于紅紅，吳明穎，王慶玲，董 娟，盧士玲

（石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆 石河子 832000）

組胺是毒性最強的生物胺，其廣泛存在于多種發(fā)酵食品中，如豆制品、紅酒、奶酪、香腸等，適量的組胺對人體的某些生理功能具有調(diào)節(jié)作用，而過量的組胺攝入會引起食物過敏和食物中毒[1-2]。在發(fā)酵肉制品中，腸細(xì)菌是很主要的產(chǎn)組胺菌種，如陰溝腸桿菌、摩根氏菌、產(chǎn)氣腸桿菌、大腸埃希氏菌和變形桿菌[3]。研究發(fā)現(xiàn)組胺是由組氨酸經(jīng)組氨酸脫羧酶（histidine decarboxylase，HDC）催化脫羧生成，并且這是組胺合成的唯一途徑[4-5]。HDC是氨基酸脫羧酶的一種，其專一性催化L-組氨酸脫羧，從而生成組胺。大量的研究表明，HDC基因主要由hdcA、hdcP、hdcRS、hdcB組成。hdcA基因編碼HDC，hdcP基因編碼轉(zhuǎn)運組氨酸/組胺的蛋白，hdcRS基因編碼氨酰-tRNA合成酶，hdcB基因的功能暫未明確[6-7]。

百里香精油的主要成分為百里香酚和香芹酚，研究表明，百里香精油有較強的抗菌抗氧化作用[8]。但是百里香精油具有刺激性氣味，且在貯存過程中極易揮發(fā)或發(fā)生氧化劣變，這極大限制了百里香精油在食品工業(yè)中的應(yīng)用，微膠囊化技術(shù)是解決這一問題的措施之一。百里香精油經(jīng)過微膠囊化后，壁材可較好地保護芯材中的香氣成分，解決其易揮發(fā)和難保存的問題，可使其長期保持穩(wěn)定的抑菌活性[9]。Hong Jiachi[9]和Comunian[10]等研究發(fā)現(xiàn)植物精油包埋復(fù)合物可以改善食物的品質(zhì)，增強植物提取物的穩(wěn)定性，并使其保持穩(wěn)定的抑菌活性。孟祥儉等[11]制備的緩釋微膠囊對大腸桿菌的生長具有一定的抑制作用，隨著微膠囊濃度的增大，對大腸桿菌的抑制率呈現(xiàn)增長的趨勢。目前，關(guān)于百里香精油微膠囊對腸細(xì)菌中組胺產(chǎn)生影響以及產(chǎn)組胺途徑中相關(guān)基因表達(dá)的研究鮮有報道。

本實驗旨在研究不同百里香精油微膠囊精油質(zhì)量濃度對高產(chǎn)組胺的摩根氏菌和變形桿菌的作用效果和產(chǎn)組胺量，并探究百里香精油微膠囊對產(chǎn)組胺菌HDC基因簇相關(guān)基因表達(dá)水平的影響，為熏馬腸中組胺含量的控制提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 菌株、材料與試劑

摩根氏菌ND（Morganella morganii ND），GenBank登錄號為MN483274；變形桿菌R3（Proteus bacillus R3），GenBank登錄號為MN483275，均為石河子大學(xué)畜產(chǎn)實驗室從熏馬腸中分離篩選。

百里香精油（百里香酚純度≥36%，香芹酚純度≥25%）、β-環(huán)糊精（β-cyclodextrin，β-CD）（純度≥99%） 天津福晨化學(xué)試劑廠；甲醇、乙腈（均為色譜純） 賽默飛世爾科技（中國）有限公司；TRIzol試劑 美國Invitrogen公司；5×All-In-One RT MasterMix cDNA合成試劑盒、EvaGreen 2×qPCR MasterMix-low-ROX加拿大ABM公司；丹磺酰氯、組胺標(biāo)準(zhǔn)品、磷酸吡哆醛、L-組氨酸 美國Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

