香花油茶葉的茶多酚提取、純化及其抗氧化活性研究

陳海燕，李沐曉，周則華，潘英明，楊 漓

（1.廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學(xué)研究院 國家油茶工程技術(shù)研究中心熱帶地區(qū)油茶良種與栽培試驗站，廣西南寧 530002；2.浙江農(nóng)林大學(xué)，浙江杭州 311300；3.廣西貴港市平天山林場，廣西貴港537100；4.廣西師范大學(xué)，廣西桂林 541001）

茶多酚通常從茶葉中提取，又名茶單寧和茶鞣質(zhì)，由兒茶素類、黃酮類、花青甙類、酚酸類和縮酚酸類等30多種多羥基酚類化合物組成，其中兒茶素類化合物占茶多酚的60%～80%[1]，其次是黃酮類，其他酚類物質(zhì)較少。研究人員對茶多酚的抗氧化性和生理活性等功能進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，研究表明其在抗氧化、抗病毒和抗輻射以達(dá)到防癌、抗癌、抑制腫瘤的作用及預(yù)防心血管類疾病等方面具有較好的功效[2-6]，被廣泛應(yīng)用于日用化工、食品和醫(yī)療保健等領(lǐng)域。

山茶屬（Camellia）植物的葉片多富含茶多酚，香花油茶（C.osmantha）是2012年在廣西南寧發(fā)現(xiàn)的山茶屬短柱茶組新種[7]，國內(nèi)外對其研究不多，主要集中在繁育、生理、茶油和園林綠化等方面[8-10]，關(guān)于香花油茶葉中提取茶多酚的研究較少。香花油茶葉中的茶多酚含量較高，其嫩葉的茶多酚含量可高達(dá)38%(以干葉計)，比通常用來提取茶多酚的茶葉高很多[11]。從茶葉中提取茶多酚的研究較多，提取方法有溶劑萃取法、離子沉淀法、柱子分離法、超臨界CO2萃取法、酶提取法、微波提取法及超聲波提取法等[12-15]。本研究在前人研究的基礎(chǔ)上進(jìn)行優(yōu)化改進(jìn)，先用超聲-微波協(xié)同萃取，再用乙醇浸提，然后通過活性白土和酸性活性炭進(jìn)行吸附，最后用無水乙醇進(jìn)行純化，醇沉后進(jìn)行離心分離，上清液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮，濃縮液置于真空干燥箱中干燥，得到茶多酚成品；將茶多酚成品用于豬油的抗氧化活性試驗，檢驗其抗氧化活性能力。試驗可為香花油茶的綜合利用提供理論依據(jù)，為香花油茶提取茶多酚實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

香花油茶葉采集自廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學(xué)研究院油茶種質(zhì)資源庫5 ～10年生成年母樹植株。

1.2 儀器

UV-2501PC 紫外分光光度計；FW100 高速萬能粉碎機(jī)；JJ200 型電子分析天平；W-201B 數(shù)顯恒溫水浴鍋；L530 臺式低速離心機(jī)；250D 恒溫光照培養(yǎng)箱；CW-2000型超聲-微波協(xié)同萃取儀；SZCL-2A 數(shù)顯智能控溫磁力氣攪拌器；VOS-30A真空干燥箱。

1.3 試劑

沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品、福林酚（Folin-Ciocalteu）試劑、無水乙醇、活性白土、酸性活性炭、豬油（自制）。試驗用水均為蒸餾水；除特殊標(biāo)注外，所用試劑均為分析純。

