微塑料（MPs）與三氯生（TCS）復(fù)合暴露對普通小球藻的毒性研究

俞博浩 張德勇

【摘 ?要】為分析微塑料（MPs）與三氯生（TCS）兩種污染物聯(lián)合暴露對普通小球藻的毒性效應(yīng)，首先通過單獨(dú)染毒實(shí)驗(yàn)證實(shí)了MPS、TCS均會抑制藻類的增殖速度，其96h-EC50值分別為95.85和17.46 mg/L，且檢測到葉綠素含量、抗氧化酶活力、可溶性蛋白含量下降及MDA含量升高。聯(lián)合染毒實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了MPs與TCS復(fù)合暴露時仍會出現(xiàn)上述毒性效應(yīng)，但各指標(biāo)的聯(lián)合毒性普遍低于單獨(dú)染毒的效應(yīng)加和值，即呈現(xiàn)出一定的拮抗效應(yīng)。另外，不同劑量組的比較顯示，當(dāng)染毒物質(zhì)劑量提高后，這種拮抗效應(yīng)通常會有所減弱。

【關(guān)鍵詞】微塑料（MPs）;三氯生（TCS）;普通小球藻;復(fù)合暴露;毒性效應(yīng)

微塑料（MPs）指直徑小于5 mm的塑料碎片、顆粒及纖維，因其體積小而易于進(jìn)入生物體內(nèi)[1]。塑料的使用已有100多年歷史，近年來微塑料幾乎在世界各地的水域被檢測到。據(jù)分析，北太平洋副熱帶環(huán)流中微塑料的數(shù)量高達(dá)32.76個/m3和250 mg/m3[2]。我國渤海海岸微塑料達(dá)103-163個/kg，海水浴場等人類活動頻繁的地區(qū)尤其高。除了海洋，在淡水生態(tài)中也發(fā)現(xiàn)了微塑料，我國太湖表層水中豐度可達(dá)3.4-25.8個/L，沉積物中的微塑料為11-235 個/kg[3]。三氯生（TCS）則是一種化工產(chǎn)品，作為殺菌劑被廣泛添加于紡織品、洗衣粉、除臭劑、護(hù)膚品和個人衛(wèi)生用品中。TCS長期被大量生產(chǎn)和應(yīng)用，全世界年使用量估計在750×103噸以上。生物降解和光降解不足以高效清除TCS，加上其強(qiáng)親脂性，使得TCS在環(huán)境中的濃度不斷上升，并在生物體內(nèi)逐漸富集。目前，環(huán)境中已經(jīng)普遍污染有TCS，國內(nèi)外陸續(xù)有在環(huán)境中檢出TCS的報道[4]。MPs與TCS已經(jīng)成為當(dāng)前水環(huán)境中比較常見的兩種污染物，甚至在各級生物的體內(nèi)也普遍檢測到了它們的存在，因此它們對生態(tài)系統(tǒng)的威脅一直是備受關(guān)注的熱點(diǎn)環(huán)境問題，其生態(tài)毒性值得深入研究。

藻類是水生生態(tài)系統(tǒng)中的初級生產(chǎn)者，處于食物鏈底端，評價MPs和TCS對藻類的毒性效應(yīng)可以為全面認(rèn)識其生態(tài)危害提供很好的切入點(diǎn)。盡管有少量報道證實(shí)MPs對藻類的毒性可表現(xiàn)為可抑制細(xì)胞生長、破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)、降低葉綠素含量和光合效率、引起細(xì)胞氧化損傷等，且毒性大小與微塑料本身的種類、大小、濃度等有關(guān)[5-7]。但總體而言，當(dāng)前關(guān)于MPs、TCS的毒性效應(yīng)及其機(jī)制的研究尚不夠系統(tǒng)，針對藻類的研究尤其不足。且當(dāng)前研究絕大多數(shù)采用了MPs單獨(dú)染毒方式，獲得的結(jié)果遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能反映實(shí)際環(huán)境中MPs因和其他污染物共同存在可能導(dǎo)致的復(fù)合效應(yīng)。為分析MPs與其他污染物聯(lián)合暴露對淡水藻類具有何種效應(yīng)并初步揭示其產(chǎn)生機(jī)制，本研究擬評價不同劑量的MPs與TCS聯(lián)合染毒后，對普通小球藻的增殖、光合作用、抗氧化能力等方面的毒性效應(yīng)及其與單獨(dú)染毒的差異。