5417R型高速冷凍離心機 德國Eppendorf儀器公司；Universal Hood 11型凝膠成像系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司；U B-7 型p H 計 德國賽多利斯公司；E O N BagMixer VW多功能酶標(biāo)儀 美國伯騰儀器有限公司；ND2000C微量核酸測定儀 香港基因有限公司；LC-2010AHT型高效液相色譜儀 日本島津公司；MX3000P型實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）儀 美國安捷倫科技公司。

1.3 方法

1.3.1 百里香精油微膠囊的制備及表征分析

1.3.1.1 百里香精油微膠囊的制備

采用飽和水溶液法制備百里香精油微膠囊[12-13]。芯材為百里香精油，壁材為β-CD，準(zhǔn)確稱取β-CD粉末12 g，溶于40 ℃的100 mL去離子水中，攪拌溶解形成β-CD過飽和溶液；量取4 g百里香精油，按無水乙醇與精油體積比1∶1溶解百里香精油；將溶解后的百里香精油勻速逐滴加到β-CD過飽和溶液中，30 ℃下攪拌包埋2 h后取出，待溶液冷卻至室溫后，將其放于4 ℃冰箱中24 h，真空抽濾，濾渣用去離子水洗滌后真空抽濾，以便徹底洗去黏附在β-CD外部的百里香精油。后將濾渣轉(zhuǎn)移至玻璃培養(yǎng)皿中，鋪平于50 ℃真空干燥箱中干燥至恒質(zhì)量，得到淡黃色百里香精油微膠囊。

1.3.1.2 百里香精油微膠囊包埋率的測定

參考黃晶等[12]的方法測定總油和表面油體積，按下式計算包埋率。

1.3.1.3 百里香精油微膠囊包埋效果觀察

取百里香精油微膠囊與β-CD各20 mg，用蒸餾水分散制備成懸濁液，裝片，置于顯微鏡下觀察（400 倍）。

1.3.2 百里香精油微膠囊MBC和MIC的測定

將保存在-18 ℃甘油管中的由畜產(chǎn)實驗室從熏馬腸中分離的腸桿菌菌株接種于BHI肉湯培養(yǎng)基（pH 5.5）中，活化3 次。

本實驗采用液體培養(yǎng)基倍比稀釋法測定最低抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC）和最低殺菌濃度（minimal bactericidal concentration，MBC）[14]。準(zhǔn)備14 支干凈的滅菌試管，用移液槍向1號試管中加入含有500 mg百里香精油微膠囊液體培養(yǎng)基10 mL，其他每管中加5 mL的液體培養(yǎng)基，漩渦振蕩混勻后，吸取1號試管中5 mL移至2號試管中，依次類推，最后從12號試管中吸去5 mL，然后每管中分別加入100 μL濃度為106CFU/mL的菌液，第13號管為不含百里香精油微膠囊只含等量菌液的對照管，第14號管中不添加百里香精油微膠囊并且不含菌液，作為陰性對照管。37 ℃培養(yǎng)24 h后，觀察結(jié)果，確定其MIC。在顯微鏡下涂片觀察，視野中細(xì)菌或真菌個數(shù)小于5 個時作為此種菌的MIC。從無菌生長的試管中各吸取100 μL，并將其涂布于平板培養(yǎng)基上，然后在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。用活菌計數(shù)法檢查瓊脂平板上的菌落，平板上無菌落數(shù)的最小百里香精油微膠囊質(zhì)量濃度即為MBC。

1.3.3 百里香精油微膠囊對供試菌生長作用的測定

準(zhǔn)備一批10 mL的培養(yǎng)基（接種產(chǎn)組胺菌），分為5 組，第1組為空白對照組，不添加組氨酸和百里香精油微膠囊（A組）；第2組僅添加0.5%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）組氨酸（B組）；第3組添加0.5%組氨酸和MIC百里香精油微膠囊（C組）；第4組添加0.5%組氨酸和1/2 MIC百里香精油微膠囊（D組）；第5組添加0.5%組氨酸和與MIC百里香精油微膠囊中相同量的精油（E組）。每組均含不添加供試菌株的陰性對照。接入供試菌株于37 ℃恒溫培養(yǎng)，每隔4 h取樣，分別測定菌懸液OD600nm、pH值，每組樣品需要各做3 個平行。

