老年慢性心力衰竭病人錳超氧化物歧化酶Ala-9Val基因多態(tài)性與預(yù)后的相關(guān)性研究

閆生玲 屈麗娜 薛恩忠

慢性心力衰竭(chronic heart failure，CHF)是各種心臟疾病的終末發(fā)展階段，主要表現(xiàn)為心室泵血或充盈功能低下，是心血管疾病病人喪失勞動力及死亡的重要原因。錳超氧化物歧化酶(manganese superoxide dismutase，Mn-SOD)是超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)重要的同工酶類型，主要存在于線粒體基質(zhì)中，是機體最重要的抗氧化酶之一，參與維持機體自由基平衡。既往研究發(fā)現(xiàn)，CHF病人血清SOD活性顯著降低，并與CHF病人病情嚴重程度密切相關(guān)[1-2]，提示氧化應(yīng)激在CHF發(fā)生發(fā)展進程中發(fā)揮重要作用。Ala-9Val是近年來新發(fā)現(xiàn)的Mn-SOD基因多態(tài)性位點，本研究擬比較Mn-SOD基因Ala-9Val位點不同基因型CHF病人預(yù)后情況的差異，旨在探討Mn-SOD基因多態(tài)性與CHF病人預(yù)后的關(guān)系，為臨床工作提供參考。

1 對象與方法

1.1 研究對象 經(jīng)本院倫理委員會審核批準，連續(xù)性選擇2015年1月至2017年6月于我科住院治療的老年CHF病人，納入標準：(1)年齡≥60歲；(2)CHF診斷符合2014年中華醫(yī)學會心血管病學分會制定的《中國心力衰竭診斷和治療指南》[3]；(3)隨訪資料完整。排除標準：(1)合并各種心臟瓣膜病、先天性心臟病、心包疾病、心肌炎等；(2)合并惡性腫瘤，嚴重肝腎疾病者。本研究共選取CHF病人280例，其中男179例，女101例，年齡60～82歲，平均(68.06±6.98)歲。另隨機從我院同期老年健康體檢者中選擇100例健康志愿者作為對照組，包括男60例，女40例，年齡60～79歲，平均(67.82±6.60)歲。2組性別、年齡差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

1.2 方法

1.2.1 基因多態(tài)性檢測及分組:采用PCR-限制性片段長度多態(tài)性法(RFLP)檢測Mn-SOD Ala-9Val基因多態(tài)性。采集清晨空腹外周靜脈血，應(yīng)用DNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)提取全血基因組DNA。嚴格按照PCR操作流程進行擴增，上、下游引物分別為5′-CAGCCCAGCCTGCGTAGACG-3′和5′-GCGTTGATGTGAGGTTCCAG-3′，均由上海生物工程有限公司合成。取延伸產(chǎn)物采用限制性內(nèi)切酶BsaW Ⅰ進行酶切。最后，取酶切產(chǎn)物進行電泳，凝膠成像系統(tǒng)判定結(jié)果。如圖1，有且只有1條88 bp電泳帶為Ala/Ala基因型，有2條長度分別為88 bp和172 bp電泳帶為Ala/Val基因型，有且只有1條172 bp電泳帶為Val/Val基因型。根據(jù)既往研究中國人群Mn-SOD Ala-9Val位點基因型分布特點及本研究檢測結(jié)果，將CHF組病人分為Val/Val亞組和Ala/Ala+Ala/Val亞組。

注：1，2：Val/Val；3，4：Ala/Val；5，6：Ala/Ala；M：marker圖1 Mn-SOD基因Ala-9Val位點PCR-RFLP電泳圖

1.2.2 其他臨床資料收集:包括性別、年齡、BMI、吸煙史、高血壓、DM及心肌梗死等疾病史，NYHA分級，BNP、血肌酐、估算的腎小球率過濾(estimated glomerular filtration rate，eGFR)等血液化驗指標。此外，CHF病人均接受超聲心動圖檢查，采集并記錄LVEF及左室舒張末期內(nèi)徑(left ventricular end diastolic diameter，LVEDD)等參數(shù)。

1.2.3 隨訪：以確診CHF之日為隨訪起點，每3個月通過門診或電話隨訪1次，至少隨訪3年，以心源性死亡(猝死、CHF加重死亡以及致死性心肌梗死)為隨訪終點，并以此將CHF病人分為死亡亞組和存活亞組。

2 結(jié)果

2.1 2組Mn-SOD Ala-9Val基因多態(tài)性比較 280例CHF病人中，Mn-SOD Ala-9Val位點Val/Val、Ala/Val和Ala/Ala基因型分別有227例(81.07%)，48例(17.14%)和5例(1.79%)，對照組分別為78例(78.00%)，19例(19.00%)和3例(3.00%)。2組基因型和等位基因分布頻率差異均無統(tǒng)計學意義(χ2=0.747，P=0.688；χ2=0.696，P=0.404)。2組基因型分布經(jīng)檢驗均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡(χ2=1.651，P=0.438；χ2=1.727，P=0.422)，具有群體代表性。

