張海燕 牛輝 畢利利

華蘭基因工程有限公司 河南新鄉(xiāng) 453000

1 概述

1.1 單克隆抗體介紹

從1975 年 至 今， 單 克 隆 抗 體（monoclon alanti body，mAb）經(jīng)歷了從簡單的雜交瘤細胞株中表達到使用成熟的動物細胞進行大規(guī)模生產(chǎn)的歷程。目前，單克隆抗體可以分為三類，分別是鼠源性單克隆抗體、人源化單克隆抗體和全人源單克隆抗體，其中全人源單克隆抗體也可算作人源化單克隆抗體的一個分類。

1.2 中國倉鼠卵巢細胞

CHO 細胞是指中國倉鼠卵巢細胞，是從中國灰倉鼠卵巢組織經(jīng)過分離，然后進行連續(xù)傳代而得到的哺乳動物細胞。目前CHO細胞是應用最為廣泛的抗體生產(chǎn)動物細胞，據(jù)統(tǒng)計目前有超過70%的動物細胞表達產(chǎn)品由CHO 細胞表達和生產(chǎn)，在我國現(xiàn)有的絕大多數(shù)生物大分子藥物都是由CHO 細胞表達[1]。

2 大規(guī)模培養(yǎng)工藝及可能存在的問題

規(guī)模放大策略。細胞培養(yǎng)工藝過程中的參數(shù)可以分為兩類：與體積相關的參數(shù)和與體積無關的參數(shù)。隨著反應器規(guī)模大小變化而變化的參數(shù)，在放大過程中會根據(jù)反應器通氣孔徑的大小和方式，以及攪拌槳的大小和形式而發(fā)生變化。一般來說，隨著反應器體積的變大，通氣速率一般呈線性上升的趨勢。通氣流速的放大一般采用單位體積單位時間的通氣量（vvm）恒定的方法。其中，O2和CO2流速的放大方法在實際的操作過程中還要根據(jù)反應器中DO 和pH 控制器的類型以及工藝要求的控制策略做適當?shù)恼{(diào)整。在參數(shù)放大過程中，反應器攪拌轉(zhuǎn)速的放大需要考慮的因素比較多。大型反應器的攪拌速度需要考慮既能夠為反應器提供足夠的混合能力，還要避免造成由于高轉(zhuǎn)速條件下剪切力所引起的不必要的細胞損傷。轉(zhuǎn)速對體積氧傳遞系數(shù)（KLa）的影響，也是在放大過程中需要考慮的一個重要因素[2]。

3 CHO 細胞培養(yǎng)方法

隨著重組蛋白等生物大分子藥物的開發(fā)和發(fā)展，CHO 細胞的培養(yǎng)工藝研究也不斷地深入。根據(jù)培養(yǎng)的方式CHO 細胞培養(yǎng)生產(chǎn)工藝可以分為批次培養(yǎng)（Batch）、補料批次培養(yǎng)（Fed-Batch）、連續(xù)培養(yǎng)。連續(xù)培養(yǎng)又包括濃縮補料培養(yǎng)（ConcentratedFedbatch）和灌流（注）培養(yǎng)（Perfusion）等。在細胞培養(yǎng)工藝開發(fā)中，需要根據(jù)各個項目的不同特點，如宿主細胞的性質(zhì)、宿主細胞在培養(yǎng)環(huán)境中能夠維持的培養(yǎng)周、細胞表達產(chǎn)品的穩(wěn)定性等方面綜合評估后選擇合適的培養(yǎng)方式。

3.1 批培養(yǎng)方式的應用

批培養(yǎng)方式相比其他培養(yǎng)方式，因為在培養(yǎng)過程中不需要進行補加營養(yǎng)物的操作，所以在生產(chǎn)過程中需要的操作少，減少了培養(yǎng)過程中微生物污染的風險。另一方面由于不進行補料操作，培養(yǎng)環(huán)境中的營養(yǎng)物的含量在培養(yǎng)開始時已經(jīng)確定，隨著細胞的生長營養(yǎng)物不斷減少，代謝產(chǎn)物持續(xù)升高，所以生產(chǎn)周期相對較短，對于宿主細胞本身不能維持長期生長、細胞表達產(chǎn)品在培養(yǎng)液中容易產(chǎn)生降解、聚集等質(zhì)量變化的項目更為適合。

