低溫脅迫下甘草對尖吻鱸幼魚血清和肝臟免疫酶及鰓Na+-K+-ATP酶活性的影響

陳旭，王一福，周勝杰，于剛，楊蕊，馬振華*

(1. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所，熱帶水產(chǎn)研究開發(fā)中心；2. 三亞熱帶水產(chǎn)研究院: 海南 三亞 572018； 3. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南海漁業(yè)資源開發(fā)利用重點實驗室，廣東 廣州 510300)

尖吻鱸(Latescalcarifer)俗稱盲曹、金目鱸、紅目鱸等[1]。尖吻鱸為中國南方廣泛養(yǎng)殖的魚種，具有繁殖力強、生長速度快、生產(chǎn)操作管理相對容易、對飼料選擇性低和對于高密度養(yǎng)殖環(huán)境耐受力強等優(yōu)點。隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)高密度養(yǎng)殖規(guī)模日益擴大以及未處理的工業(yè)、生活污水的排放，養(yǎng)殖生態(tài)環(huán)境遭到破壞，致使養(yǎng)殖病害頻繁發(fā)生。目前主要依靠抗菌藥來控制水產(chǎn)養(yǎng)殖動物疾病的發(fā)生，不僅使細菌耐藥性增加，還導(dǎo)致抗菌藥在生物體內(nèi)殘留。長期攝入含有抗菌藥殘留的食品，會對人體產(chǎn)生危害[2]。經(jīng)研究，人類常見的癌癥、畸形及部分慢性病的發(fā)生與食品中的抗生素、激素的使用和藥物殘留有關(guān)[3]。

甘草(GlycyrrhizauralensisFisch.)為多年生豆科草本植物，是常用中藥，主要功效為補脾益氣、清熱解毒、和中緩急及調(diào)和諸藥等，被譽為“眾藥之王”。其有效成分主要包括甘草黃酮、甘草酸、甘草次酸和甘草多糖等化合物[4]。中草藥具有藥用價值高、功能顯著和副作用小等優(yōu)點，在魚類的細菌性疾病、真菌性疾病、寄生蟲病以及病毒性疾病等方面取得了一定的成果[5]。甘草具有保護肝細胞、抗炎、抗氧化、抗病毒、抗腫瘤以及免疫調(diào)節(jié)等多種藥理作用和生物學(xué)功能[6-10]。研究表明，甘草具有增強新陳代謝和增加營養(yǎng)吸收的作用，并可以改變飼料口味，增強動物食欲[11]。甘草中的黃酮類化合物甘草素、甘草甲苷(Шa)及甘草乙苷(Шb)對DPPH自由基的平均清除率分別為51.56%、44.85%和34.53%[12]。甘草黃酮對小鼠DPPH自由基清除率為25.00%，對超氧陰離子自由基清除率為79.07%，對羥基自由基清除率為29.51%[13]。有研究表明：飼料中添加4.5%的甘草提取物可改善卡拉庫爾羊(Karakul sheep)的血液免疫球蛋白和抗氧化狀態(tài)[14],甘草酸苷(LTG)顯著阻止成年斑馬魚(DanioRerio)高血糖的發(fā)生[15]；甘草粗提物明顯提高鯽(Carassiusauratus)的抗應(yīng)激能力，并能增強魚體對細菌的抵抗力[16]；亞硝酸鹽脅迫下，飼料中添加發(fā)酵甘草能夠提高肝臟的谷胱甘肽過氧化物酶活性、丙二醛含量和總抗氧化能力[17]等指標。

養(yǎng)殖過程中，由于自然界存在季節(jié)更替、氣候變化等環(huán)境的改變，魚類生活的環(huán)境溫度經(jīng)常出現(xiàn)節(jié)律性或突發(fā)性的變動，且魚苗運輸過程中常采用低溫?；罘ㄟM行運輸。水環(huán)境溫度突發(fā)性的變化會導(dǎo)致魚類生理功能失調(diào)、機體損傷甚至死亡[18-20]。因此，本試驗通過在飼料中添加不同水平的甘草投喂尖吻鱸幼魚(56 d)的方式，探究在溫度脅迫下，甘草對尖吻鱸幼魚血清和肝臟免疫酶以及鰓Na+-K+-ATP酶活性的影響，為尖吻鱸的人工養(yǎng)殖和運輸提供重要的理論依據(jù)。