1.3.4 HDC相關(guān)基因表達(dá)量的測定

1.3.4.1 RNA的提取

分別取1.3.3節(jié)中培養(yǎng)至穩(wěn)定期的菌液2.0 mL于無酶離心管中，10 000 r/min離心3 min后，采用TRIzol法提取細(xì)菌總RNA[15]。RNA提取完成后使用微量核酸測定儀測定其濃度以及OD260nm/OD280nm，再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。確保RNA的濃度、純度以及完整性符合要求后，進行反轉(zhuǎn)錄。

1.3.4.2 cDNA的合成

按照5×All-In-One RT MasterMix cDNA合成試劑盒的要求將提取到的RNA置于冰上解凍，其他試劑于室溫下解凍。反應(yīng)體系為（20 μL）：RNA模板2 μg、AccuRT Reaction Mix（4×）2 μL、無酶水加至終體積8 μL，在室溫下孵育5 min，再加入AccuRT Reaction Stopper（5×）2 μL、5×All-In-One RT MasterMix 4 μL、無酶水6 μL。然后25 ℃孵育10 min，42 ℃孵育15 min，85 ℃孵育10 min終止反應(yīng)，于冰上冷卻。

1.3.4.3 基因表達(dá)定量分析

向無酶八連管中加入10.0 μL的EvaGreen 2×qPCR MasterMix、上下游引物（表1）各0.6 μL、2 μL的cDNA模板，加入無酶水補足至20 μL，進行反轉(zhuǎn)錄qPCR（reverse transcription qPCR，RT-qPCR）。擴增程序為：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火/延伸60 s，40 個循環(huán)。每組樣品（包括陰性空白對照）做3 個平行。采用2-ΔΔCt計算方法計算HDC基因簇基因的相對表達(dá)量[16]。

表1 RT-qPCR所用引物Table 1 Primers used for RT-qPCR

1.3.5 高效液相色譜測定菌懸液中組胺含量變化

1.3.5.1 組胺標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取組胺標(biāo)準(zhǔn)品5 mg，移入0.4 mol/L的高氯酸將其定容至5 mL，分別吸取25、50、125、250、500、1 000、1 500 μL于5 mL棕色容量瓶中，加入0.4 mol/L的高氯酸使終體積為5 mL，作為組胺標(biāo)準(zhǔn)溶液備用。

1.3.5.2 樣品的制備

每隔4 h分別取1.3.4節(jié)中供試菌菌懸液1.8 mL，12 000 r/min離心10 min，然后吸取1 mL上清液，移入相同體積的0.4 mol/L的高氯酸，并將其充分混勻，制成菌液樣品處理液。

1.3.5.3 衍生化

取1.3.5.1節(jié)中組胺標(biāo)準(zhǔn)溶液、菌液樣品處理液各1 mL于5 mL容量瓶中，按照Lu Shiling等[19]的方法進行衍生化。最后用0.22 μm濾膜過濾至1.5 mL的樣品瓶中，用于上機檢測。

1.3.5.4 色譜條件

色譜柱：C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），其中流動相B為乙腈，流動相A為超純水，色譜柱流速為0.8 mL/min，有機濾膜孔徑為0.22 μm，紫外檢測波長為254 nm，注入樣品的點樣體積為20 μL，色譜柱的柱溫為30 ℃[20]；梯度洗脫程序為：0～5 min，65%流動相B；5～24 min，100%流動相B；24～25 min，65%流動相B；25～30 min，65%流動相B。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

所有實驗數(shù)據(jù)使用Excel 2016軟件分析，采用Origin 2017軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 百里香精油微膠囊包埋效果

