藍(lán)文言，曹嘉成，齊 琳，吉洋洋，何愛民，段玉權(quán)，榮瑞芬,

（1.北京聯(lián)合大學(xué)生物化學(xué)工程學(xué)院，北京 100023；2.河北?。ㄐ吓_(tái)）核桃產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院，河北 臨城 054300；3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，北京 100193）

核桃營養(yǎng)保健價(jià)值極高[1-2]，其脂肪組成中不飽和脂肪酸相對(duì)含量高達(dá)90%以上，因此也極易發(fā)生氧化酸敗而影響其產(chǎn)品的品質(zhì)和貨架期，故有效控制氧化就成為核桃生產(chǎn)中亟待突破的瓶頸。

核桃仁油脂氧化產(chǎn)生一系列的氧化產(chǎn)物，從感官上不僅能聞到氧化的油脂哈敗味，還能觀察到核桃仁表面出現(xiàn)滲油現(xiàn)象，核桃仁氧化過程中細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)也發(fā)生變化，但有關(guān)核桃果仁氧化酸敗細(xì)胞結(jié)構(gòu)的變化鮮有研究報(bào)道。已有研究主要集中在核桃果仁從胚發(fā)育到成熟時(shí)細(xì)胞組織微觀結(jié)構(gòu)的變化[3]，以及觀察核桃果實(shí)細(xì)胞結(jié)構(gòu)微觀領(lǐng)域的研究[4-5]，如李永濤[6]、陳虹[7]和王蓓[8]等通過石蠟切片技術(shù)、超薄切片技術(shù)、組織化學(xué)技術(shù)和顯微觀察法相結(jié)合，觀察了核桃果實(shí)發(fā)育過程中種仁的細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)、脂肪的轉(zhuǎn)化形成和油體的形態(tài)，而對(duì)于核桃果仁從鮮果到干果及干果貯藏加工過程中細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)，特別是氧化過程中細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化的研究尚少。核桃果仁氧化出現(xiàn)滲油現(xiàn)象表明核桃氧化過程中細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯的變化，滲油將加速核桃果仁的氧化，因此，研究核桃堅(jiān)果仁氧化過程中細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)的變化規(guī)律，揭示滲油的機(jī)制，對(duì)進(jìn)一步從細(xì)胞結(jié)構(gòu)層面深入了解油脂氧化酸敗機(jī)理，并在此基礎(chǔ)上開發(fā)新的抗氧化技術(shù)具有重要的理論意義和實(shí)踐價(jià)值。

拉曼光譜技術(shù)是近年來發(fā)展應(yīng)用的一種測定食品品質(zhì)的新技術(shù)，與傳統(tǒng)的油脂氧化分析方法相比，具有簡單、直接、快捷，樣品無需復(fù)雜預(yù)處理、受中間氧化產(chǎn)物影響小等優(yōu)勢(shì)。拉曼光譜可以提供不同官能團(tuán)的分子結(jié)構(gòu)信息，源于分子中極化率的改變[9]。非極性的化學(xué)鍵（如C＝C雙鍵）具有較強(qiáng)的拉曼散射[10]。因此，通過拉曼光譜技術(shù)可以獲得在傳統(tǒng)方法檢測中難以獲得的分子基團(tuán)信息，更清晰地展現(xiàn)油脂氧化時(shí)發(fā)生的結(jié)構(gòu)變化，確定其氧化程度。本研究運(yùn)用光學(xué)顯微鏡和透射電子顯微鏡技術(shù)，觀察了核桃仁的細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)，并比較分析了常溫氧化和60 ℃加速氧化過程中核桃仁細(xì)胞結(jié)構(gòu)的變化規(guī)律，結(jié)合核桃油脂的過氧化值測定和拉曼光譜分析，探究不同氧化程度核桃仁細(xì)胞顯微結(jié)構(gòu)的變化規(guī)律，旨在揭示核桃仁氧化酸敗的細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化規(guī)律及其關(guān)鍵點(diǎn)，為開發(fā)控制核桃氧化酸敗的新技術(shù)提供科學(xué)依據(jù)，從而保持核桃的營養(yǎng)健康價(jià)值，延長核桃果仁貨架期。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

成熟的核桃仁（河北綠嶺核桃）于2018年9月采收，采后干制至水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%，塑料袋包裝，室溫下存放，2019年4月制作切片用于實(shí)驗(yàn)研究。