1 材料與方法

1.1 藻類培養(yǎng)及染毒方案

普通小球藻（Chlorella vulgaris）購自中科院水生所;培養(yǎng)基為水生4號;培養(yǎng)條件為25℃、12h/12h光暗循環(huán)[8]。染毒實(shí)驗(yàn)中，MPs設(shè)計了1.34、11.47 mg/L兩個劑量，TCS設(shè)計了0.077、0.230 mg/L兩個劑量，然后按照下文中表1所示的方案，進(jìn)行單獨(dú)與聯(lián)合染毒，染毒后繼續(xù)培養(yǎng)96h然后分析各指標(biāo)。

1.2 藻類生物量的光密度分析法的建立

首先對藻液進(jìn)行全波長掃描，找出特征吸收峰。然后分別利用吸光度法與顯微鏡計數(shù)法建立藻濃度與吸光度值之間的回歸方程。

1.3 藻類的生長抑制效應(yīng)分析及96h-EC50值計算

基于A690值繪制生長曲線，建立抑制率P和濃度的自然對數(shù)LnC的線性回歸關(guān)系，求解抑制率為50%的濃度值即EC50值。抑制率P（%）=（對照組A690-處理組A690）/對照組A690

1.4 藻類的葉綠素含量測定

藻液用高速離心法提取，加1.5mL乙醇和少許石英砂研磨，轉(zhuǎn)入離心管定容到10mL，于4℃黑暗提取12h;4000rpm離心10min;上清于比色管中用90%乙醇定容10mL。于比色皿中，測吸光值。葉綠素a濃度（mg/L）=（11.64A633+2.16A645+0.10A630）V1/1000V2。式中V1為提取液定容體積（mL）;V2為濾液體積（L）。

1.5 抗氧化酶活性測定

1.5.1 SOD活性測定

收集藻細(xì)胞，研磨、離心，取上清為SOD粗提液。采用鄰苯三酚自氧化法測定SOD活力，再按照2.35mL Tris-HCl緩沖液、1.8mL蒸餾水、0.15mL鄰苯三酚溶液、200μL樣液的反應(yīng)體系測定ΔA325。U=[（A325-ΔA325）/ΔA325×100%]/50%×Vs×D/V總。

1.5.2 POD活性測定

藻細(xì)胞破壁后，上清充分轉(zhuǎn)入25mL容量瓶定容。取比色皿加入反應(yīng)混合液3 mL和酶液1 mL。立即開啟秒表記錄A470，每隔1 min讀數(shù)1次，共5 min。U=（A470×0. 01×W ×t）×樣品稀釋倍數(shù)。

1.5.3 CAT活性測定

藻細(xì)胞破壁后，加入3mL0.05mol/L pH7.8 PBS，再加入200μL 30%H2O2迅速搖勻，1分鐘后開始，每1 min記錄1次A240，連續(xù)記錄5min。U=ΔA240×Vt/W/Vs/0.01/t。

1.6可溶性蛋白含量測定

取4mL藻液，離心后沉淀重懸于10?L Loarding buffer，煮沸10 min，離心取上清，SDS-PAGE電泳分析蛋白表達(dá)。另外，取破壁離心后的上清于1 cm光程石英比色皿中測定A280值和A260值，按公式計算可溶性蛋白含量。

