張芹，孔令軍，屈長義，馮建新

(1. 河南省水產(chǎn)科學(xué)研究院， 河南 鄭州 450044； 2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院， 河南 鄭州 450002)

團(tuán)頭魴(Megalobramaamblycephala)含肉率高，肉味鮮美，是中國池塘養(yǎng)殖的主要品種。團(tuán)頭魴自然分布非常狹窄，主要分布在湖北省梁子湖、淤泥湖以及江西省鄱陽湖，目前團(tuán)頭魴選育中基礎(chǔ)群體的原種大部分來源于以上三個湖泊中[1-2]。伊河為黃河支流，歷史上早已有關(guān)于伊河魴的記載?！耙梁郁櫋痹诜诸惿蠈儆隰檶賵F(tuán)頭魴，是近年來選育出來的一個優(yōu)良新品系[3]，梁子湖盛產(chǎn)素有“武昌魚”美稱的團(tuán)頭魴，是人工養(yǎng)殖團(tuán)頭魴苗種的一個主要來源，本研究通過對產(chǎn)于長江流域的梁子湖團(tuán)頭魴和黃河流域的伊河團(tuán)頭魴兩個群體進(jìn)行對比，希望找到兩個群體團(tuán)頭魴之間的差異，為團(tuán)頭魴的選育和伊河團(tuán)頭魴的種質(zhì)保護(hù)提供技術(shù)支持。

同工酶作為重要的分子標(biāo)記物，在遺傳學(xué)、育種學(xué)、生理學(xué)及分類學(xué)等生命科學(xué)學(xué)科中有著廣泛的應(yīng)用[4-5]。同工酶技術(shù)可以從蛋白質(zhì)水平上顯示種質(zhì)資源的遺傳多樣性，通過分析同工酶的不同譜帶，可以鑒定同一物種不同種質(zhì)之間的遺傳差異[6]，也可作為研究不同種質(zhì)之間親緣關(guān)系的一種方法，酶譜越相近，物種親緣關(guān)系也越相近[7]。同工酶在水產(chǎn)動物上主要用來研究親緣關(guān)系、鑒定物種分類，是一種重要的遺傳標(biāo)記[8]，和其他種質(zhì)鑒定技術(shù)相比，同工酶技術(shù)由于不受環(huán)境條件制約，鑒定速度快且相對經(jīng)濟(jì)[6,9]，應(yīng)用較為廣泛。

本研究采用聚丙烯酰胺凝膠電泳的方法對兩個群體團(tuán)頭魴5種組織中的乳酸脫氫酶(LDH)和酯酶(EST)同工酶的表達(dá)進(jìn)行了研究，分析2個群體團(tuán)頭魴之間同工酶酶譜的差異，旨在了解不同組織中2種同工酶表達(dá)的相似性和差異性，篩選出伊河團(tuán)頭魴的特征生化遺傳參數(shù)，為其種質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)的制定和種質(zhì)資源鑒定提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

團(tuán)頭魴群體為池塘養(yǎng)殖群體，伊河團(tuán)頭魴于2016年10月采自河南省嵩縣伊河魴育種中心，共30尾，體重為(823.80±85.74)g，體長為(372.30±19.85)cm；梁子湖團(tuán)頭魴于2016年10月采自湖北省鄂州市國家級團(tuán)頭魴原種場，共30尾，體重為(720.20±74.59)g，體長為(355.00±17.88)cm。

1.2 形態(tài)測定

伊河團(tuán)頭魴形態(tài)的測定按照GB/T 18654.3—2008《養(yǎng)殖魚類種質(zhì)檢驗(yàn)》中的相關(guān)規(guī)定進(jìn)行，用游標(biāo)卡尺(精確度0.1 mm)對樣品進(jìn)行測定。

1.3 組織酶液的制備

隨機(jī)選擇2個群體的團(tuán)頭魴各8尾，尾靜脈采血，4 ℃冰箱保存4 h，析出血清。將實(shí)驗(yàn)魚在水中剪鰓放血后，迅速解剖取眼睛、肌肉、心臟和腎臟等組織，整個實(shí)驗(yàn)過程在冰浴條件下完成，以減少實(shí)驗(yàn)魚的痛苦。取出后的組織用4 ℃生理鹽水洗凈，同析出的血清一起存放于-70 ℃超低溫冰箱中保存。