根據(jù)飽和水溶液法制備的百里香精油微膠囊外觀為淡黃色粉末，略有百里香精油氣味，其包埋率為78.92%。百里香精油微膠囊與β-CD的顯微成像結(jié)果如圖1所示，百里香精油微膠囊為含有淡黃色透明物的形狀不規(guī)則的塊狀或粉末狀物質(zhì)，而β-CD則為半透明規(guī)則的板狀晶體，表明微膠囊形成，該結(jié)果也與馬君義等[13]的研究結(jié)果相一致。

圖1 百里香精油微膠囊與β-CD顯微成像圖（400×）Fig. 1 Microscopic images of thyme essential oil microcapsules and β-CD (400 ×)

2.2 百里香精油微膠囊的MBC和MIC

表2 百里香精油微膠囊對待測菌種的MIC和MBCTable 2 MIC and minimal bactericidal concentration of thyme essential oil microcapsules against test bacteria

百里香精油微膠囊對摩根氏菌ND和變形桿菌R3的MIC和MBC如表2所示，不同質(zhì)量濃度的百里香精油微膠囊對供試菌株的生長抑制作用不同。百里香精油微膠囊對摩根氏菌ND和變形桿菌R3都具有較強的抑制效果，摩根氏菌ND的MIC和MBC分別為1.56 mg/mL和3.12 mg/mL，變形桿菌R3的MIC和MBC分別為0.78 mg/mL和1.56 mg/mL，這表明變形桿菌R3對百里香精油微膠囊的敏感度要高于摩根氏菌ND。許多研究表明，百里香精油對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌、枯草芽孢桿菌等有較強抗菌作用[21-23]。Inouye等[24]研究了10 種以上精油對3 種病原菌的抑制效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)百里香精油的抑制效果最好，所用劑量最少。Pinto等[25]研究從葡萄牙種植的百里香植株中提取的百里香精油，發(fā)現(xiàn)其對白色念珠菌的抑制劑量范圍在0.32～0.64 μL/mL之間，而對黑曲霉的抑制劑量范圍在0.16～0.32 μL/mL，這與本研究結(jié)果不一致，一方面是因為百里香精油有不同的種類；另一方面是因為本研究用β-CD對精油進行了包埋[26]。供試菌經(jīng)百里香精油微膠囊處理后，其細(xì)胞膜受到損傷，致使膜內(nèi)物質(zhì)泄漏，從而達(dá)到抑菌效果，這與申莉莉[27]的研究結(jié)果相一致。

2.3 百里香精油微膠囊對摩根氏菌和變形桿菌生長的影響

如圖2所示，在0～48 h內(nèi)兩株供試菌OD600nm由高到低為A組/B組＞E組＞D組＞C組，這說明百里香精油對摩根氏菌ND和變形桿菌R3的生長具有一定抑制作用，將精油微膠囊化后，其抑制作用更加明顯，且微膠囊濃度越大，其抑制作用越強。A、B、C、D、E 5 組都經(jīng)歷延滯期、對數(shù)生長期和穩(wěn)定期等3 個階段，而添加了百里香精油微膠囊和精油的菌液組（C、D、E組）與空白組和組氨酸組（A、B組）相比，其對數(shù)生長期較長，穩(wěn)定期的到來較遲，菌株的生長受到明顯抑制。有研究者認(rèn)為植物精油對病原菌的抗菌機理可能有以下3 種，改變病原菌的一些形態(tài)結(jié)構(gòu)如細(xì)胞膜、細(xì)胞壁、細(xì)胞質(zhì)等；改變菌絲體的形態(tài)結(jié)構(gòu)誘發(fā)菌絲體溶解；降低或抑制分生孢子的產(chǎn)生和萌發(fā)[28-30]，有學(xué)者認(rèn)為精油的微膠囊化有助于精油緩釋，增強精油在介質(zhì)中的擴散性，從而破壞供試菌的細(xì)胞膜，使得內(nèi)溶物外泄，菌體逐漸衰老死亡[27]。從圖2可以看出，摩根氏菌ND 1/2 MIC微膠囊+組氨酸組穩(wěn)定期時最終OD600nm較空白對照A組降低了0.50，而變形桿菌R3組則降低了0.61，說明百里香精油微膠囊對變形桿菌R3更為敏感。