1.4 試驗方法

1.4.1 茶多酚的提取

對采集的香花油茶嫩葉進(jìn)行預(yù)處理，洗凈并低溫烘干，粉碎過篩（60目）備用。

稱取一定量經(jīng)過篩處理的香花油茶樣品，放入超聲-微波協(xié)同萃取儀的萃取瓶中，加入30 mL乙醇（濃度分別為20%、30%、40%、50%和60%），設(shè)定微波功率（150、250、350、450 和550 W）、超聲功率（50 W）、萃取溫度（50、60、70、80和90 ℃)、萃取時間（50、100、150、200和250 s）,萃取完成后，將萃取瓶中的香花油茶葉及萃取液倒入圓底燒瓶中，加入乙醇（與香花油茶葉原料料液比分別為1∶15、1∶20、1∶25、1∶30和1∶35），攪拌均勻后放入水浴鍋中浸提（時間分別為15、30、45、60 和75 min)，倒出浸提液于冰箱靜置8 h，用離心機(jī)將浸提液分離，倒出上清液，重復(fù)以上操作3 次，將每次的浸取液分別放置。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將上清液進(jìn)行濃縮，回收乙醇，濃縮液置于已恒重的蒸發(fā)皿上，于真空干燥箱中干燥，得到茶多酚成品。稱重并計算茶多酚質(zhì)量，按照GB/T 8313-2018[16]的方法對茶多酚成品中茶多酚的含量進(jìn)行檢測，計算香花油茶葉中提取茶多酚的得率（茶多酚得，考察各因素對香花油茶葉中提取茶多酚得率的影響，確定香花油茶葉中茶多酚提取的最佳工藝條件。

1.4.2 茶多酚的純化

在按照最佳工藝條件得到的茶多酚提取液中加入活性白土（10、20、30、40 和50 g/L)，置于磁力攪拌器上攪拌，重復(fù)攪拌吸附幾次，將吸附后的茶多酚浸提液進(jìn)行離心分離，上清液加入酸性活性炭（20、30、40、50 和60 g/L)，置于磁力攪拌器上攪拌，重復(fù)攪拌吸附幾次，將吸附后的茶多酚浸提液進(jìn)行離心分離，上清液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮，濃縮液加入無水乙醇（1∶1、1∶2、1∶3、1∶4和1∶5）進(jìn)行醇沉，醇沉后進(jìn)行離心分離，上清液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮，濃縮液置于已恒重的蒸發(fā)皿上并放入真空干燥箱中干燥，得到茶多酚成品。稱重并計算茶多酚質(zhì)量，按照GB/T 8313-2018[16]的方法對茶多酚成品中茶多酚的含量進(jìn)行檢測，計算香花油茶葉中提取茶多酚的得率，考察各因素對香花油茶葉中茶多酚純度及得率的影響，確定香花油茶葉中茶多酚純化的最佳工藝條件。

1.4.3 抗氧化性能試驗

取等量豬油30 g，分別加入12 個三角瓶中，在三角瓶中分別加入豬油質(zhì)量的0.02%、0.04%、0.06%、0.08%和0.10%的茶多酚（茶多酚已通過酰化制成油溶性茶多酚，能完全溶于豬油），設(shè)1 個空白對照組。把三角瓶放入恒溫光照培養(yǎng)箱中，設(shè)定溫度60 ℃，每3 天按照GB 5009.227-2016[17]的方法測定豬油的過氧化值。

2 結(jié)果與分析

2.1 香花油茶葉中茶多酚的提取

2.1.1 乙醇濃度對茶多酚提取的影響

在超聲功率50 W、微波功率350 W、超聲-微波萃取時間100 s、料液比1∶25、浸提溫度70 ℃、浸提時間45 min、浸提次數(shù)2次、活性白土量30 g/L、酸性活性炭量40 g/L、無水乙醇與濃縮液比4∶1 的條件下，考察不同濃度乙醇對茶多酚得率的影響。當(dāng)乙醇濃度較低時，茶多酚得率較低，這是由于茶多酚在水中容易發(fā)生氧化反應(yīng)，導(dǎo)致含量下降；隨著乙醇濃度增加，乙醇抑制了氧化反應(yīng)，茶多酚得率提高，當(dāng)乙醇濃度為40% 時，茶多酚得率較高（12.18%）；乙醇濃度繼續(xù)增加，得率變化不大，還有稍微下降的趨勢，這是因為隨著乙醇濃度的升高，香花油茶葉中的脂溶性物質(zhì)浸出，茶多酚的雜質(zhì)增加，得率下降；從經(jīng)濟(jì)成本各方面考慮，乙醇濃度選擇40%為宜（圖1）。