冰乙酸、三氯甲烷、碘化鉀、硫代硫酸鈉、石油醚（沸程30～60 ℃）、重鉻酸鉀、淀粉、無水乙醇、磷酸緩沖液、鹽酸溶液、焦亞硫酸鈉（均為分析純）北京化工廠；高碘酸（純度99%）、二甲苯 上海麥克林生化科技有限公司；席夫試劑、考馬斯亮藍(lán)R250、蘇木精、伊紅、蘇丹III、甘油 北京索萊寶公司；中性樹膠、OCT（optimal cutting temperature compound）包埋劑北京中杉金橋生物公司；標(biāo)準(zhǔn)固定液（FAA）、戊二醛固定液 上海源葉生物公司；鋨酸、環(huán)氧樹脂包埋劑、醋酸雙氧鈾 加拿大SPI-Chem公司。

1.2 儀器與設(shè)備

RM2245型半自動(dòng)輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)、CM1850型冷凍切片機(jī) 德國徠卡儀器有限公司；CX41型光學(xué)顯微鏡上海光學(xué)儀器一廠；H-7500型透射電子顯微鏡 日本日立公司；R-201型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海申生科技有限公司；LabRAM HR Evolution型新一代高分辨拉曼光譜儀法國HORIBA Jobin Yvon公司。

1.3 方法

1.3.1 不同溫度條件加速氧化核桃仁處理

為更好地觀察研究日常條件存放核桃的氧化情況，設(shè)置了常溫氧化組，但常溫條件存放周期長，有可能無法觀察到氧化后期的結(jié)果，故設(shè)置一組60 ℃加速氧化組，以實(shí)驗(yàn)開始時(shí)期的核桃仁放入冰箱冷凍作為對(duì)照組。每組處理5 份核桃仁，每份100 g，密封包裝，每隔7 d隨機(jī)選取5 個(gè)完整的核桃仁（子葉部分），分別進(jìn)行制片、細(xì)胞結(jié)構(gòu)觀察和氧化程度測定。

1.3.2 核桃仁細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)觀察

1.3.2.1 石蠟切片制作與細(xì)胞結(jié)構(gòu)觀察

核桃仁切片處理：選取完整的核桃仁進(jìn)行處理，普通刀片切取核桃仁同一部位（子葉），切成厚度為5 mm左右的薄片，切面保持光滑、平整，然后參考李永濤[6]的方法進(jìn)行下述石蠟切片制作。

石蠟切片制作：實(shí)驗(yàn)材料→標(biāo)準(zhǔn)固定液（FAA）固定24 h→梯度乙醇（50%、70%、85%、95%、100%，每個(gè)梯度2 h）脫水→二甲苯透明（體積分?jǐn)?shù)50%二甲苯+體積分?jǐn)?shù)50%乙醇、純二甲苯2 次，每個(gè)梯度2 h）→浸蠟和包埋→半自動(dòng)輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)進(jìn)行連續(xù)切片（4 μm）→展片、粘片、晾片。

組織化學(xué)染色觀察細(xì)胞結(jié)構(gòu)。鑒定細(xì)胞組織多糖的高碘酸-席夫反應(yīng)參照王蓓[8]的方法：0.5%（體積分?jǐn)?shù)，后同）的高碘酸溶液浸泡處理30 min→水洗2 min→席夫試劑處理30 min→焦亞硫酸鈉洗滌液洗滌4 min→水洗5 min→干燥。鑒定細(xì)胞組織蛋白質(zhì)的考馬斯亮藍(lán)R250染色參照李永濤[6]的方法：7%冰乙酸溶液處理2 min→考馬斯亮藍(lán)R250 60 ℃下染色10 min→0.1%冰乙酸溶液處理1 min→水洗5 min→干燥。細(xì)胞中除核之外其他成分的蘇木精-伊紅染色參照李紅芬等[11]的方法：蘇木精染液染色5～15 min→水洗多余染液→0.5%～1%鹽酸-乙醇溶液浸泡2～3 min→蒸餾水洗滌10 s→0.1%～0.5%伊紅染液染色1～5 min→70%、85%、95%、100%乙醇脫水（每個(gè)梯度2～3 min）→二甲苯透明→中性樹膠封片。

光學(xué)顯微鏡觀察切片并拍照。

1.3.2.2 冷凍切片制作與細(xì)胞結(jié)構(gòu)觀察

參考Li Jianxia等[12]方法進(jìn)行冷凍切片制作與細(xì)胞結(jié)構(gòu)觀察。核桃仁的前處理同1.3.2.1節(jié)石蠟切片，樣品→OCT包埋劑中浸沒20 min→-20 ℃下冷凍30 min→調(diào)節(jié)冷凍切片機(jī)切片（5 μm）。細(xì)胞結(jié)構(gòu)觀察：切片→蘇丹III試劑染色30 min→蒸餾水洗3 次→50%甘油封片→光學(xué)顯微鏡觀察并拍照。