3.2 補料批培養(yǎng)方式的應用

由于批培養(yǎng)過程中隨著細胞生長，培養(yǎng)液中的營養(yǎng)物持續(xù)下降，代謝產(chǎn)物持續(xù)增加，限制了細胞培養(yǎng)的周期，進一步限制了目的蛋白的表達量。隨著細胞生長而逐漸降低的營養(yǎng)物，為細胞的生長提供所需營養(yǎng)。所以相比于不補料的批培養(yǎng)方式，補料批培養(yǎng)一般能得到更高的細胞密度，更長的細胞培養(yǎng)周期，更高的蛋白表達量。補料批培養(yǎng)方式也是目前應用最多，技術發(fā)展最完善的培養(yǎng)方式。雖然補料批培養(yǎng)方式能向培養(yǎng)體系中補充已經(jīng)消耗的營養(yǎng)物，為細胞生長持續(xù)提供營養(yǎng)，但隨著細胞密度的增加，細胞消耗越來越多的營養(yǎng)同時代謝出越來越多的代謝廢物，而這些代謝廢物無法從培養(yǎng)環(huán)境中被分離，最終仍然會導致細胞活率的下降，細胞培養(yǎng)周期一般也較為固定，目前多數(shù)的補料批培養(yǎng)工藝的周期約12-18 天。

3.3 連續(xù)培養(yǎng)

由于補料批培養(yǎng)方式只能向培養(yǎng)體系中補充營養(yǎng)物，無法將細胞代謝產(chǎn)生的副產(chǎn)物從培養(yǎng)環(huán)境中去除，所以細胞在培養(yǎng)到一定時間后仍然會出現(xiàn)細胞活率下降的現(xiàn)象。所以在細胞培養(yǎng)工藝的不斷幾步中，發(fā)展出了濃縮補料培養(yǎng)和灌注培養(yǎng)兩種培養(yǎng)模式，這兩種新的培養(yǎng)模式都能很好的解決了培養(yǎng)環(huán)境中細胞代謝廢物對細胞的副作用。

濃縮補料培養(yǎng)法由于不能將目的蛋白從培養(yǎng)液中分離，所以在培養(yǎng)過程中，目的蛋白的濃度在不斷升高，對于那些在培養(yǎng)液中不穩(wěn)定的目的蛋白并不適用。而灌注培養(yǎng)法在培養(yǎng)的過程中不斷地將目的蛋白從培養(yǎng)液中分離，而只把細胞截留在培養(yǎng)液中，所以目的蛋白在從細胞內(nèi)被表達到胞外后，即可在較短的時間內(nèi)進入到純化環(huán)節(jié)，可以將目的蛋白與宿主細胞自身表達的酶分離。

4 培養(yǎng)基

本研究采用的培養(yǎng)基均為目前應用廣泛的商業(yè)化培養(yǎng)基，配方如表1。

表1 培養(yǎng)基配方

5 結語

隨著醫(yī)藥行業(yè)的不斷發(fā)展，生物醫(yī)學越來越受到人們的關注，作為生物醫(yī)學的重要組成部分，單克隆抗體在CHO 細胞中的大規(guī)模培養(yǎng)和表達技術越來越多。通過對其CHO 細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基優(yōu)化、培養(yǎng)參數(shù)分析及工藝的放大等研究分析來實現(xiàn)CHO 細胞大規(guī)模培養(yǎng)表達單克隆抗體生產(chǎn)工藝的穩(wěn)定性，進而推動單克隆抗體產(chǎn)業(yè)在醫(yī)藥領域的不斷向前發(fā)展。