按1∶10(m/v)的比例加入預(yù)冷的0.2 mol/L (pH 7.4)磷酸鹽緩沖液，冰浴條件下勻漿并分裝于離心管中，每個離心管中加入0.8 mL 組織勻漿液，0.4 mL 氯仿，振蕩混勻。離心(4 ℃，5 000 r/min)5 min，取上清液分裝后放于-70 ℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆?。電泳時，將上清液和染色劑按照5∶1(V/V)的比例混勻上樣，制備好的血清可直接和染色劑按照5∶1的比例混勻后使用。

1.4 電泳和染色

采用聚丙烯酰胺垂直板電泳技術(shù)[10]進(jìn)行同工酶電泳，先對2個群體團(tuán)頭魴不同組織的乳酸脫氫酶(LDH)和酯酶(EST)進(jìn)行電泳，比較不同群體間同工酶酶譜的差異，然后選擇酶帶清晰的眼睛組織和血清進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)，分析2個群體團(tuán)頭魴內(nèi)部個體間的差異。分離膠濃度7%，濃縮膠濃度4%，采用Tris-檸檬酸凝膠緩沖系統(tǒng)，200 V電泳2～3 h。LDH采用NAD染色法[11]， EST采用乙酸萘酯染色法[12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 伊河團(tuán)頭魴的形態(tài)特征

伊河團(tuán)頭魴體高而側(cè)扁，呈菱形。頭小，吻鈍圓，口端位，口裂較寬，上下頜角度小。頭后背部顯著隆起。無須。眼中等大，位于頭部的前側(cè)部。上、下頜角質(zhì)薄而窄，上頜角質(zhì)呈三角形。上眶骨略呈三角形。背鰭不分枝鰭條為硬刺，最后一枚不分枝鰭條粗壯，其長度一般短于頭長。胸鰭較短，不至或僅達(dá)腹鰭基部。腹部自腹鰭至肛門間有皮質(zhì)棱。尾柄短，尾柄高大于尾柄長。體呈青灰色，體側(cè)鱗片基部淺色，兩側(cè)灰黑色，在體側(cè)形成數(shù)行淺色縱紋。實(shí)驗(yàn)所用伊河團(tuán)頭魴的基本性狀比例值見表1。

表1 伊河團(tuán)頭魴實(shí)驗(yàn)組可量性狀測定結(jié)果Tab.1 Determination of measurable traits for Megalobrama amblycephala samples from Yi River n=30

2.2 乳酸脫氫酶同工酶在2個群體團(tuán)頭魴不同組織中的表達(dá)

乳酸脫氫酶同工酶在2個群體團(tuán)頭魴的眼睛、肌肉、心臟、腎臟和血清等組織中共檢測出6條酶帶(圖1)。伊河團(tuán)頭魴群體在腎臟組織中檢測出6條帶，眼睛和心臟組織中檢測出5條帶，肌肉組織和血清中檢測出4條帶。梁子湖團(tuán)頭魴群體在腎臟組織中檢測出6條帶，眼睛、肌肉和心臟組織中檢測出5條帶，血清中檢測出4條帶。2個群體乳酸脫氫酶同工酶表達(dá)相同的地方：在眼睛組織中都檢測出5條帶，并且5條帶的亮度基本相同，酶活性相同；在心臟組織中檢測出5條帶，其中LDH2和LDH3活性高，條帶較亮；在腎臟組織中均檢測出6條帶，其中LDH1為其他組織中未檢測到的，LDH2和LDH6條帶亮，酶活性較高；血清中檢測出4條帶，LDH5和LDH6條帶亮，活性高，但血清的酶活性整體低于其他幾個組織中酶的活性。2個群體同工酶表達(dá)不同的地方：在肌肉組織中梁子湖群體檢測出5條酶帶，伊河群體檢測出4條帶，伊河群體缺少LDH2條帶。LDH同工酶在眼睛組織中5條酶帶清晰可辨，各條帶亮度差異不大，因此選擇眼睛組織做進(jìn)一步的分析。

2.3 酯酶同工酶在2個群體團(tuán)頭魴不同組織中的表達(dá)