1.3.2.3 超薄切片制作和細(xì)胞結(jié)構(gòu)觀察

參考陳虹[7]和王蓓[8]等方法進(jìn)行超薄切片制作和細(xì)胞結(jié)構(gòu)觀察。將核桃仁修整為小塊長方體材料→2.5%戊二醛固定液固定3 h→磷酸緩沖液洗滌3 次→4 ℃、1%鋨酸溶液固定16 h→脫水→滲透→環(huán)氧樹脂包埋→切片（80 nm）→1%檸檬酸鉛溶液和醋酸雙氧鈾50%乙醇飽和溶液染色5～10 min→透射電子顯微鏡觀察。

1.3.3 核桃仁氧化程度的測定

1.3.3.1 核桃油的制備

取混合均勻的樣品30 g，每組樣品取5 份，粉碎后置于250 mL廣口瓶中，按照體積比1∶10加入適量石油醚（沸程30～60 ℃）進(jìn)行溶解[13-14]，搖勻，待完全混合后進(jìn)行密封處理，靜置浸提12 h以上，根據(jù)石油醚沸程不同，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸干石油醚，剩余樣品為待測油樣。

1.3.3.2 過氧化值的測定

參考GB 5009.227—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中過氧化值的測定》測定核桃仁過氧化值。

1.3.3.3 拉曼光譜分析

采用LabRAM HR Evolution型新一代高分辨拉曼光譜儀進(jìn)行拉曼光譜分析，選用532 nm的激光光源，物鏡使用5 倍焦距鏡頭。用毛細(xì)管吸取2 μL核桃油，將其置于LabRAM HR Evolution型新一代高分辨拉曼光譜儀載物臺(tái)的物鏡視野下并找到合適的位置，調(diào)整焦距至清晰可見。設(shè)置掃描參數(shù)為光柵600 mm-1、功率100%、積分時(shí)間30 s、掃描次數(shù)1 次、掃描范圍600～2 000 cm-1，在視野中取點(diǎn)檢測。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS軟件中單因素方差分析法進(jìn)行顯著性分析，以P＜0.05表示差異顯著，采用Pearson法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析。采用Labspec 5軟件進(jìn)行拉曼光譜基線的調(diào)平。采用Origin 8.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 核桃仁細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果

核桃仁屬種仁結(jié)構(gòu)，其最外層為內(nèi)種皮，一層黃色膜衣，包裹著核桃仁，核桃仁中間存在間隙（圖1）。核桃仁中各組分相對(duì)含量以脂肪最多，約60%以上，蛋白質(zhì)約15%，碳水化合物約15%[15-16]。核桃仁的細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)采用石蠟制片、光學(xué)顯微鏡觀察，即可清晰看到，為更清晰地觀察核桃仁細(xì)胞組織中結(jié)構(gòu)及組成成分分布，分別采用多糖染色的席夫試劑（呈紫紅色）、蛋白質(zhì)染色的考馬斯亮藍(lán)R250（呈藍(lán)色）和細(xì)胞中除細(xì)胞核之外其他所有物質(zhì)染色的蘇木精-伊紅（呈紅色）切片。細(xì)胞內(nèi)的脂肪采用蘇丹III染色（橘黃色）。因石蠟切片制作過程用到的二甲苯溶劑能將脂肪溶解去除，導(dǎo)致制片后的細(xì)胞中無脂肪存在，因此，核桃脂肪的觀察不使用二甲苯溶劑制片的冷凍切片。

圖1 核桃仁的黃色膜衣和間隙Fig. 1 Endotesta and crack of walnut kernels

2.1.1 核桃仁內(nèi)種皮及表層結(jié)構(gòu)

經(jīng)過石蠟切片處理和席夫試劑、考馬斯亮藍(lán)R250、蘇木精-伊紅染色后，在光學(xué)顯微鏡下觀察可見，內(nèi)種皮結(jié)構(gòu)由6～7 層細(xì)胞組織構(gòu)成（圖2），內(nèi)種皮細(xì)胞組織是由輸送營養(yǎng)物質(zhì)的類似維管束結(jié)構(gòu)和不規(guī)則形狀的細(xì)胞組成，細(xì)胞內(nèi)未見任何物質(zhì)，由于它由幾層疏松的細(xì)胞層組成，具有緩沖外力的作用，因而對(duì)核桃仁起到了良好的保護(hù)作用。