1 試驗材料與方法

1.1 試驗用魚與試劑

試驗用尖吻鱸幼魚于2019年8月由南海水產(chǎn)研究所熱帶水產(chǎn)研究開發(fā)中心(海南省陵水縣)自行培養(yǎng)，在飼料中添加不同水平的甘草投喂56 d。脅迫試驗用魚平均體長為(9.42±2.37)cm，平均體質(zhì)量為(14.73±3.05)g。

試驗測量試劑購自上海醫(yī)療器械股份有限公司，藥液隨用隨配。測定過氧化氫酶(CAT)、總超氧化物歧化酶(T-SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)、溶菌酶(LZM)、總抗氧化能力(T-AOC)、過氧化物酶(POD)和超微量Na+-K+-ATP酶所用試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.2 飼養(yǎng)飼料的配制

尖吻鱸幼魚飼養(yǎng)飼料中甘草粉的添加量分別為0、10、30和50 g/kg。飼養(yǎng)飼料自行制作，嚴格把控質(zhì)量。其中，甘草粉購自亳州市德永堂生物科技有限公司(不含添加劑)。飼料原料粉混勻后加40%自來水攪拌均勻，制成粒徑為3.0 mm的顆粒，曬干后置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。配方見?。

表1 飼料配方及成分表Tab.1 Feed formula and ingredient list %

1.3 試驗方法

采用單因子濃度梯度法，在基礎(chǔ)飼料中分別添加0、10、30和50 g/kg，以不添加甘草的基礎(chǔ)飼料組為對照組。將試驗用尖吻鱸幼魚分成4組，每組3個重復(fù)，每桶放幼魚40尾，共480尾。在室外玻璃纖維桶(500 L)進行養(yǎng)殖，每天分2次(08∶00和17∶00)進行飽食投料，視水質(zhì)情況進行換水并定期吸污(每隔5天)。飼養(yǎng)期為56 d，期間不進行水體消毒和藥物投喂。養(yǎng)殖結(jié)束后，每桶選取體質(zhì)健康、體表無傷、活力強且規(guī)格相近的15尾尖吻鱸幼魚，相應(yīng)移入室內(nèi)塑料桶(100 L)進行低溫(18 ℃)脅迫試驗。每桶試驗水體積約為40 L。每個塑料桶都有一個塑料網(wǎng)蓋，以防止幼魚跳出。溫度由冷水機(HXLS3000，大連匯新鈦設(shè)備開發(fā)有限公司)控溫，不間斷充氣，低溫脅迫時長為24 h。試驗用水為經(jīng)過砂濾的自然海水，主要水質(zhì)指標如下：pH 7.5、氨氮<0.01 mg/L、亞硝酸鹽<0.02 mg/L。

低溫脅迫試驗結(jié)束后，進行斷尾取血，并取肝臟和鰓部位，制成血清和組織勻漿后，放入-80 ℃凍存?zhèn)溆谩悠贩治銮坝? ℃冰箱中解凍，在勻漿器中勻漿，并用0.02 mol/L pH 7.5磷酸緩沖液稀釋10倍制成勻漿液。在4 ℃下，5 000 r/min離心10 min，取上清液按照試劑盒所提供的方法進行酶指標的測定。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

試驗數(shù)據(jù)利用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析并進行單因素方差分析(one-Way ANOVA)，各試驗組間存在差異用Duncan’s多重比較，當P<0.05時為差異顯著，結(jié)果用平均值±標準差(Mean ± SD) 表示，并利用Microsoft Office Excel 2016軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫脅迫下甘草對尖吻鱸幼魚血清和肝臟免疫酶的影響

表2 低溫脅迫下甘草對尖吻鱸幼魚血清免疫酶的影響Tab.2 Effect of Glycyrrhiza uralensis on serum immune enzymes of Asian seabass larvae under low temperature stress

表3 低溫脅迫下甘草對尖吻鱸幼魚肝臟免疫酶的影響Tab.3 Effects of Glycyrrhiza uralensis on liver immune enzymes of Asian seabass larvae under low temperature stress

表2中，低溫脅迫下，甘草含量3%組和5%組組間尖吻鱸幼魚血清CAT活性差異不顯著，均顯著高于對照組和1%組，1%組顯著低于對照組(P<0.05)；5%甘草對尖吻鱸魚幼魚血清T-SOD活性和T-AOC影響一致，組血清T-SOD活性最高，均顯著高于其它各組(P<0.05)，且其它各組組間差異均不顯著；低溫脅迫下，尖吻鱸幼魚血清MDA含量和GSH-PX活性在試驗過程中差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；尖吻鱸幼魚各試驗組血清LZM含量顯著高于對照組(P<0.05)，1%組和5%組組間LZM含量差異均不顯著，均顯著高于3%組。