酯酶同工酶在2個群體團(tuán)頭魴的眼睛、肌肉、心臟、腎臟和血清等組織中共檢測出4條酶帶(圖2)。伊河團(tuán)頭魴群體在眼睛、肌肉、心臟和腎臟組織中檢測中2條帶，分別為EST1和EST4，其中腎臟組織中EST1和EST4條帶亮度較高，酶的活性較高，而其他三個組織中EST同工酶活性較弱；血清中也檢測出2條酶帶，其中EST2沒有出現(xiàn)在其他組織中，EST1條帶亮度高，酶活性強(qiáng)。梁子湖團(tuán)頭魴群體在眼睛、肌肉、心臟和腎臟組織中檢測出2條帶，分別為EST1和EST4，其中腎臟組織中EST1和EST4條帶亮度較高，酶的活性較高，而其他3個組織中EST同工酶活性較弱；血清中也檢測出2條酶帶，其獨(dú)有的EST3沒有出現(xiàn)在其他組織中，EST1條帶亮度高，酶活性強(qiáng)。2個群體EST同工酶表達(dá)相同的地方：在眼睛、肌肉、心臟、腎臟和血清等組織中的均檢測出2條酶帶。血清中的EST1條帶亮度最高。2個群體同工酶表達(dá)不同的地方：伊河群體在血清中檢測出的為EST2，而梁子湖群體檢測出的為EST3，是兩個不同的酶帶。2個群體EST同工酶在血清中表達(dá)有差異，用血清進(jìn)行下一步的同工酶分析。

2.4 乳酸脫氫酶同工酶在2個群體團(tuán)頭魴不同個體中的表達(dá)

LDH同工酶在伊河群體不同個體眼睛組織中的酶譜條帶清晰，個體間差異不大，5號個體LDH6活性略低于其他個體(圖3A)；LDH同工酶在伊河群體不同個體血清中酶活性低(圖3B)，大部分個體LDH3、LDH4條帶不清晰。梁子湖群體不同個體眼睛組織中LDH酶譜條帶清晰，8號個體LDH5活性低于其他個體(圖4A)；梁子湖群體不同個體血清中LDH同工酶個體間存在差異(圖4B)，1號個體和3號個體檢測出5條酶帶，其他個體為4條帶。2個群體LDH同工酶在眼睛組織中均呈現(xiàn)5條清晰的譜帶，而在血清中酶帶不清晰，梁子湖群體LDH在血清中的表達(dá)存在個體差異。

2.5 酯酶同工酶在2個群體團(tuán)頭魴不同個體中的表達(dá)

伊河群體不同個體眼睛組織中均可見EST1和EST4兩條帶，清晰可辨(圖5A)。伊河團(tuán)頭魴不同個體血清中酯酶同工酶檢測出3條帶(圖5B)，EST1酶活性明顯高于EST2和EST3，個體間的差異主要體現(xiàn)在EST2和EST3上。梁子湖團(tuán)頭魴不同個體眼睛組織中酯酶同工酶檢測出2條帶，EST1條帶較亮，酶活性高于伊河團(tuán)頭魴群體的EST1(圖6A)。梁子湖團(tuán)頭魴不同個體血清中酯酶同工酶的酶譜中有EST1和EST2兩條帶，EST1酶活性明顯高于EST2，個體間差異不大(圖6B)。2個群體EST同工酶在眼睛組織中表達(dá)穩(wěn)定，均為兩條帶，在血清中酶帶條數(shù)存在差異，EST2僅出現(xiàn)在伊河群體中，梁子湖群體中未檢出。

3 討論

3.1 同工酶表達(dá)的組織特異性

同工酶是基因表達(dá)的產(chǎn)物，其表達(dá)受到諸多內(nèi)外因素的影響，基因在各組織間的表達(dá)時間和強(qiáng)度上的不一致造成了不同組織同工酶酶譜的特異性[13]。LDH同工酶是糖代謝中是非常重要的一類氧化-還原酶類，LDH-A基因表達(dá)的酶類多在厭氧組織骨骼肌中優(yōu)勢表達(dá)，其功能是將丙酮酸還原為乳酸；LDH-B基因表達(dá)的同工酶多在含氧組織中優(yōu)勢表達(dá)，其功能是將乳酸氧化為丙酮酸[14]。本研究中肌肉組織中的LDH5活性明顯高于其他組織，與葉星等[15]在團(tuán)頭魴中和張濤等[16]在美洲鰣(Alosasapidissima)中的結(jié)果一致。LDH5為LDH-A基因表達(dá)，其主要作用是催化丙酮酸轉(zhuǎn)化為乳酸，在肌肉這類厭氧性器官中含量較高，肌肉組織的主要功能是運(yùn)動，與肌肉組織反應(yīng)活躍的生理功能相一致。心臟組織中LDH1的活性明顯高于其他組織，LDH1主要催化乳酸氧化成丙酮酸進(jìn)入三羧酸循環(huán)，在心臟等好氧器官中含量多活性強(qiáng)，與心臟組織中糖的有氧代謝活躍相一致[17]。