2.1.2 皮層細(xì)胞組織

緊鄰核桃內(nèi)種皮內(nèi)側(cè)的是一層排列緊密的、中等大小的矩形厚壁細(xì)胞組織（圖3），細(xì)胞壁比其他層細(xì)胞的細(xì)胞壁明顯增厚，其將內(nèi)種皮和核桃仁內(nèi)部組織分開，此層細(xì)胞的上下細(xì)胞壁很厚，約2～3 μm，比其左右側(cè)細(xì)胞壁厚，細(xì)胞內(nèi)可見大量直徑約為0.2～1.0 μm的顆粒狀物質(zhì)，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)R250染色后呈現(xiàn)藍(lán)色，為蛋白質(zhì)顆粒（圖3B）。緊貼表皮層內(nèi)側(cè)的是一層體積變小、排列緊密的方圓形細(xì)胞，細(xì)胞壁未增厚。皮層細(xì)胞組織這種特殊結(jié)構(gòu)具有致密、抗擠壓等特點(diǎn)，對(duì)核桃仁內(nèi)層細(xì)胞起到了很重要的阻隔和抗擠壓保護(hù)作用。

2.1.3 內(nèi)層貯藏細(xì)胞組織

貯藏細(xì)胞是構(gòu)成核桃仁主體的細(xì)胞組織。觀察圖3、4可知，貯藏細(xì)胞的形狀由靠近皮層細(xì)胞的類橢圓形到中心部位后逐漸變?yōu)橹睆郊s25～30 μm的圓形，每瓣（即核桃仁中1/4小瓣）核桃仁中間有一條裂痕，形為條帶狀的結(jié)構(gòu)為核桃仁中間裂痕處細(xì)胞層，由中心部位到接近裂痕部位細(xì)胞呈圓形，直徑與中心部位一致，裂痕邊緣處細(xì)胞變小，直徑約為9～10 μm，與類橢圓形相比，絕大多數(shù)貯藏細(xì)胞為圓形。從核桃仁表皮細(xì)胞至中心部位最后到裂痕部位細(xì)胞變化明顯，直徑由小變大，再變小，層次分明。分析可知凡核桃仁邊緣處，緊鄰?fù)饨缈諝鈱蛹?xì)胞體積都較小且致密，由此表明核桃仁外層細(xì)胞都具有一定的堅(jiān)硬結(jié)構(gòu)和致密性，以保護(hù)內(nèi)層細(xì)胞。內(nèi)含物蛋白質(zhì)顆粒直徑由外層細(xì)胞（圖3）向內(nèi)層細(xì)胞（圖4）變化規(guī)律與細(xì)胞直徑的變化規(guī)律一致，直徑變化為2 μm→5 μm→1～2 μm，較為均勻地分散于貯藏細(xì)胞中，不同部位每個(gè)貯藏細(xì)胞內(nèi)蛋白體數(shù)量基本一致，約為10～13 個(gè)，偶爾出現(xiàn)個(gè)別貯藏細(xì)胞中蛋白體數(shù)量較少的情況。

圖4 不同染色制片的核桃仁中心層細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)（×20）Fig. 4 Microscopic structure of central layer cells in walnut kernels with different staining preparation (× 20)

圖5 蘇丹III染色后細(xì)胞組織中脂肪的分布（×40）Fig. 5 Distribution of fat in cells with Sudan III staining (× 40)

圖6 核桃仁細(xì)胞中脂肪與蛋白質(zhì)的分布（×3 500）Fig. 6 Distribution of fat and protein in walnut kernel cells (× 3 500)