由表3可知，低溫脅迫下，尖吻鱸幼魚肝臟CAT和POD活性在試驗過程中差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；各試驗組組間肝臟T-SOD活性差異均不顯著，均顯著高于對照組(P<0.05)；3%和5%組組間肝臟MDA含量差異不顯著，均顯著低于1%組和對照組(P<0.05)，且1%組和對照組組間MDA含量差異不顯著；5%組肝臟GSH-PX活性最高，與1%和3%組相比差異不顯著，顯著高于對照組(P<0.05)，對照組、1%和3%組組間差異均不顯著；1%組肝臟T-AOC最高，均顯著高于其它各組(P<0.05)，其它各組組間差異均不顯著。這些數(shù)據(jù)表明，在低溫脅迫下，飼養(yǎng)含有甘草的飼料能夠提高尖吻鱸幼魚血清和肝臟免疫力，抑制低溫脅迫對吻鱸幼魚造成的免疫應(yīng)激反應(yīng)。

2.2 低溫脅迫下甘草對尖吻鱸幼魚鰓Na+-K+-ATP酶活性的影響

低溫脅迫下甘草對尖吻鱸鰓Na+-K+-ATP酶活性的影響見圖1。如圖1所示，溫度脅迫下，各試驗組鰓Na+-K+-ATP酶活性均顯著低于對照組(P<0.05)；1%組與5%組差異不顯著，均顯著低于0%組(P<0.05)。

3 討論

研究證明，甘草及其生物活性成分對人類、動物及水生生物等的免疫系統(tǒng)起到一定的調(diào)節(jié)作用[21-25]。本研究選取具有代表性的免疫酶如：過氧化氫酶(CAT)、總超氧化物歧化酶(T-SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)、溶菌酶(LZM)、總抗氧化能力(T-AOC)、過氧化物酶(POD)以及Na+-K+-ATP酶，這些酶類在識別和消除異物、提高吞噬細胞的吞噬能力、促進機體代謝、提高機體免疫力和抗氧化能力等方面起重要作用，可以通過其變化分析低溫脅迫下不同水平的甘草含量對尖吻鱸魚幼免疫力以及鰓Na+-K+-ATP酶活性的影響。

3.1 低溫脅迫下甘草對尖吻鱸幼魚血清和肝臟免疫酶的影響

已有研究發(fā)現(xiàn)：日糧中加入甘草可顯著提高黃鱸(Percaflavescens)血清超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶、過氧化氫酶和溶菌酶活性[26]；甘草對施氏鱘(Acipenserschrencki)部分免疫器官中溶菌酶活性均有一定提高和促進作用[27]；飼料中添加甘草甜素投喂點帶石斑魚(Epinephelusmalabaricus)，投喂甘草甜素7 d，350 mg/kg和500 mg/kg組的血清LZM以及投喂甘草甜素14 d，50 mg/kg組的LZM活力均顯著升高[28]；對鯽腹注甘草粗提物，低劑量組血清溶菌酶活性無明顯變化，僅在第14天顯著高于對照組，高劑量組從第7天開始每次均顯著高于對照組[29]；5 μg/mL和10 μg/mL的甘草次酸能顯著促進建鯉(CyprinuscarpiovarJian)肝臟中SOD、GPX活性水平的恢復(fù)、同時極顯著抑制MDA合成[30]；飼料中添加甘草次酸養(yǎng)殖8周后，在斑點叉尾鮰(Ictaluruspunctatus)腹腔注射大腸桿菌脂多糖(LPS)，24 h后顯著提高了肝臟SOD和CAT水平，并顯著降低MDA含量[31]，以上研究結(jié)果與本試驗類似。本試驗中，飼料中添加甘草養(yǎng)殖56 d后，對尖吻鱸幼魚進行24 h的低溫(18 ℃)脅迫。結(jié)果顯示，低溫脅迫下，不同水平含量的甘草對尖吻鱸幼魚血清MDA含量、GSH-PX和肝臟CAT、POD活性的影響在試驗過程中無統(tǒng)計學(xué)差異；血清T-SOD、T-AOC、LZM和肝臟T-SOD、GSH-PX、T-AOC均有不同程度的升高，較高甘草含量(3%組和5%組)顯著抑制肝臟MDA活性。這說明，投喂尖吻鱸幼魚56 d后，低溫脅迫下，甘草能夠提高魚體免疫力，抑制低溫脅迫的免疫應(yīng)激。不同的是，低溫脅迫下，血清CAT活性隨著甘草含量的增加先降低后升高。可能的原因是由于投喂添加甘草含量1%的尖吻鱸幼魚受到低溫刺激時，產(chǎn)生了大量過氧化氫，而機體為清除這些過氧化氫，消耗了血清中大量過氧化氫酶，致使血清過氧化氫酶活性降低。而飼料中甘草含量較高(3%和5%)，尖吻鱸幼魚受到低溫脅迫時，機體應(yīng)激機制作出反應(yīng)，導(dǎo)致血清過氧化氫酶升高，以增強機體對氧自由基和過氧化氫等物質(zhì)的清除能力。