酯酶同工酶能催化酯鍵水解，屬于水解酶類，在酯代謝和生物膜的結(jié)構(gòu)等方面發(fā)揮作用，硬骨魚類中酯酶有單體和二聚體的類型[18]，其是由染色體上不同的基因或共顯性的等位基因譯制的，是直接的基因產(chǎn)物，所以在種屬的鑒定和遺傳研究方面作用重大[19]。本研究中眼睛組織和肌肉組織中都只檢測出EST同工酶的2條酶帶，與葉星等[15]和吳興兵等[20]對團(tuán)頭魴EST同工酶的研究結(jié)果一致。肌肉組織中檢測出2條帶，與余來寧等[21]、歐陽敏等[22]在團(tuán)頭魴肌肉組織中檢測出4條帶的結(jié)果不同，可能是由于不同地域的團(tuán)頭魴群體所導(dǎo)致的差異。血清中EST1的活性最強(qiáng)，明顯大于EST2和EST3，這與歐陽敏等[22]對團(tuán)頭魴EST酶的研究結(jié)果相同。酯酶具有解毒作用，泥鰍血清中酯酶的表達(dá)與其他組織有較大差異[23]，本研究血清EST同工酶在梁子湖群體中檢測出3條帶，在伊河群體中檢測出4條帶，群體間的差異主要表現(xiàn)在血清中，可能與2個群體不同的生態(tài)環(huán)境有關(guān)。

3.2 同工酶表達(dá)的個體差異

同工酶在同一物種不同個體中的表達(dá)也存在差異，張濤等[24]對達(dá)氏鱘(Acipenserdabryanus)的研究中發(fā)現(xiàn)眼睛晶狀體和肌肉組織中出現(xiàn)LDH酶帶差異，在肝臟組織中酶活性存在個體差異。本研究中LDH同工酶在活性和譜帶上出現(xiàn)個體差異，如伊河群體5號個體和梁子湖群體8號個體眼睛組織LDH活性與其他個體有差異，梁子湖群體血清的LDH酶帶與其他個體不同，可能與其個體所處的發(fā)育狀態(tài)和健康狀況有關(guān)。

酯酶同工酶具有明顯的多態(tài)性，在不良環(huán)境的影響下會產(chǎn)生變異，酯酶的表達(dá)會有顯著的變化[25-26]，本研究中伊河群體團(tuán)頭魴有一條獨(dú)有的EST2酶帶，并且出現(xiàn)頻率較高，可能和其獨(dú)特的生存環(huán)境有關(guān)，需要做進(jìn)一步的研究。

3.3 伊河團(tuán)頭魴的生化遺傳標(biāo)記

LDH同工酶在肌肉組織和腎臟組織中有明顯的拖尾現(xiàn)象，可能是采樣過程中造成的污染，如實(shí)驗(yàn)魚前期放血不徹底，導(dǎo)致肌肉取樣時混入血液，對肌肉組織造成污染，以后取樣過程中應(yīng)該嚴(yán)格取樣流程，盡量避免對樣品造成污染；而腎臟組織成分本身比較復(fù)雜，取樣時如果和其他組織分離不徹底，可能會造成污染，腎臟組織不適合作為生化遺傳標(biāo)記使用。國家標(biāo)準(zhǔn)《團(tuán)頭魴》[27]中采用血清LDH作為生化遺傳標(biāo)記，而本研究中在伊河團(tuán)頭魴血清LDH同工酶檢測出多態(tài)性，條帶清晰度不高，不適合作為生化遺傳標(biāo)記使用。心臟組織中的LDH同工酶條帶分離效果較好，但是條帶的清晰程度不如眼睛組織中的LDH同工酶。伊河群體LDH同工酶在眼睛組織中酶帶清晰，表達(dá)更為穩(wěn)定，個體間沒有差異，初步確定用眼睛組織中的LDH同工酶作為鑒定伊河團(tuán)頭魴的備選生化遺傳指標(biāo)。隨機(jī)選擇另外30尾樣本魚進(jìn)行LDH同工酶分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有個體均呈單態(tài)，且酶帶清晰，分離效果好，因此選取眼睛組織中的LDH同工酶作為鑒定伊河團(tuán)頭魴種質(zhì)的生化遺傳標(biāo)記。

4 結(jié)論

本研究通過聚丙烯凝膠電泳對兩個群體團(tuán)頭魴5種組織2種同工酶進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)LDH和EST同工酶在不同組織中均表現(xiàn)出特異性，個體間也存在差異，初步確定了眼睛組織中的LDH同工酶可作為鑒定伊河團(tuán)頭魴種質(zhì)的生化遺傳標(biāo)記。對伊河魴同工酶的研究有利于對該群體開展種質(zhì)鑒定和保護(hù)，研究結(jié)果可為團(tuán)頭魴的育種工作提供參考依據(jù)。