2.2 不同基因型老年CHF病人一般臨床特點比較 Val/Val亞組病人合并心肌梗死比例高于Ala/Ala+Ala/Val亞組(χ2=4.340，P=0.037)，2個亞組其他指標差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。見表1。

表1 不同基因型CHF病人臨床資料比較

2.3 不同基因型老年CHF病人3年死亡率比較 280例CHF病人隨訪3年時間內(nèi)失訪19例，非心源性死亡6例，剩余255例，其中攜帶Val/Val、Ala/Val和Ala/Ala基因型病人分別為204例(80.00%)，46例(18.04%)和5例(1.96%)。255例CHF病人中共73例病人發(fā)生心源性死亡，Val/Val亞組和Ala/Val+Ala/Ala亞組分別有67例(31.86%)和6例(15.69%)，2個亞組3年死亡率比較差異具有統(tǒng)計學意義(χ2=8.872，P=0.003)。

2.4 老年CHF病人預(yù)后的影響因素分析 單因素分析顯示，死亡亞組BMI、心肌梗死比例，NYHA Ⅲ～Ⅳ級比例、LgBNP和LVEDD水平高于存活亞組，eGFR和LVEF低于存活亞組，差異均具有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。2個亞組間Mn-SOD基因Ala-9Val位點基因型和等位基因分布頻率差異均具有統(tǒng)計學意義(χ2=9.056，P<0.05)。見表2。進一步Logistic回歸分析顯示，攜帶Val/Val基因型是老年CHF病人3年心源性死亡的獨立危險因素(OR=1.759，95%CI：1.151～2.687，P=0.003)。

表2 不同預(yù)后CHF病人臨床資料比較

3 討論

越來越多研究證據(jù)表明,機體氧化應(yīng)激水平失衡是CHF病人病情進展的重要因素[1-2,4]。SOD是一類廣泛存在于生物體內(nèi)的金屬酶，人體中存在Mn-SOD、Fe-SOD、Ni-SOD和CuZn-SOD等多種同工酶形式，Mn-SOD主要分布于細胞線?；|(zhì)內(nèi)，是機體最主要的自由基清除劑之一，對維持機體細胞氧化還原平衡至關(guān)重要。

人類Mn-SOD基因位于6q25上，Ala-9Val是目前研究最多的Mn-SOD基因單核苷酸多態(tài)性位點，可將Mn-SOD線粒體靶序列第9位的氨基酸由丙氨酸(Ala)替換為絲氨酸(Val)，進而導致信號肽構(gòu)象由親水的α-螺旋結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)槭杷摩?折疊層結(jié)構(gòu)，阻礙Mn-SOD在線粒體膜上轉(zhuǎn)運，顯著降低Mn-SOD活性。大量研究結(jié)果顯示Ala-9Val位點多態(tài)性與多種疾病發(fā)生相關(guān)[5-6]。此外，既往國內(nèi)外研究結(jié)果表明，不同地區(qū)、不同種族人群該位點基因型和等位基因分布頻率存在顯著差異，亞洲人群Ala等位基因分布頻率顯著低于歐洲人群。多數(shù)國外研究結(jié)果顯示西方白種人Ala等位基因分布頻率約為70%[7-8]。Lee等[9]在臺灣地區(qū)人群中發(fā)現(xiàn)攜帶Ala等位基因(Ala/Ala+Ala/Val)者約占26.29%，張超賢等[10]以國人為研究對象的結(jié)果與之相似。本研究健康對照組攜帶Ala等位基因占22%，再次提示有必要在不同地區(qū)、不同種族人群中進一步開展該位點基因多態(tài)性研究分析。

本研究結(jié)果顯示攜帶Val/Val基因型是老年CHF病人3年內(nèi)發(fā)生心源性死亡的獨立危險因素，提示基因型的差異可能會導致病人對缺血缺氧的耐受程度發(fā)生改變，干預(yù)心肌重構(gòu)進程，影響病人預(yù)后，進一步驗證了氧化/抗氧化系統(tǒng)失衡在CHF疾病進展中的關(guān)鍵作用。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)Mn-SOD基因Ala-9Val多態(tài)性與老年CHF病人預(yù)后相關(guān)，Val/Val基因型可能成為預(yù)測老年CHF病人預(yù)后不良的新指標。本研究也存在不足之處：首先，本研究所納入研究對象例數(shù)有限，尤以Ala/Ala基因型病人例數(shù)較少，所得到的結(jié)果可能存在偏差，期待后續(xù)多中心大樣本研究結(jié)果進一步驗證；其次，限于條件，本研究未就Mn-SOD活性進行檢測，不能直接說明不同基因型病人Mn-SOD活性的差異；最后，Mn-SOD基因還存在其他多態(tài)性位點，它們與CHF預(yù)后的關(guān)系，以及各位點之間的相互關(guān)系有待繼續(xù)研究。