馮學軒,劉月姝,饒子亮,黎耀俊,潘曉慧,姚嘉琪,郭起岳,王 諾,鄺少松

(廣東省醫(yī)學實驗動物中心,廣州 528248)

高尿酸血癥(hyperuricemia,HUA)是指由于嘌呤代謝異常導致的以高尿酸為特征的代謝性疾病,是引起痛風性關(guān)節(jié)炎的生化基礎,長期持續(xù)的高尿酸血癥,將大大增加尿酸鹽在腎及關(guān)節(jié)處的沉積,引起痛風及腎臟病變,使得腎病發(fā)病率及死亡率升高,抗高尿酸藥物的研發(fā)亦因此成為熱點[1-2]。 臨床上治療高尿酸血癥的藥物,有用于治療急性發(fā)作的,也有用于治療慢性疾病的,對于不同藥物的研發(fā),需要應用不同類型的疾病模型,合適的動物模型能夠為藥物的研發(fā)夯實基礎。 為此,本實驗在前期研究基礎上,結(jié)合大小鼠體內(nèi)存在尿酸酶代謝系統(tǒng),可將尿酸代謝成水溶性高的尿素通過尿液排出體外的特點[3-4],采用次黃嘌呤聯(lián)合尿酸酶抑制劑氧嗪酸鉀建立小鼠急性高尿酸血癥模型[5-6],采用腺嘌呤聯(lián)合尿酸排泄抑制藥物乙胺丁醇建立大鼠慢性高尿酸血癥模型型[7-8],并對模型的指征進行生化及病理學上的檢測,同時采用陽性藥別嘌醇片考察模型的可治愈性,為用于治療急性或慢性高尿酸血癥藥物的研發(fā)提供相應的模型工具及基礎數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

30 只SPF 級C57BL/6 小鼠、30 只SPF 級SD 大鼠,雄性,由廣東省醫(yī)學實驗動物中心提供[SCXK(粵) 2018-0002]。 動物飼養(yǎng)在SPF 級動物房[SYXK (粵) 2018-0002],飼養(yǎng)溫度與濕度:20℃～26℃,40%～70%,采用10 h:14 h 晝夜間斷照明。動物自由進食和飲水,所有飼料和飲用水均由廣東省醫(yī)學實驗動物中心提供。 試驗倫理編號:B201607-2。 本試驗涉及的與動物試驗相關(guān)的內(nèi)容和程序遵從實驗動物使用和管理的相關(guān)法律法規(guī)及廣東省醫(yī)學使用動物中心實驗動物倫理委員會的相關(guān)規(guī)定,保證實驗動物的福利。

1.2 主要試劑與儀器

別嘌醇片:批號150403,重慶青陽藥業(yè)有限公司生產(chǎn);次黃嘌呤:批號SLBQ1672 V,Sigma 公司生產(chǎn);腺嘌呤:批號WXBB5072 V,Sigma 公司生產(chǎn);氧嗪酸鉀:批號STBD5759 V,Sigma 公司生產(chǎn);乙胺丁醇鹽酸鹽:批號WXBC0611 V,Sigma 公司生產(chǎn);羧甲基纖維素鈉(CMC-Na):批號2015 年1 月19 日,天津市大茂化學試劑廠生產(chǎn);肌酐試劑盒:批號20160222,尿素氮試劑盒:批號20160312,尿酸試劑盒:批號20160312,均購自上?？迫A生物工程股份有限公司;XOD 試劑盒:批號160705,南京建成生物工程研究所生產(chǎn);戊巴比妥鈉:批號160606,德國默克生產(chǎn)。 BS-3000 A 電子分析天平,感量:0.1 g,上海友聲衡器有限公司生產(chǎn);BS224S 電子分析天平,感量:0.1 mg,賽多利斯科學儀器(北京)科技有限公司生產(chǎn);KDC-2046 低速冷凍離心機,科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司生產(chǎn);T10 basic 高速分散器,IKA 公司生產(chǎn);7020 型全自動生化分析儀,日本株式會社日立高新技術(shù)公司生產(chǎn);RM2135 輪轉(zhuǎn)切片機,德國LEICA 公司生產(chǎn);ASP300S 生物組織全自動脫水機,德國LEICA 公司生產(chǎn);EG1150 生物組織包埋機及冷凍機,德國LEICA 公司生產(chǎn);CS-VI 攤片烤片機,湖北孝感醫(yī)用儀器有限公司生產(chǎn);AutoStainer-XL 生物組織全自動染色機,德國LEICA公司生產(chǎn);BX41 型熒光顯微鏡,日本奧林巴斯公司生產(chǎn);CellSens Standard 顯微圖像軟件,日本奧林巴斯公司提供。

1.3 實驗方法

1.3.1 急性高尿酸血癥小鼠模型

30 只C57BL/6 小鼠檢疫結(jié)束后,按體重隨機分為正常對照組、模型對照組、陽性對照組,10 只/組。模型對照組及陽性對照組小鼠腹腔注射50 mg/mL次黃嘌呤溶液同時皮下注射20 mg/mL 氧嗪酸鉀溶液,正常對照組同法注射0.5%羧甲基纖維素鈉溶液,注射體積為10 mL/kg 體質(zhì)量。 造模30 min 后陽性對照組按20 mL/kg 體質(zhì)量灌胃5 mg/mL 別嘌醇藥液,正常對照組及模型對照組同法灌胃0.5%CMC-Na 溶液。 造模2 h 后各組動物眼眶靜脈竇采血后頸椎脫臼處死,3000 r/min 離心10 min 取血清,用于各指標檢測,取肝,生理鹽水冰浴勻漿制備10%的組織勻漿液,進行XOD 活性檢測。