由于核桃脂肪含量過高，制片切片時(shí)會(huì)破壞細(xì)胞及油體結(jié)構(gòu)，造成脂肪外溢擴(kuò)散，呈現(xiàn)為光亮的小油滴（圖5）。因光學(xué)顯微鏡對(duì)核桃細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)的觀察分辨率有限，無法清晰觀察到細(xì)胞的微觀結(jié)構(gòu)，需采用透射電子顯微鏡來觀察。如圖6所示，經(jīng)透射電子顯微鏡觀察，成熟干制后的核桃仁貯藏細(xì)胞中無細(xì)胞器，僅有脂肪和蛋白質(zhì)顆粒（蛋白體）[17]存在。脂肪以大小較均勻的油滴（又稱油體，油料細(xì)胞中油脂的主要儲(chǔ)存結(jié)構(gòu)）形式充滿細(xì)胞內(nèi)，蛋白體分散在脂肪中。油體大小相對(duì)均勻，平均直徑約為3～4 μm。研究表明，細(xì)胞內(nèi)油體分布在一個(gè)蛋白網(wǎng)絡(luò)中[18]。油體中有一種稱為Oleosins的蛋白質(zhì)在維持油體的穩(wěn)定方面發(fā)揮重要作用[19-20]，稱其為油體膜，能夠防止油體破裂，維持油體的完整和細(xì)胞內(nèi)脂肪的穩(wěn)定。

2.2 核桃仁氧化過程中細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化

由圖7、8透射電子顯微鏡觀察圖可知，不同溫度下存放核桃仁氧化過程中，其細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)生一系列有規(guī)律的變化，60 ℃加速氧化組細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化較大。

圖7 常溫下不同氧化時(shí)間核桃仁細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化Fig. 7 Ultrastructural changes of walnut kernel cells during oxidation at normal temperature

圖8 60 ℃條件下不同氧化時(shí)間核桃仁細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化Fig. 8 Ultrastructural changes of walnut kernel cells during oxidation at 60 ℃

2.2.1 蛋白體的變化

通過透射電子顯微鏡觀察，對(duì)照組的蛋白體形狀呈圓形或橢圓形，大小相對(duì)均勻，直徑約為4～5 μm，均勻分散在細(xì)胞中，周圍是大量的脂肪體（圖7A1、A2）。常溫氧化組隨著氧化時(shí)間的延長，從第14天開始，部分蛋白體直徑減小為1～2.5 μm（圖7C1、D1、E1），并且表面不光滑（圖7B2、C2、D2、E2）。60 ℃加速氧化組在第0～7天時(shí)，蛋白體出現(xiàn)與常溫條件下第14～21天較一致的變化趨勢(shì)（圖8B1），表明加速氧化的同時(shí)加速了核桃仁細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞，加速氧化后期均觀察到蛋白體向細(xì)胞一側(cè)移動(dòng)聚集的現(xiàn)象，蛋白體上出現(xiàn)了小白點(diǎn)。但蛋白體表面沒有出現(xiàn)明顯的不光滑現(xiàn)象（圖8D1、D2、E1、E2）。蛋白體上出現(xiàn)的小白點(diǎn)結(jié)構(gòu)尚不知其具體成分、功能及形成原因，有待后續(xù)研究。

2.2.2 油體及油體膜的變化

對(duì)照組的油體呈不規(guī)則五邊形，直徑約為3～4 μm，占細(xì)胞體積的大部分，油體膜呈線性致密結(jié)構(gòu)，隨著氧化時(shí)間的延長，常溫氧化組和60 ℃加速氧化組的油體膜逐漸皺縮（圖7D3、D4、E3、E4），后者油體膜更大量地發(fā)生破裂消失（圖8D2、E2），表明高溫加劇了油體膜的破壞。

2.2.3 細(xì)胞壁和細(xì)胞間隙的變化

貼近細(xì)胞壁處的油體與細(xì)胞壁之間有一定的空隙，但不明顯（圖7A2、A3、A4）；隨著氧化時(shí)間的延長，常溫氧化組細(xì)胞壁與油體膜間隙明顯增大，在第21天時(shí)油體膜出現(xiàn)明顯的皺縮（圖7D3、D4），60 ℃加速氧化組第7天時(shí)，細(xì)胞壁與油體膜間隙和油體膜發(fā)生與常溫組同樣的變化，但程度加?。▓D8B3、B4），表明高溫條件加速了核桃仁細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞，加速氧化后期觀察到油體膜皺縮程度逐漸加深，第14天時(shí)，靠近三細(xì)胞間隙細(xì)胞壁周圍的油體膜降解破裂（圖8C4）。第21天時(shí)靠近細(xì)胞壁的油體膜開始大量破裂（圖8D2、D3、D4、E2、E3、E4），靠近三細(xì)胞與雙細(xì)胞間隙的細(xì)胞壁周圍油體膜出現(xiàn)同等程度的破壞。