圖2 百里香精油微膠囊對摩根氏菌ND和變形桿菌R3生長的影響Fig. 2 Effect of thyme essential oil microcapsules on the growth of M. morganii ND and P. bacillus R3 during 48 h culture

0～48 h內(nèi)兩株供試菌pH值的變化如圖3所示，兩株菌的空白對照A組在整個過程中pH值都是下降的，在4～12 h內(nèi)下降較快，20 h后分別穩(wěn)定在4.19和4.08左右，說明兩株供試菌在對數(shù)期開始大量快速的繁殖，發(fā)酵產(chǎn)物也在慢慢積累。而其他添加組氨酸的4 組（B、C、D、E組）培養(yǎng)液pH值均呈現(xiàn)對數(shù)期前逐漸下降，對數(shù)期后逐步上升的趨勢，這是由于組氨酸是合成組胺的前體物質(zhì)，隨著供試菌株的繁殖，組胺的含量也在不斷積累，因此呈堿性的組胺可以中和供試菌產(chǎn)生的酸性物質(zhì)，這說明兩株供試菌在HDC途徑下有較強的產(chǎn)組胺能力。Freeman等[32]的研究結(jié)果也表明在氨基酸存在的情況下，產(chǎn)生物胺的細(xì)菌能夠引起培養(yǎng)基pH值增加。4 組pH值的這種變化趨勢與張雅晴[20]、趙利利[33]等的研究結(jié)果相似，即在含組氨酸底物的培養(yǎng)液中，由于生物胺的產(chǎn)生，導(dǎo)致pH值在對數(shù)期后期迅速上升并趨于穩(wěn)定。在有組氨酸存在的情況下，兩株供試菌組氨酸組的pH值大于添加有百里香精油微膠囊和精油組的，這是由于微膠囊組和精油組含有的百里香精油抑制了腸桿菌的生長，降低了供試菌在HDC途徑下hdcA和hdcP基因的表達(dá)量，使得組胺的積累速率較慢，因此培養(yǎng)液pH值的上升也較微弱。

圖3 百里香精油微膠囊對摩根氏菌ND和變形桿菌R3生長過程中pH值變化Fig. 3 Effect of thyme essential oil microcapsules on changes in pH during 48 h culture of M. morganii ND and P. bacillus R3