3.2 低溫脅迫下甘草對尖吻鱸幼魚鰓Na+-K+-ATP酶活性的影響

鰓是魚類呼吸、氨氮排泄及滲透調(diào)節(jié)的主要部位，是鰓組織泌氯細胞及細胞器的膜上存在的一種蛋白酶，在魚體滲透調(diào)節(jié)過程中起著非常重要的作用[32-33]。研究表明，使用添加甘草次酸的飼料飼喂團頭魴幼魚(Megalobramaamblycephala)56 d后，腸道Na+-K+-ATP酶活性無顯著差異[34]；將草魚(Ctenopharyngodonidellus)浸泡于氯氰菊酯中，對草魚鰓組織Na+-K+-ATP酶活性影響與對照相比無顯著差異[35]；使用添加了α-酮戊二酸的飼料投喂養(yǎng)于氨氮濃度為18.37 mg/L水體中的草魚42 d后，對鰓Na+-K+-ATP酶活性均無顯著差異[36]；飼料中添加喹乙醇飼喂鯉60 d后，鰓Na+-K+-ATP酶活性隨喹乙醇劑量的升高而呈逐漸下降的趨勢[37]；甲氰菊酯對鯉亞急性毒性試驗中，甲氰菊酯的質(zhì)量濃度越高，對鰓Na+-K+-ATP 酶活性的影響越大，隨著時間的延長，其總體變化呈先下降后上升的趨勢[38]；90 d的飼養(yǎng)結(jié)果表明，低質(zhì)量濃度鑭暴露時對條紋鋸鮨(Centropristisstriata)鰓Na+-K+-ATP酶呈激活狀態(tài)，在高質(zhì)量濃度鑭作用下，Na+-K+-ATP酶活性沒有明顯變化[39]；上述幾種試驗結(jié)果存在異同，可能是由于藥物品種、用藥方法、試驗物種及組織器官等不同，對試驗結(jié)果造成差異。本試驗中，低溫脅迫下，鰓Na+-K+-ATP酶活性隨著甘草含量的增加呈先降低后升高的變化趨勢并均顯著低于對照組。其原因可能是，尖吻鱸幼魚受到低溫刺激后，鰓組織器官受到一定程度的氧化損傷，鰓組織泌氯細胞變性，改變了鰓Na+-K+-ATP酶蛋白的構(gòu)象和功能，對鰓Na+-K+-ATP酶活性產(chǎn)生了抑制作用。而飼喂甘草含量較高(5%)的尖吻鱸幼魚受到低溫刺激后，魚體通過自我調(diào)節(jié)表現(xiàn)出較強的適應(yīng)性，通過增加鰓氯細胞的密度和相應(yīng)的Na+-K+-ATP酶活性來維持體內(nèi)的離子平衡，使Na+-K+-ATP酶活性上升。

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)，低溫脅迫下，飼料中添加甘草能顯著提高尖吻鱸幼魚血清CAT活性、T-AOC和LZM含量并且提高肝臟中T-SOD、GSH-PX和T-AOC活性。說明飼料中添加甘草能提高尖吻鱸幼魚免疫力和鰓Na+-K+-ATP酶活性，減少機體組織損傷，從而提高尖吻鱸幼魚在面對突發(fā)性溫度下降時的生存能力。但這些作用機理是否存在其他物質(zhì)的參與和協(xié)調(diào)，遵循何種信號通路，以及如何進行物質(zhì)和能量交換以適應(yīng)不同環(huán)境的要求還需更加深入的研究。