對(duì)照組的細(xì)胞壁平滑，結(jié)構(gòu)致密且完整，厚薄均勻，胞壁邊緣整齊，緊貼細(xì)胞壁的中膠層電子密度高，呈“明-暗-明”區(qū)域結(jié)構(gòu)（圖7A3、A4）。不同處理組的細(xì)胞壁隨著氧化時(shí)間的延長逐漸皺縮，厚薄變得不均一，但未破裂，中膠層由“明-暗-明”區(qū)域結(jié)構(gòu)逐漸變得模糊，60 ℃氧化組的變化較常溫氧化組明顯，第28天中膠層甚至有產(chǎn)生間隙的趨勢(shì)（圖8E3）表明細(xì)胞壁發(fā)生了一定程度的分解變化。

2.3 核桃仁氧化過程中過氧化值的變化

圖9 不同氧化條件和時(shí)間核桃油脂過氧化值的變化Fig. 9 Changes in peroxide value of walnut oil under different storage conditions

圖9顯示，隨著氧化時(shí)間延長，常溫和60 ℃氧化處理核桃的油脂過氧化值都呈逐漸上升趨勢(shì)，60 ℃氧化組過氧化值顯著高于常溫組（P＜0.05），兩組處理的核桃油脂在第14～21天氧化進(jìn)程突然加劇，常溫氧化和加速氧化的過氧化值分別增大約75%、64%，與同時(shí)期核桃仁細(xì)胞結(jié)構(gòu)中油體膜明顯皺縮和大量發(fā)生破裂的情況一致，油體膜的結(jié)構(gòu)遭到較大程度的破壞后，造成油脂外溢，進(jìn)一步加劇氧化反應(yīng)，導(dǎo)致出現(xiàn)過氧化值增大的結(jié)果。

2.4 核桃仁氧化過程中油脂的拉曼光譜分析結(jié)果

圖10 核桃油脂的拉曼光譜圖Fig. 10 Raman spectrum of walnut oil

如圖10所示，各特征峰代表其組分的分子基團(tuán)結(jié)構(gòu)信息，核桃油脂的拉曼峰主要集中于600～1 800 cm-1的拉曼位移范圍內(nèi)，其中1 658 cm-1處的峰是核桃油脂的主要峰，其強(qiáng)度（峰高）與不飽和烯烴鍵的含量成正比關(guān)系。油脂酸敗的本質(zhì)是其中不飽和脂肪酸雙鍵發(fā)生氧化[21]，因此，拉曼光譜強(qiáng)度峰值可反映核桃油脂的不同氧化程度[22]。

拉曼光譜強(qiáng)度表示拉曼散射光強(qiáng)弱的信號(hào)值，一般以光子計(jì)數(shù)值表示[23]。拉曼光譜強(qiáng)度IR可以如下式表示。

式中：I0為激光強(qiáng)度；n為待測物分子密度；dσ/dΩ為拉曼截面積；Ω為光收集角度；Le為路徑長度；υR和υ0分別為拉曼頻率和入射光頻率。

如圖11、12所示，隨著氧化時(shí)間的延長，可以很清晰地觀察到不同氧化溫度組1 658 cm-1特征峰的拉曼光譜強(qiáng)度總體呈下降趨勢(shì)，第7天到第14天，特征峰強(qiáng)度有小幅度的衰減，無明顯變化，但是在第14天到第21天，特征峰的強(qiáng)度較大幅度下降，常溫和加速氧化組分別下降了5.24%、10.92%。常溫和加速氧化組在第28天時(shí)特征峰的強(qiáng)度分別較對(duì)照組下降了12.22%、31.07%。由此可知，60 ℃加速氧化下核桃油脂拉曼光譜強(qiáng)度的衰減速率比常溫氧化更快，表明拉曼光譜分析能較準(zhǔn)確地反映出核桃油脂的氧化特性。

圖11 常溫氧化核桃油脂拉曼光譜圖Fig. 11 Raman spectrum of oxidized walnut oil stored at normal temperature

圖12 60 ℃氧化核桃油脂拉曼光譜圖Fig. 12 Raman spectrum of oxidized walnut oil stored at 60 ℃

2.5 核桃仁氧化過程中細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化與拉曼光譜強(qiáng)度、過氧化值的相關(guān)性分析結(jié)果

表1 核桃仁氧化過程中細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化與拉曼光譜強(qiáng)度、過氧化值的對(duì)應(yīng)Table 1 Changes in cell structure corresponding to Raman intensity and peroxide value during oxidation of walnut kernels