2.4 百里香精油微膠囊對供試菌株基因表達(dá)分析結(jié)果

HDC體系包括兩種類型，來自真核生物和革蘭氏陰性細(xì)菌的一類需要以磷酸吡哆醛作為輔助因子，而另一類來自革蘭氏陽性細(xì)菌，以使用共價結(jié)合的丙酮?；糠肿鳛檩o助基團[34]。本研究所用的兩株菌都屬于革蘭氏陰性菌，因此其HDC為磷酸吡哆醛依賴型，Satomi等[17]從摩根氏菌中發(fā)現(xiàn)的HDC是以磷酸吡哆醛為輔酶而非丙酮酰，雖然在磷酸吡哆醛和丙酮酰作用下，組胺的合成機制不同，但是它們催化組氨酸生成組胺的效率一樣高。HDC簇以hdcA基因開始，隨后是hdcP、hdcRS，并以hdcB基因結(jié)束[35]。由圖4可知，凡是添加了組氨酸（B、C、D、E組）的兩株菌，其hdcA和hdcP兩個基因均有較高水平的表達(dá)，摩根氏菌ND的B組這兩種基因的表達(dá)水平分別是對照A組的512 倍和458 倍，變形桿菌R3是其對照A組的221.32 倍和93.05 倍。這是因為在呈酸性的環(huán)境中，供試菌為了應(yīng)對環(huán)境會通過脫羧反應(yīng)消耗細(xì)胞內(nèi)的質(zhì)子，誘導(dǎo)hdcA、hdcP基因的表達(dá)生成組胺從而產(chǎn)生對酸脅迫的抵抗能力[7]。有研究發(fā)現(xiàn)在發(fā)光桿菌中HDC是磷酸吡哆醛依賴型的，其hdcA基因編碼377 個氨基酸的多肽，而hdcP基因負(fù)責(zé)將組氨酸帶入細(xì)胞質(zhì)空間并從細(xì)胞中排出組胺，并且從外界攝取游離組胺酸的同時會將生成的組胺分泌到胞外，這是一個偶聯(lián)的過程，Northern印跡分析和RT-qPCR結(jié)果顯示在低pH值和組氨酸過量的條件下hdcA和hdcP的基因表達(dá)量很高[7,17,35]。添加有組氨酸（B、C、D、E組）的兩株菌hdcRS基因的表達(dá)普遍低于A組，這與薛林林等[37]研究發(fā)現(xiàn)在糞腸球菌中轉(zhuǎn)運氨酰-tRNA合成酶基因的結(jié)果相一致，即氨酰-tRNA合成酶基因表達(dá)量與氨基酸濃度呈正相關(guān)，這種基因作為生物胺合成機制中的負(fù)調(diào)節(jié)系統(tǒng)，用來阻礙氨基酸脫羧生成生物胺，從而確保有足夠的氨基酸來維持供試菌的生長。而hdcB作為一種功能未知的基因，在兩株菌中的表達(dá)量也各不相同，有研究表明hdcB位于細(xì)胞質(zhì)膜中[6]，還有一些學(xué)者將這種蛋白質(zhì)與操縱子的調(diào)節(jié)或組氨酸和/或組胺的運輸聯(lián)系起來，但其確切的功能仍然未知[35]。de Las等[36]的研究表明hdcA基因和hdcP的同源物以相反的順序排列，而hdcB和hdcRS不存在同源物，而且在有的組胺產(chǎn)生菌中，并未發(fā)現(xiàn)hdcRS和hdcB這兩個基因片段，說明這兩個基因在組氨酸的代謝機制中不是必需的。

添加百里香精油微膠囊可以明顯降低兩株供試菌hdcA和hdcP兩個基因的表達(dá)，其中摩根氏菌ND組氨酸組hdcA和hdcP兩個基因表達(dá)量分別為組氨酸+MIC微膠囊組的245.57、149.09 倍，分別為組氨酸+精油組的2.79、1.50 倍；而變形桿菌R3組氨酸組hdcA和hdcP兩個基因表達(dá)量則分別為組氨酸+MIC微膠囊組的42.52、36.50 倍，分別為組氨酸+精油組的2.58、1.43 倍。這表明百里香精油微膠囊對摩根氏菌ND產(chǎn)組胺過程中基因表達(dá)的影響要大于變形桿菌R3，這與摩根氏菌ND組胺積累量高于變形桿菌R3的結(jié)果相一致，而且有研究表明在組胺形成機制中主要參與的基因是hdcA和hdcP，這進一步表明百里香精油微膠囊可以通過影響HDC和轉(zhuǎn)運組胺/組氨酸蛋白活性來減少相關(guān)基因表達(dá)量以及組胺的積累[7]。此外，百里香精油微膠囊+組氨酸組的hdcA和hdcP基因表達(dá)量要低于精油+組氨酸組，且百里香精油微膠囊精油質(zhì)量濃度越大，其基因表達(dá)量越低，這說明百里香精油微膠囊可以有效地抑制hdcA和hdcP基因的表達(dá)，從而減少組胺的積累。

圖4 百里香精油微膠囊對摩根氏菌ND和變形桿菌R3 HDC相關(guān)基因表達(dá)量的影響Fig. 4 Effect of thyme essential oil microcapsules on the relative expression level of HDC-related genes in M. morganii ND and P. bacillus R3