1.7 MDA活性測定

藻液離心后加10%TCA研磨，勻漿液12000rpm離心10min。取2mL上清于試管，加入0.6%硫代巴比妥酸2mL，沸水浴10min。4500rpm離心10min，取上清測吸光度。MDA濃度=6.45（A532-A600）-0.56×A450。

1.8 統(tǒng)計分析

采用SPSS軟件的單因素方差分析法（One Way ANOVA）分析處理組與對照組之間的差異顯著性，p<0.05為顯著。

2 結(jié)果

2.1藻類生物量的光度分析法的建立

連續(xù)波長掃描顯示，普通小球藻在690 nm處有較明顯的吸收峰，可用于建立藻類生物量的分析方法;故基于藻液的密度與其A690值之間的規(guī)律性建立了線性回歸方程：y=0.025x+0.0403;R?=0.9613。二者具有較理想的線性關(guān)系，可用于快速測定藻類生物量。

2.2 MPs、TCS染毒對普通小球藻的增殖速度的影響

如圖1所示，MPs及TCS單獨(dú)染毒對小球藻均有抑制效應(yīng)，其96h-EC50值分別為95.85 mg/L和17.46 mg/L。聯(lián)合染毒則均呈現(xiàn)為拮抗作用，即MPs+TCS聯(lián)合染毒引起的抑制率小于單獨(dú)染毒的抑制率之和。

2.3 MPs、TCS染毒對普通小球藻葉綠素含量的影響

各組的葉綠素含量結(jié)果為：陰性對照組1.367 mg/L、M1組0.148 mg/L、M2組0.572 mg/L、T1組0.847 mg/L、T2組0.843 mg/L、M1T1組0.549 mg/L、M1T2組1.028 mg/L、M2T1組 0.681 mg/L、M2T2組0.698 mg/L。因此，MPs、TCS單獨(dú)染毒均導(dǎo)致了小球藻葉綠素含量下降。4個聯(lián)合染毒組的降幅（依次為0.818、0.339、0.686、0.669 mg/L）均小于相應(yīng)的單獨(dú)染毒組的加和值（依次為1.739、1.743、1.315、1.319 mg/L），故聯(lián)合效應(yīng)主要表現(xiàn)為拮抗效應(yīng)。

2.4 MPs、TCS染毒對普通小球藻抗氧化酶活性的影響

單獨(dú)染毒下三種物質(zhì)對藻類的抗氧化酶活性均有抑制效應(yīng)（p<0.05）。聯(lián)合效應(yīng)可通過比較聯(lián)合染毒組的抑制值與單獨(dú)染毒組的抑制值進(jìn)行比較判斷（表1）。如表1所示，對于SOD活力，4個聯(lián)合染毒組的抑制值分別為7.732、9.181、8.215、10.148 U/g，均小于相應(yīng)的單獨(dú)染毒組的加和值（依次為10.148、13.047、12.081、14.980 U/g）;對于POD活力，4個聯(lián)合染毒組的抑制值分別為0.402、0.454、0.418、0.485 U/g，均小于相應(yīng)的單獨(dú)染毒組的加和值（0.671、0.720、0.695、0.744 U/g）;對于CAT活力，4個聯(lián)合染毒組的抑制值分別為36、40、36、48 U/g，均小于相應(yīng)的單獨(dú)染毒組的加和值（32、52、48、68 U/g）;因此對于3種抗氧化酶，聯(lián)合染毒組的抑制值均小于單獨(dú)染毒直接相加之和，故MPs與TCS聯(lián)合染毒時對抗氧化酶的抑制效應(yīng)均呈現(xiàn)為拮抗效應(yīng)。

