彭靖堯，黃 為，謝武娟，凌 華，張 敏，趙 華

重慶市疾病預(yù)防控制中心,重慶 400042

脊髓灰質(zhì)炎(簡稱脊灰)是由脊髓灰質(zhì)炎病毒(PV)急性傳染引起，在兒童中發(fā)生，以肌肉麻痹為主要癥狀。PV在全球曾廣泛傳播。1988年世界根除脊灰行動(dòng)開始后，隨著滅活疫苗(IPV)、減毒活疫苗(OPV)在全球范圍內(nèi)的廣泛使用，迄今為止，全球范圍內(nèi)脊灰病例已經(jīng)減少了99%，世界上絕大多數(shù)地區(qū)已經(jīng)消除了脊灰[1]。從2000年開始，中國進(jìn)入“無脊灰”狀態(tài)，即沒有脊灰野病毒引起的脊灰病例[2]。但截至目前，我國仍然在廣泛使用OPV，OPV可能導(dǎo)致疫苗衍生脊灰病毒(VDPV)的出現(xiàn)，這是在即將消滅脊灰的現(xiàn)階段工作中所面臨的重要問題[3]。在現(xiàn)階段，檢測PV的金標(biāo)準(zhǔn)仍然是細(xì)胞分離，我國脊灰網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室使用人橫紋肌肉瘤細(xì)胞(RD細(xì)胞)系和轉(zhuǎn)人脊灰受體的小鼠肺細(xì)胞(L20B細(xì)胞)系這兩種細(xì)胞系對PV進(jìn)行細(xì)胞分離。因此，保證RD和L20B細(xì)胞系對PV的高度敏感性，對所用細(xì)胞系進(jìn)行有效的質(zhì)量控制，才能及時(shí)分離出標(biāo)本中低水平的PV，以確保不漏檢脊灰野病毒及VDPV[4]。本研究對重慶市疾病預(yù)防控制中心脊灰實(shí)驗(yàn)室2013-2019年P(guān)V分離所用細(xì)胞系的質(zhì)量控制情況進(jìn)行分析，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞系 本研究使用的RD細(xì)胞系和L20B細(xì)胞系均來自中國疾病預(yù)防控制中心脊灰實(shí)驗(yàn)室，將所獲得的RD細(xì)胞系和L20B細(xì)胞系進(jìn)行傳代，建立細(xì)胞庫凍存于液氮罐中，定期復(fù)蘇細(xì)胞傳代備用。

1.1.2標(biāo)準(zhǔn)毒株 本研究中使用的毒株有細(xì)胞敏感性實(shí)驗(yàn)參考株(CSTR)和重慶市實(shí)驗(yàn)室質(zhì)控株(LQC)。其中CSTR來自中國疾病預(yù)防控制中心脊灰實(shí)驗(yàn)室，LQC由重慶市脊灰實(shí)驗(yàn)室按照世界衛(wèi)生組織(WHO)推薦的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進(jìn)行制備[5]。經(jīng)歷3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)后確定平均滴度值(期望值)，LQC確定滴度后分裝于凍存管(每管0.1 mL)，超低溫冰箱-80 ℃保存，同時(shí)將LQC滴度上報(bào)WHO，經(jīng)反饋認(rèn)可后用于日常細(xì)胞敏感性實(shí)驗(yàn)。

1.2方法

1.2.1支原體檢測 采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)法檢測L20B和RD細(xì)胞系有無支原體污染。PCR試劑使用寶生生物(Takara Bio)的Prime Script One Step RT-PCR Kit Ver.2，使用引物如下，F(xiàn)1：5′-ACA CCA TGG GAG CTG GTA AT-3′；R1：5′-CTT CAT CGA CTT TCA GAC CCA AGG CAT-3′。引物來自中國疾病預(yù)防控制中心脊灰實(shí)驗(yàn)室。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 80 s，32個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。陽性擴(kuò)增產(chǎn)物大小約為450 bp。

1.2.2細(xì)胞敏感性實(shí)驗(yàn) 分別用已知型別和滴度的LQC進(jìn)行檢測，具體實(shí)驗(yàn)步驟參照WHO推薦方法，要求每次細(xì)胞敏感性實(shí)驗(yàn)中檢測的病毒滴度值在WHO認(rèn)可的LQC滴度值±0.5以內(nèi)。病毒滴度采用Karber公式計(jì)算。Karber公式：logCCID50=L-d×(S-0.5)，L為最低稀釋度log值，d為稀釋梯度log值，S為各個(gè)稀釋度中細(xì)胞病變孔數(shù)所占比例的總和。細(xì)胞敏感性實(shí)驗(yàn)中，96孔板每孔通常加入0.1 mL的病毒懸液用于檢測，故細(xì)胞敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果常用logCCID50/0.1 mL表示，釋義為每0.1 mL病毒稀釋液對應(yīng)的半數(shù)細(xì)胞病變數(shù)的對數(shù)值。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)錄入、整理和圖表制作使用Excel2010軟件。

