 農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報，2007，26（3）：920-924.

[17]盧桂蘭，郭觀林，王世杰，等. 水體中硝基苯厭氧降解微生物的篩選及其降解特性研究[J]. 農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報，2010，29（3）：556-562.

[18]Yurawecz M P，Bart J P. Identification of chlorinated nitrobenzene residues in Mississippi river fish[J]. Journal of AOAC International，1983，66（6）：1345-1352.

[19]Yamagishi T，Miyazaki T，Horii S，et al. Identification of musk xylene and musk ketone in freshwater fish collected from the Tama River，Tokyo[J]. Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology，1981，26（5）：656-662.

[20]Noordsij A，Puyker L M，Gaag M D. The quality of drinking water prepared from bank-filtered river water in the Netherlands[J]. Science of the Total Environment，1985，47：273-292.

[21]He M C，Yan S，Li X R，et al. Distribution patterns of nitrobenzenes and polychlorinated biphenyls in water，suspended particulate matter and sediment from mid- and down-stream of the Yellow River （China）[J]. Chemosphere，2006，65（3）：365-374.

[22]劉碧云，周培疆，李佳潔，等. 丙體六六六對斜生柵藻生長及光合色素和膜脂過氧化影響的研究[J]. 農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報，2006，25（1）：204-207.

[23]陸光華，趙元慧，湯 潔，等. 綠藻對硝基苯類化合物的富集與釋放研究[J]. 環(huán)境科學(xué)研究，2001，14（3）：4-5.