圖1 乙醇濃度對茶多酚得率的影響Fig.1 Effects of ethanol concentrations on yield of tea polyphenols

2.1.2 微波功率對茶多酚提取的影響

超聲-微波協(xié)同萃取是近幾年較新的一種浸提方法，利用微波的穿透性，使浸提液中的極性分子在微波電磁場中發(fā)生高頻運(yùn)動，分子間的頻繁摩擦引起分子細(xì)胞內(nèi)溫度快速升高，細(xì)胞破裂，胞內(nèi)有效成分快速流出，增大分子內(nèi)有效成分的的擴(kuò)散速率，達(dá)到快速、高效和節(jié)能的浸提效果。在超聲功率50 W、超聲-微波萃取時間100 s、乙醇濃度40%、料液比1∶25、浸提溫度70 ℃、浸提時間45 min、浸提次數(shù)2 次、活性白土量30 g/L、酸性活性炭量40 g/L、無水乙醇與濃縮液比4∶1 的條件下，考察不同微波功率對茶多酚得率的影響。茶多酚得率隨著微波功率的增大而提高，但當(dāng)微波功率超過350 W后，得率變化不大，說明過大的微波功率對茶多酚得率的提高沒有幫助，而且微波功率過大會引起浸提液過熱，葉中的顆粒擴(kuò)散運(yùn)動加劇，造成浸提液暴沸，茶多酚也容易發(fā)生氧化反應(yīng)；綜合考慮，微波功率選擇350 W為宜（圖2）。

圖2 微波功率對茶多酚得率的影響Fig.2 Effect of power of microwave heating on yield of tea polyphenols

2.1.3 微波時間對茶多酚提取的影響

在超聲功率50 W、微波功率350 W、乙醇濃度40%、料液比1∶25、浸提溫度70 ℃、浸提時間45 min、浸提次數(shù)2 次、活性白土量30 g/L、酸性活性炭量40 g/L、無水乙醇與濃縮液比4∶1 的條件下，考察不同微波時間對茶多酚得率的影響。當(dāng)微波時間少于100 s 時，茶多酚得率隨著微波時間的增加而提高；當(dāng)微波時間多于100 s 時，隨著微波時間的增加,茶多酚得率下降，這主要是由于隨著微波時間的增加，浸提液的溫度升高，茶多酚中的兒茶素類物質(zhì)在浸提液中被氧化而縮合為不同程度的縮合產(chǎn)物（圖3）。因此，微波時間選擇100 s為宜。

圖3 微波時間對茶多酚得率的影響Fig.3 Effect of time of microwave heating on yield of tea polyphenols

2.1.4 料液比對茶多酚提取的影響

在超聲功率50 W、微波功率350 W、乙醇濃度40%、超聲-微波萃取時間100 s、浸提溫度70 ℃、浸提時間45 min、浸提次數(shù)2 次、活性白土量30 g/L、酸性活性炭量40 g/L、無水乙醇與濃縮液比4∶1 的條件下，考察不同料液比對茶多酚得率的影響。茶多酚得率與料液比呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，料液比越小，茶多酚得率越高；料液比小于1∶25，茶多酚得率的相對提高率不明顯；料液比小則乙醇的用量增加，乙醇的回收增加生產(chǎn)成本，從經(jīng)濟(jì)效益考慮，料液比選擇1∶25為宜（圖4）。

圖4 料液比對茶多酚得率的影響Fig.4 Effect of ratio of feed to liquid on yield of tea polyphenols