2 結(jié) 果

2.1重慶市脊灰實(shí)驗(yàn)室LQC滴度 2013年1月至2019年3月重慶市脊灰實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞敏感性實(shí)驗(yàn)中使用的3個(gè)型別的LQC(SabinⅠ、SabinⅡ、SabinⅢ)為本實(shí)驗(yàn)室2007年制備，標(biāo)記為LQC2007。2019年4月細(xì)胞敏感性實(shí)驗(yàn)使用新制備的LQC，標(biāo)記為LCQ2019(2016起SabinⅡ型細(xì)胞敏感性實(shí)驗(yàn)停止，因此未制備LCQ2019SabinⅡ)。LQC2007、LCQ2019各型別在RD細(xì)胞系和L20B細(xì)胞系上經(jīng)WHO認(rèn)可的平均滴度值見表1。

2.2支原體檢測實(shí)驗(yàn) 重慶市脊灰實(shí)驗(yàn)室于2015年起按中國疾病預(yù)防控制中心要求，在每次細(xì)胞敏感性實(shí)驗(yàn)前均對L20B和RD細(xì)胞系進(jìn)行支原體檢測。2015年1月至2019年12月，累計(jì)進(jìn)行19次支原體檢測實(shí)驗(yàn)，結(jié)果均為陰性。

表1 重慶市脊灰實(shí)驗(yàn)室各型別LQC期望滴度值及可接受波動(dòng)范圍(logCCID50/0.1 mL)

2.3細(xì)胞敏感性實(shí)驗(yàn) 2013-2019年重慶市脊灰實(shí)驗(yàn)室按照WHO推薦標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行了27次細(xì)胞敏感性實(shí)驗(yàn)，自2016年起，在全球范圍內(nèi)三價(jià)OPV(含SabinⅠ、SabinⅡ、SabinⅢ)被二價(jià)OPV(SabinⅠ、SabinⅢ)代替，WHO宣布消滅二型PV，SabinⅡ標(biāo)準(zhǔn)株的細(xì)胞敏感性實(shí)驗(yàn)停止。2013年1月至2019年3月，使用LQC2007進(jìn)行細(xì)胞敏感性實(shí)驗(yàn)，在L20B細(xì)胞系上，敏感性實(shí)驗(yàn)滴度分別如下：SabinⅠ為(8.28±0.43)logCCID50/0.1 mL，SabinⅡ?yàn)?7.87±0.27)logCCID50/0.1 mL，SabinⅢ為(7.77±0.47)logCCID50/0.1 mL。RD細(xì)胞系上，敏感性實(shí)驗(yàn)滴度SabinⅠ、SabinⅡ、SabinⅢ分別為(8.15±0.48)、(7.95±0.50)、(8.23±0.43)logCCID50/0.1 mL。2019年3月后，使用LQC2019進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，在L20B細(xì)胞系上，敏感性實(shí)驗(yàn)滴度SabinⅠ、SabinⅢ分別為(7.70±0.04)、(7.10±0.30)logCCID50/0.1 mL，RD細(xì)胞系上，敏感性實(shí)驗(yàn)滴度SabinⅠ、SabinⅢ分別為(8.06±0.39)、(7.83±0.13)logCCID50/0.1 mL。L20B細(xì)胞系上各型別的LQC2007滴度波動(dòng)情況見圖1，RD細(xì)胞系上各型別的LQC2007滴度波動(dòng)情況見圖2。由于僅使用LQC2019進(jìn)行了3次細(xì)胞敏感性實(shí)驗(yàn)，故對其結(jié)果未進(jìn)行作圖分析。

圖1 多次實(shí)驗(yàn)各型別LQC2007在L20B細(xì)胞系上的滴度波動(dòng)情況

圖2 多次實(shí)驗(yàn)各型別LQC2007在RD細(xì)胞系上的滴度波動(dòng)情況

3 討 論

病毒的細(xì)胞分離培養(yǎng)是實(shí)驗(yàn)室檢測的“金標(biāo)準(zhǔn)”，經(jīng)細(xì)胞分離培養(yǎng)得到的高水平和高純度的病毒毒株，可以為后續(xù)一系列的病毒鑒定和深入研究打下基礎(chǔ)。相關(guān)研究指出，使用L20B細(xì)胞系和RD細(xì)胞系進(jìn)行PV分離有較高的靈敏度，其靈敏度不亞于分子生物學(xué)方法[6]。WHO從2015年開始，在全球PV檢測實(shí)驗(yàn)室推行了最新版的PV分離流程[7]，這樣又進(jìn)一步提高了PV的分離效率。因此，對PV的細(xì)胞分離工作實(shí)施質(zhì)量控制，有著重要意義。