2.5 MPs、TCS染毒對普通小球藻可溶性蛋白含量的影響

各組的可溶性蛋白含量結(jié)果為：陰性對照組1.169 mg/mL、M1組1.064 mg/mL、M2組0.928 mg/mL、T1組0.614 mg/mL、T2組0.731 mg/mL、M1T1組0.534 mg/mL、M1T2組0.674 mg/mL、M2T1組 0.629 mg/mL、M2T2組0.752 mg/mL。MPs和TCS染毒均導(dǎo)致小球藻的可溶性蛋白含量下降。4個聯(lián)合染毒組的降幅（依次為0.635、0.495、0.540、0.417 mg/mL）均小于相應(yīng)的單獨(dú)染毒組的加和值（依次為0.660、0.543、0.796、0.680 mg/mL），故聯(lián)合染毒均表現(xiàn)為拮抗效應(yīng)。

2.6 MPs、TCS染毒對普通小球藻MDA含量的影響

各組的可MDA含量結(jié)果為：陰性對照組0.295 mg/mL、M1組0.993 mg/mL、M2組1.179 mg/mL、T1組0.932 mg/mL、T2組0.883 mg/mL、M1T1組0.467 mg/mL、M1T2組0.877 mg/mL、M2T1組0.733 mg/mL、M2T2組0.191 mg/mL。MPs和TCS染毒普遍導(dǎo)致小球藻的MDA含量升高。4個聯(lián)合染毒組的升幅（依次為0.172、0.582、0.438、-0.104 mg/mL）均小于相應(yīng)的單獨(dú)染毒組的加和值（依次為1.335、1.286、1.521、1.472 mg/mL），故聯(lián)合染毒均表現(xiàn)為拮抗效應(yīng)。

3討論

當(dāng)前MPs、TCS已成為引人關(guān)注的重要污染物。水中的MPs會被生物誤以為浮游生物而主動對其進(jìn)行捕食，從而進(jìn)入生態(tài)系統(tǒng)的食物鏈。研究發(fā)現(xiàn)許多水生動物的胃、消化管、肌肉等組織和器官中均含有微塑料存在。近來甚至在人體內(nèi)也普遍檢測到了微塑料的存在，且種類多達(dá)數(shù)十種。TCS也被國內(nèi)外眾多研究者證實(shí)對許多生物具有的毒性效應(yīng)，且影響的器官系統(tǒng)不一而足，包括生殖毒性、內(nèi)分泌干擾效應(yīng)、肝腎毒性、免疫系統(tǒng)毒性、DNA損傷與遺傳毒性等[9-11]。藻類是水生生態(tài)系統(tǒng)的生產(chǎn)者，MPs對藻類的影響關(guān)系到整個水生生態(tài)系統(tǒng)的維系。在本研究中，MPs被證實(shí)能抑制普通小球藻的增殖，并引起葉綠素含量、抗氧化能力等的下降等，這一結(jié)論與與以往在其他藻類上的研究報道基本一致（雖然以往某些研究稱觀察到同時促進(jìn)和抑制藻類生長的所謂“雙重效應(yīng)”，但屬于個例，在本研究所采用的普通小球藻上未觀察到此情況）。同時，與以往研究不同，本研究更側(cè)重于考察MPs與其他污染物聯(lián)合暴露時呈現(xiàn)的毒性效應(yīng)。除了葉綠素指標(biāo)有點(diǎn)例外，在所研究的絕大多數(shù)指標(biāo)中，我們均證實(shí)了MPs、TCS聯(lián)合暴露時，會呈現(xiàn)一定的拮抗效應(yīng)，即聯(lián)合毒性低于兩種物質(zhì)單獨(dú)暴露引起的毒性之和。這一現(xiàn)象以往罕有探討，初步分析其原因可能是MPs具有較強(qiáng)的吸附性和漂浮性，導(dǎo)致其他污染物能被吸附在其顆粒上而無法發(fā)揮對藻類的毒性。另外，結(jié)果也顯示當(dāng)染毒劑量雙雙升高時，拮抗效應(yīng)往往有所減弱。