由表1可知，常溫條件下，隨著氧化進(jìn)展到第7天，細(xì)胞結(jié)構(gòu)上蛋白體先發(fā)生變化，表面變得粗糙；第14天時(shí)蛋白體變得大小不等，可能發(fā)生了蛋白體的破碎和聚合，同時(shí)細(xì)胞壁也變得厚薄不均；第21天時(shí)，油體膜出現(xiàn)明顯的皺縮，此時(shí)，拉曼光譜強(qiáng)度較第14天降低5.24%，過氧化值升高了75%。而60 ℃加速氧化7天時(shí)蛋白體就發(fā)生明顯變化，拉曼光譜強(qiáng)度較對(duì)照組降低5.64%，過氧化值升高128.57%。之后每個(gè)周期的測定值都較前一個(gè)周期發(fā)生明顯變化，表明60 ℃的高溫條件下，核桃仁氧化速度明顯加快。細(xì)胞結(jié)構(gòu)上，第14～21天油體膜開始發(fā)生破裂直至大面積破裂且蛋白體向細(xì)胞一側(cè)移動(dòng)聚集，第28天時(shí)，油體膜進(jìn)一步破裂，拉曼光譜強(qiáng)度變化劇烈，較第21天降低了13.78%，而過氧化值的上升幅度趨緩，較第21天上升了4.88%，這可能與油脂的氧化反應(yīng)進(jìn)入二級(jí)氧化有關(guān)。上述結(jié)果表明，核桃仁的氧化伴隨著細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)生漸進(jìn)深入的結(jié)構(gòu)破壞性變化，蛋白體的變化先于油體膜的變化，油體膜明顯皺縮直到破裂時(shí)，核桃仁氧化加劇，細(xì)胞結(jié)構(gòu)的變化與過氧化值和拉曼光譜強(qiáng)度有標(biāo)志性的對(duì)應(yīng)關(guān)系。

2.6 核桃油脂氧化過程中過氧化值與拉曼光譜相關(guān)性分析結(jié)果

圖13 常溫氧化核桃油脂拉曼光譜強(qiáng)度與過氧化值的相關(guān)性Fig. 13 Relationship between Raman intensity and peroxide value of walnut oil under ambient oxidation at 60 ℃

圖14 60 ℃氧化核桃油脂拉曼光譜強(qiáng)度與過氧化值的相關(guān)性Fig. 14 Relationship between Raman intensity and peroxide value of walnut oil under accelerated oxidation at 60 ℃

如圖13、14所示，常溫和60 ℃條件下氧化第28天，核桃仁油脂的拉曼光譜強(qiáng)度與過氧化值均呈線性相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)分別為0.982 69和0.919 63，常溫下的相關(guān)關(guān)系達(dá)到0.98以上，優(yōu)于60 ℃條件的相關(guān)系數(shù)，表明常溫條件下拉曼光譜分析能較準(zhǔn)確地反映出核桃油脂氧化前期的氧化特性。而加速氧化條件下，核桃油脂氧化進(jìn)程加快，氧化反應(yīng)進(jìn)入二級(jí)氧化有關(guān)，過氧化值已不能準(zhǔn)確反映油脂的氧化程度，因而，相關(guān)系數(shù)線性關(guān)系較低。由于拉曼光譜分析操作簡單快速，在生產(chǎn)實(shí)踐中，用拉曼光譜分析核桃和核桃油脂貨架期前期的品質(zhì)和氧化特性具有重要的實(shí)踐意義。

3 討 論

核桃油脂以油體的形式被油體膜包裹，與蛋白體均勻分散分布在細(xì)胞內(nèi)，從結(jié)構(gòu)上看，核桃仁貯藏細(xì)胞中油體外層有油體膜、細(xì)胞壁、皮層厚壁細(xì)胞組織、內(nèi)種皮層細(xì)胞組織，以及最外層的核桃殼包裹，5 層結(jié)構(gòu)組織將外界空氣阻隔，形成層層防護(hù)，且核桃仁化合物組成中含有相當(dāng)豐富的多酚[24]、黃酮[25]和VE[26]等抗氧化成分。但核桃堅(jiān)果仁存放過程中仍然會(huì)發(fā)生嚴(yán)重的氧化。盡管核桃油脂不飽和脂肪酸含量高，但其結(jié)構(gòu)上的層層防護(hù)對(duì)阻隔空氣的進(jìn)入應(yīng)該具有一定的效果，且核桃殼避光，故光敏氧化的影響可以不考慮，那么，核桃的氧化機(jī)制就只能是自動(dòng)氧化和酶促氧化，但上述結(jié)構(gòu)組織能夠阻隔空氣，意味著氧氣的影響較小，無論是自動(dòng)氧化和酶促氧化的作用都受到抑制，由此表明核桃仁的氧化機(jī)制很復(fù)雜。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)核桃仁氧化過程中細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化的初步研究表明，核桃仁細(xì)胞中的蛋白體表面變得粗糙、出現(xiàn)小白點(diǎn)，油體膜發(fā)生皺縮、裂解等劇烈變化，與核桃油脂的氧化進(jìn)程相關(guān)性大，氧化影響了蛋白體和油體膜的結(jié)構(gòu)，二者結(jié)構(gòu)變化與氧化的相互關(guān)系以及在氧化過程中的作用尚不清楚，有待進(jìn)一步深入研究。