2.1.5 浸提溫度對茶多酚提取的影響

在超聲功率50 W、微波功率350W、乙醇濃度40%、超聲-微波萃取時間100 s、料液比1∶25、浸提時間45 min、浸提次數(shù)2次、活性白土量30 g/L、酸性活性炭量40 g/L、無水乙醇與濃縮液比4∶1 的條件下，考察不同浸提溫度對茶多酚得率的影響。當(dāng)溫度低于70 ℃時，茶多酚得率與浸提溫度呈正相關(guān)關(guān)系；當(dāng)浸提溫度高于70 ℃時，隨著浸提溫度的升高茶多酚得率變化不明顯；當(dāng)浸提溫度達(dá)到90 ℃時，茶多酚得率略有下降（圖5）。高溫條件下茶多酚易發(fā)生氧化反應(yīng)，導(dǎo)致得率下降，浸提溫度選擇70 ℃為宜。

圖5 浸提溫度對茶多酚得率的影響Fig.5 Effect of extraction temperature on yield of tea polyphenols

2.1.6 浸提時間對茶多酚提取的影響

在超聲功率50 W、微波功率350 W、乙醇濃度40%、超聲-微波萃取時間100 s、料液比1∶25、浸提溫度70 ℃、浸提次數(shù)2 次、活性白土量30 g/L、酸性活性炭量40 g/L、無水乙醇與濃縮液比4∶1 的條件下，考察不同浸提時間對茶多酚得率的影響。茶多酚得率隨浸提時間的增加呈先上升后下降的趨勢，45 min時得率最高（圖6）。

圖6 浸提時間對茶多酚得率的影響Fig.6 Effect of extraction time on yield of tea polyphenols

2.1.7 浸提次數(shù)對茶多酚提取的影響

在超聲功率50 W、微波功率350 W、乙醇濃度40%、超聲-微波萃取時間100 s、料液比1∶25、浸提溫度70 ℃、浸提時間45 min、活性白土量30 g/L、酸性活性炭量40 g/L、無水乙醇與濃縮液比4∶1的條件下，考察不同浸提次數(shù)對茶多酚得率的影響。浸提1次時，茶多酚得率較低；浸提3次時，茶多酚得率與浸提2 次時差別不大；從經(jīng)濟(jì)效益考慮，浸提2 次為最佳（圖7）。

圖7 浸提次數(shù)對茶多酚得率的影響Fig.7 Effects of times of extraction on yield of tea polyphenols

2.2 香花油茶葉中茶多酚的純化

2.2.1 活性白土量對茶多酚純化的影響

香花油茶葉提取液的化學(xué)組成復(fù)雜，除含有茶多酚外，還含有咖啡因、氨基酸、蛋白質(zhì)、茶多糖、果膠、色素、維生素、芳香物、酶及無機(jī)鹽等多種物質(zhì)，活性白土能最大程度地去除其中的咖啡因和其他雜質(zhì)，而且活性白土吸附后通過離心分離就能將沉淀分離，操作簡便，成本低廉。在超聲功率50 W、微波功率350 W、乙醇濃度40%、超聲-微波萃取時間100 s、料液比1∶25、浸提溫度70 ℃、浸提次數(shù)2 次、浸提時間45 min、酸性活性炭量40 g/L、無水乙醇與濃縮液比4∶1的條件下，考察不同活性白土量對茶多酚純度及回收率的影響。當(dāng)活性白土量為10 g/L時，茶多酚回收率最高（18.78%），純度最低（35.77%）；當(dāng)活性白土量為50 g/L時，茶多酚純度最佳（61.25%），回收率最低（8.46%）（圖8）。綜合考慮，活性白土量選擇30 g/L為宜，此時純度為60.06%，回收率為12.18%。

圖8 活性白土量對茶多酚純度及回收率的影響Fig.8 Effects of activated white soil quantity on purity and recovery rate of tea polyphenols