本研究在評估藻類的狀態(tài)采用了葉綠素、抗氧化狀態(tài)、蛋白表達(dá)、可溶性蛋白含量幾個重要指標(biāo)。葉綠素是光合作用的執(zhí)行者，測定葉綠素含量可以了解植物物質(zhì)轉(zhuǎn)化的程度和速度，其含量高低直接反映藻類的生長繁殖能力。從本研究的結(jié)果看，MPs和TCS對葉綠素含量有嚴(yán)重的影響，雖然聯(lián)合染毒有一定的拮抗效應(yīng)，但對于緩解這種毒性效應(yīng)實(shí)際意義不大。藻類的抗氧化能力的強(qiáng)弱與健康程度存在著密切聯(lián)系，抗氧化酶的活力有助于大致藻類的健康狀況。為了充分評估普通小球藻的抗氧化狀態(tài)，分別測定了3種抗氧化酶的活力。其中SOD是負(fù)責(zé)清除氧自由基的酶，POD藻類體內(nèi)負(fù)責(zé)分解過氧化物的酶，CAT是能夠催化過氧化氫分解為水和分子氧，這三者均是藻類抗氧化損傷、清除代謝廢物的關(guān)鍵物質(zhì)，對藻類的生長代謝非常重要。從本研究的結(jié)果看，MPs和TCS對小球藻的三種抗氧化酶均有顯著影響，可導(dǎo)致其活性顯著降低。單獨(dú)染毒組引起SOD活力的降幅在4.349-7.732 U/g，聯(lián)合染毒組引起的降幅在7.732-10.148 U/g范圍;單獨(dú)染毒組引起POD活力的降幅在0.283-0.412 U/g，聯(lián)合染毒組引起的降幅在0.402-0.485 U/g范圍;單獨(dú)染毒組引起CAT活力的降幅在16-36 U/g，聯(lián)合染毒組引起的降幅在36-48 U/g范圍。可溶性蛋白質(zhì)有助于藻類對抗環(huán)境脅迫，還能增加細(xì)胞滲透濃度和功能蛋白的數(shù)量，有助于維持細(xì)胞正常代謝，因此也是反映抗逆狀態(tài)的指標(biāo)。在本研究中，低劑量的MPs對可溶性蛋白產(chǎn)生的毒性效應(yīng)微小，但POFS結(jié)合后則會產(chǎn)生協(xié)同作用，大大增強(qiáng)TCS對可溶性蛋白的毒性。MDA是膜脂過氧化作用的最終分解產(chǎn)物，其含量反映藻類遭受逆境傷害的程度。MPs在本研究被證實(shí)對藻類的細(xì)胞膜能夠造成嚴(yán)重危害，并且在MPs與TCS聯(lián)合染毒中對MDA含量存在著協(xié)同作用。這進(jìn)一步增強(qiáng)了染毒物對藻類細(xì)胞膜的破壞。

本研究的結(jié)果顯示，水體中多種污染物同時存在時，其聯(lián)合效應(yīng)非常復(fù)雜和微妙。如微塑料雖然對藻類有明顯的毒性，如破壞其光合作用、損害其抗氧化能力、影響某些生化分子的濃度等，但同時也可能在一定程度上減緩了其他污染物的毒性。當(dāng)然，本研究僅僅是對聯(lián)合毒性效應(yīng)的初步探索，其中涉及的具體分子機(jī)制尚待進(jìn)一步揭示，例如微塑料與其他污染物的拮抗效應(yīng)是通過何種機(jī)制發(fā)生的？是僅僅由于物理性的吸附，還是涉及到某些化學(xué)變化？微塑料與其他污染物相結(jié)合及解離的規(guī)律性是怎樣的？諸多問題值得進(jìn)一步探討。

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作者簡介：

俞博浩，2000年6月出生，男，漢族，浙江舟山人，本科生，研究方向?yàn)樯锕こ獭?/p>

通訊作者：

張德勇，1978年4月出生，男，漢族，山東聊城人，博士生，教授，研究方向?yàn)槎纠砩鷳B(tài)學(xué)。

基金項目：

本研究受浙江樹人大學(xué)實(shí)驗(yàn)室開放項目（2021JS3012）資助