PV分離工作質(zhì)量控制的核心是保證分離病毒所用細(xì)胞系的質(zhì)量，這是PV監(jiān)測工作準(zhǔn)確性的前提，也是PV診斷工作的基礎(chǔ)。影響細(xì)胞系生長的因素眾多，包括培養(yǎng)細(xì)胞所需的原材料質(zhì)量(胎牛血清、培養(yǎng)液、緩沖液等)、細(xì)胞生長條件(培養(yǎng)溫度、二氧化碳濃度)、培養(yǎng)液污染(細(xì)菌、支原體等)。WHO推薦脊灰實(shí)驗(yàn)室中細(xì)胞系質(zhì)量控制的有效方法是支原體檢測和細(xì)胞敏感性實(shí)驗(yàn)[8]。支原體廣泛分布于自然界，其最佳生長溫度是37 ℃[9]。實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞系極易被支原體污染，被支原體污染的細(xì)胞通常不會(huì)有細(xì)胞病變，或僅引起細(xì)微的變化不易被察覺，使用PCR法可以快速、準(zhǔn)確地檢測細(xì)胞系中的支原體，以確定細(xì)胞系是否被支原體污染。PV細(xì)胞敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果可直接反映出細(xì)胞系對特定型別PV的敏感程度，以此確定細(xì)胞系生長狀態(tài)是否正常，從而達(dá)到對細(xì)胞系的質(zhì)量控制。

2013-2019年重慶市脊灰實(shí)驗(yàn)室累計(jì)對細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行了19次支原體檢測(2015年開始，按照中國疾病預(yù)防控制中心脊灰實(shí)驗(yàn)室要求進(jìn)行支原體檢測)，檢測結(jié)果均為陰性，表明這期間細(xì)胞系沒有被支原體污染。支原體感染細(xì)胞培養(yǎng)液后，會(huì)黏附于細(xì)胞表面，進(jìn)而影響細(xì)胞運(yùn)輸機(jī)制和細(xì)胞膜受體。有研究指出，L20B細(xì)胞系被支原體污染后，其細(xì)胞膜上的PV受體CD155會(huì)被支原體干擾，從而降低對PV的敏感性[4]。當(dāng)支原體檢測為陽性時(shí)，必須追溯整個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)的全過程，如更換細(xì)胞系來源、對實(shí)驗(yàn)器具消毒處理、重新配置實(shí)驗(yàn)試劑等，重新檢測支原體陰性后才可以進(jìn)行細(xì)胞敏感性實(shí)驗(yàn)。

從重慶市脊灰實(shí)驗(yàn)室2013-2019年的細(xì)胞敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，27次細(xì)胞敏感性實(shí)驗(yàn)中，L20B細(xì)胞系和RD細(xì)胞系上各型別LQC的檢測滴度均在期望值±0.5logCCID50/0.1 mL內(nèi)，表明這期間重慶市脊灰實(shí)驗(yàn)室所用細(xì)胞系對PV有著較高的敏感性，24次LQC2007的細(xì)胞敏感性實(shí)驗(yàn)表現(xiàn)出在RD細(xì)胞系上各型別LQC的滴度均高于L20B細(xì)胞系上的滴度，此結(jié)果與黑龍江省的相關(guān)研究一致[10]。通過細(xì)胞敏感性滴度曲線圖可以看出，截至2019年3月21日(第24次實(shí)驗(yàn))，L20B細(xì)胞系上的SabinⅠ型LQC滴度均在期望值以下，并且隨時(shí)間延長呈現(xiàn)下降趨勢；SabinⅢ型LQC在RD細(xì)胞系和L20B細(xì)胞系上均表現(xiàn)出滴度下降趨勢。理想的細(xì)胞敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果應(yīng)該是在期望值上下波動(dòng)，筆者認(rèn)為上述現(xiàn)象可能由以下因素導(dǎo)致：(1)2007年制備的LQC在確定其期望滴度值時(shí)，所用細(xì)胞系傳代代數(shù)較低，其后進(jìn)行細(xì)胞敏感性實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞系已經(jīng)過多次傳代，細(xì)胞系隨傳代代數(shù)增加，對LQC的敏感性可能出現(xiàn)衰退[8]。(2)LQC經(jīng)過長時(shí)間的凍存，其病毒活性可能下降。針對這個(gè)問題，重慶市脊灰實(shí)驗(yàn)室于2019年4月重新制備了LQC，使用新的LQC進(jìn)行的3次細(xì)胞敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果均正常，新的LQC可用于代替2007年制備的LQC，用于細(xì)胞系質(zhì)量控制。

綜上所述，重慶市脊灰實(shí)驗(yàn)室所用細(xì)胞系對PV保持了較高的敏感性，但仍然存在問題，應(yīng)加強(qiáng)細(xì)胞系的質(zhì)量控制工作。在消滅脊灰的最后階段，脊灰實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞系的質(zhì)量控制必不可少，在實(shí)際工作中應(yīng)結(jié)合支原體檢測和細(xì)胞敏感性實(shí)驗(yàn)兩種方法對細(xì)胞系進(jìn)行質(zhì)量控制，及時(shí)發(fā)現(xiàn)存在的問題，保證PV監(jiān)測系統(tǒng)的敏感性，確保及時(shí)、準(zhǔn)確地發(fā)現(xiàn)與鑒別PV。