2.2.2 酸性活性炭量對茶多酚純化的影響

酸性活性炭對色素等雜質(zhì)有較大的吸附作用。在超聲功率50 W、微波功率350 W、乙醇濃度40%、超聲-微波萃取時間100 s、料液比1∶25、浸提溫度70 ℃、浸提次數(shù)2 次、浸提時間45 min、活性白土量30 g/L、無水乙醇與濃縮液比4∶1的條件下，考察不同酸性活性炭量對茶多酚純度及回收率的影響。隨著酸性活性炭量的增加，茶多酚的純度提高，回收率降低；綜合考慮，酸性活性炭量選擇40 g/L為宜（圖9）。

圖9 酸性活性炭量對茶多酚純度及回收率的影響Fig.9 Effects of acid activated carbon quantity on purity and recovery rate of tea polyphenols

2.2.3 無水乙醇與濃縮液比對茶多酚純化的影響

無水乙醇對茶多酚濃縮液進(jìn)行醇沉，是一個溶解擴(kuò)散沉淀的過程，多糖是水溶性的，不溶于無水乙醇，一些蛋白質(zhì)、無機(jī)鹽和果膠等也不溶于無水乙醇，通過醇沉可以把濃縮液中的多糖、蛋白質(zhì)、無機(jī)鹽和果膠等雜質(zhì)去除，達(dá)到純化茶多酚的目的。在超聲功率50 W、微波功率350W、乙醇濃度40%、超聲-微波萃取時間100 s、料液比1∶25、浸提溫度70 ℃、浸提次數(shù)2 次、浸提時間45 min、活性白土量30 g/L、酸性活性炭量40 g/L 的條件下，考察不同無水乙醇與濃縮液比對茶多酚純度及回收率的影響。隨著無水乙醇與濃縮液比的增加，茶多酚的純度提高，回收率降低；綜合考慮，無水乙醇與濃縮液比4∶1為宜（圖10）。

圖10 無水乙醇與濃縮液比對茶多酚純度及回收率的影響Fig.10 Effects of ratio of anhydrous ethanol to concentrated liquid on purity and recovery rate of tea polyphenols

2.3 香花油茶茶多酚抗氧化活性

過氧化值的高低是評判豬油酸敗程度的標(biāo)準(zhǔn)。與沒有加入茶多酚的豬油相比，隨著時間的增加，加入了茶多酚的豬油過氧化值的增加緩慢很多，由此可見，香花油茶葉中的茶多酚具有抗氧化活性，能延緩豬油中不飽和脂肪酸的氧化分解，延長油脂的質(zhì)變酸敗時間，延長油脂貯藏時間；當(dāng)茶多酚的添加量為豬油質(zhì)量的0.06%時，豬油的過氧化值隨時間變化增加的速率最低（表1）。

表1 各處理的過氧化值Tab.1 Peroxide number of all treatments

3 結(jié)論與討論

通過對超聲-微波協(xié)同萃取茶多酚及純化工藝關(guān)鍵技術(shù)的研究，確定了香花油茶葉中茶多酚提取與純化的最佳工藝條件為超聲功率50 W、微波功率350 W、超聲-微波萃取時間100 s、乙醇濃度40%、料液比1∶25、浸提溫度70 ℃、浸提時間45 min、浸提次數(shù)2 次、活性白土量30 g/L、酸性活性炭量40 g/L、無水乙醇與濃縮液比4∶1。在此條件下，香花油茶葉中的茶多酚提取得率為12.18%。

從香花油茶葉中提取的茶多酚對豬油具有良好的抗氧化性，試驗表明，當(dāng)添加量為油脂量的0.06%時，茶多酚對豬油的抗氧化效果最好。

香花油茶葉來源豐富，屬廢物利用，成本較低，從香花油茶葉中提取的茶多酚天然、無毒副作用且含量較高，其有望成為茶多酚提取的新原料。