2.5 百里香精油微膠囊對供試菌株產(chǎn)組胺的影響

0～48 h內(nèi)兩株供試菌組胺積累情況如圖5所示，在有組氨酸存在的情況下，摩根氏菌ND和變形桿菌R3在8～20 h之間組胺質(zhì)量濃度明顯增加，而在穩(wěn)定期期間，組胺積累速率明顯減慢，含量逐漸趨于穩(wěn)定，這是因為在對數(shù)生長期，菌體增殖速率快，此時細(xì)胞的代謝能力最強，因此產(chǎn)組胺量明顯增加，而在穩(wěn)定期時，供試菌生長速率下降，前體物質(zhì)組氨酸的含量降低，HDC活性降低，hdcA和hdcP基因的表達(dá)量降低，從而使組胺的積累速率減緩。在未添加組氨酸的空白對照A組中可以看到，剛開始未檢出組胺，4 h之后有少量的組胺產(chǎn)生，48 h兩株腸桿菌組胺積累量分別為36.68 μg/mL和26.70 μg/mL。這是因為菌株可以利用外界環(huán)境中的物質(zhì)產(chǎn)生前體物質(zhì)氨基酸，然后合成生物胺，在延滯期時，供試菌數(shù)量較少，因此氨基酸量較少，組胺濃度偏低[18]。在只添加組氨酸的B組中，摩根氏菌ND組胺質(zhì)量濃度最終穩(wěn)定在212.40 μg/mL，而變形桿菌R3的組胺質(zhì)量濃度最終穩(wěn)定在114.60 μg/mL，這是由于接種供試菌的不同，在前體物質(zhì)組氨酸相同的情況下，與其他菌相比，摩根氏菌ND產(chǎn)組胺量更多，這與Kim等[38]的研究結(jié)果相一致。

從添加有百里香精油微膠囊的組中可以看出，摩根氏菌ND和變形桿菌R3的產(chǎn)組胺量隨著微膠囊的添加均明顯降低，MIC微膠囊+組氨酸組和精油+組氨酸組（C、E組）與只添加組氨酸組（B組）相比，其組胺積累量分別減少了61.08%、36.23%和55.89%、23.98%，這與趙利利[33]和薛林林[37]等的研究結(jié)果相似，另外百里香精油微膠囊對供試菌組胺積累量的影響要大于百里香精油，百里香精油微膠囊精油質(zhì)量濃度越大，其組胺積累量越低，這表明微膠囊化后的百里香精油可以更加有效地抑制供試菌的生長，降低HDC簇中hdcA和hdcP基因的表達(dá)量，從而使組胺質(zhì)量濃度降低。

圖5 百里香精油微膠囊對摩根氏菌ND和變形桿菌R3培養(yǎng)48 h組胺積累的影響Fig. 5 Effect of thyme essential oil microcapsules on accumulation of histamine in M. morganii ND and P. bacillus R3 during 48 h culture

3 結(jié) 論

百里香精油經(jīng)微膠囊化后對摩根氏菌ND和變形桿菌R3的抑制作用更加明顯，且百里香精油微膠囊精油質(zhì)量濃度越高，抑制作用越明顯，其對摩根氏菌ND和變形桿菌R3的MIC分別為1.56 mg/mL和0.78 mg/mL。百里香精油微膠囊對HDC簇中hdcB和hdcRS基因表達(dá)量影響不明顯，但是可以抑制hdcA和hdcP基因的表達(dá)，當(dāng)培養(yǎng)液中含有百里香精油微膠囊時，一方面菌株的生長受到明顯抑制；另一方面hdcA和hdcP基因表達(dá)量明顯減少，整個組胺合成途徑受到抑制，從而使得產(chǎn)組胺量降低。當(dāng)百里香精油微膠囊的添加量為MIC時，摩根氏菌ND中MIC微膠囊+組氨酸組組胺的生成量較組氨酸組減少了61.08%，變形桿菌R3中MIC微膠囊+組氨酸組組胺的生成量相對于組氨酸組減少了55.89%。因此添加百里香精油微膠囊能夠通過抑制供試菌的生長和降低組胺合成途徑中hdcA和hdcP的基因表達(dá)量來減少組胺的積累。