蛋白體結(jié)構(gòu)變化中，表面出現(xiàn)小白點(diǎn)，此現(xiàn)象在胡楊種子細(xì)胞蛋白體中也得到證實(shí)[27]，Tully等[28]的研究表明，蛋白體由擬晶體和蛋白質(zhì)基質(zhì)組成，由單層膜包被，蛋白質(zhì)基質(zhì)中可含有酶[29]和一個(gè)至多個(gè)大小不同的植酸鈣鎂球狀體[28]，后者易與蛋白質(zhì)結(jié)合，抑制酶活性，使其降解蛋白質(zhì)的效率降低[30]。所以，隨著氧化進(jìn)程的加劇，細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化時(shí)，可能為植酸鈣鎂球狀體的小白點(diǎn)增多，可認(rèn)為其對(duì)蛋白質(zhì)具有保護(hù)作用，該變化過程需進(jìn)一步深入探討研究。

前人的研究表明，蛋白質(zhì)出現(xiàn)一側(cè)移動(dòng)聚集的趨勢(shì)，可能與油脂和蛋白質(zhì)之間維持平衡體系相關(guān)[31]。因此，在核桃仁細(xì)胞結(jié)構(gòu)層面積極探索脂質(zhì)與蛋白的相互作用、蛋白體和油體膜的分子結(jié)構(gòu)是今后研究的重點(diǎn)。

油脂氧化產(chǎn)生的氫過氧化物、小分子醛類和自由基等氧化產(chǎn)物，對(duì)油體膜產(chǎn)生氧化損傷，導(dǎo)致油體膜皺縮破裂，證實(shí)了油脂氧化以及氧化產(chǎn)物對(duì)生物膜具有損傷作用[32-33]，氧化后期細(xì)胞壁出現(xiàn)的厚薄不均現(xiàn)象促進(jìn)了核桃仁出油。結(jié)合本研究結(jié)果，推測核桃油脂氧化出油的過程為：加速氧化后期，油體膜的破壞從細(xì)胞壁周圍開始，油體膜破裂，細(xì)胞壁皺縮，中膠層離散，使細(xì)胞中潰散的油脂得以穿過細(xì)胞壁與遭到破壞的細(xì)胞膜，最后沿著細(xì)胞間隙滲出核桃仁表面，造成出油現(xiàn)象。

4 結(jié) 論

核桃仁細(xì)胞組織基本結(jié)構(gòu)包括6～7 層細(xì)胞組成的內(nèi)種皮組織，2 層厚壁細(xì)胞組成的皮層組織和大量的貯藏細(xì)胞組成的中心貯藏組織。貯藏細(xì)胞中充滿形狀不規(guī)則圓形、直徑約為3～4 μm的油體，均勻分散著10～15 個(gè)直徑約為4～5 μm的蛋白體。

核桃仁氧化過程中細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化規(guī)律：細(xì)胞中蛋白體表面由光滑變?yōu)榇植?，發(fā)生聚合和破碎，并向細(xì)胞一側(cè)移動(dòng)；細(xì)胞壁周圍油體膜首先開始皺縮、逐漸皺縮加劇，直至破裂，并向細(xì)胞中心蔓延；細(xì)胞壁與油體膜間隙增大，細(xì)胞壁皺縮并出現(xiàn)厚薄不均勻，中膠層逐漸模糊不清晰。

核桃仁氧化與拉曼光譜的相關(guān)性：核桃氧化過程中，細(xì)胞內(nèi)蛋白體和油體膜結(jié)構(gòu)變化與過氧化值與拉曼光譜強(qiáng)度具有較好的相關(guān)性；常溫條件下拉曼光譜強(qiáng)度與過氧化值之間線性關(guān)系良好，拉曼光譜分析可準(zhǔn)確地反映出核桃油脂的氧化特性。