1.3.2 慢性高尿酸血癥大鼠模型

30 只SD 大鼠檢疫結(jié)束后,按體重隨機分為正常對照組、模型對照組、陽性對照組,10 只/組。 除正常對照組外,其余各組動物每天上午按5 mL/kg體質(zhì)量灌胃30 mg/mL 的腺嘌呤溶液及50 mg/mL的乙胺丁醇鹽酸鹽溶液造模,兩藥灌胃相隔約2 h,正常對照組同法灌胃純凈水,1 次/d,連續(xù)21 d。 與造模相隔4 h,陽性對照組動物按10 mL/kg 體質(zhì)量灌胃別嘌呤醇藥液,正常對照組及模型對照組同法灌胃0.5% CMC-Na 溶液,1 次/d,連續(xù)21 d。 末次給藥1.5 h 后,各組大鼠按60 mg/kg 體質(zhì)量腹腔注射3%戊巴比妥鈉溶液麻醉,腹主動脈采血后放血處死,3000 r/min,離心10 min 取血清,用于各指標檢測,同時取肝檢測XOD 活性,取腎進行組織病理學檢測。

1.3.3 指標檢測

(1)體重:慢性高尿酸血癥大鼠模型每周稱量動物體重一次。

(2)急性高尿酸血癥小鼠模型:檢測血尿酸、血肌酐、血清尿素氮及肝XOD 活性。

(3)慢性高尿酸血癥大鼠模型:檢測血尿酸、血肌酐、血清尿素氮、肝XOD 活性。 取右腎10%福爾馬林固定后HE 染色,按表1 進行腎小管間質(zhì)損傷半定量評分,按表2 進行腎炎性細胞浸潤半定量評分。 腎小管間質(zhì)損傷定義為炎癥細胞浸潤,小管萎縮/代償性擴張、間質(zhì)纖維化、殘余腎單位肥大。 取左腎,無水乙醇固定,Gomori 六胺銀法染色進行尿酸鹽結(jié)晶觀察,按表3 進行評分。

表1 腎小管間質(zhì)損傷半定量評分標準Table 1 Semiquantitative criteria for renal tubular interstitial injury

表2 腎臟炎性細胞浸潤半定量評分標準Table 2 Semiquantitative criteria for renal inflammatory cell infiltration

表3 尿酸鹽結(jié)晶評分標準Table 3 Urate crystal scoring criteria

1.4 統(tǒng)計學方法

所有數(shù)據(jù)采用平均數(shù)±標準差( ˉx ±s)表示,應用SPSS 21.0 軟件進行統(tǒng)計分析;計量資料數(shù)據(jù)方差齊,或數(shù)據(jù)經(jīng)轉(zhuǎn)換后方差齊,則采用組間兩兩比較的單因素方差分析方法;若數(shù)據(jù)經(jīng)轉(zhuǎn)換后方差仍不齊,采用秩和檢驗進行統(tǒng)計分析。 檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 體重測量結(jié)果

慢性高尿酸血癥大鼠模型:與正常對照組相比,模型對照組體重在d8 ～d21 下降有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。 與模型對照組相比,陽性對照組體重無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)(見圖1)。

為保證測繪檔案的信息化管理應用效果和提高綜合查詢服務能力，系統(tǒng)建立后，要做好檔案管理的維護，及時更新，發(fā)布最新的歸檔數(shù)據(jù)。在整理出數(shù)據(jù)后，檔案管理員要仔細核對數(shù)據(jù)清單，保證入庫檔案數(shù)據(jù)無誤后發(fā)布。不同單位應根據(jù)歸檔情況和著錄情況來確定更新頻率，但至少保證每半年更新一次，漳州市測繪設計研究院是基于一張圖平臺實現(xiàn)了全部測繪檔案信息的實時入庫管理，入庫后的歸檔信息如圖4所示。

圖1 體重測量結(jié)果Figure 1 Body weight measurement results

2.2 血尿酸

2.2.1 急性高尿酸血癥小鼠模型

與正常對照組相比,模型對照組血尿酸顯著升高,有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。 與模型對照組相比,陽性對照組血尿酸顯著下降有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。 見表4。

2.2.2 慢性高尿酸血癥大鼠模型

與正常對照組相比,模型對照組血尿酸顯著升高,有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。 與模型對照組相比,陽性對照組血尿酸值顯著下降,有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。 見表5。

2.3 血肌酐

2.3.1 急性高尿酸血癥小鼠模型

與正常對照組相比,模型對照組血肌酐顯著升高,有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。 與模型對照組相比,陽性對照組血肌酐值無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。 見表4。

2.3.2 慢性高尿酸血癥大鼠模型

2.4 血清尿素氮

2.4.1 急性高尿酸血癥小鼠模型

與正常對照組相比,模型對照組血清尿素氮無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。 與模型對照組相比,陽性對照組血清尿素氮無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。 見表4。

2.4.2 慢性高尿酸血癥大鼠模型

與正常對照組相比,模型對照組血清尿素氮顯著升高,有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。 與模型對照組相比,陽性對照組血清尿素氮無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。 見表5。

2.5 肝XOD 活性

2.5.1 急性高尿酸血癥小鼠模型

與正常對照組相比,模型對照組肝XOD 活性無統(tǒng)計學差異(P＞0.05),與模型對照組相比,陽性對照組肝XOD 活性無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。 見表4。

2.5.2 慢性高尿酸血癥大鼠模型

與正常對照組相比,模型對照組肝XOD 活性顯著升高,有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。 與模型對照組相比,陽性對照組肝XOD 活性顯著下降,有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。 見表5。

表4 急性高尿酸血癥小鼠血尿酸、血肌酐、血清尿素氮及肝XOD 活性檢測結(jié)果( ˉx ±s,n=10)Table 4 Results of serum uric acid, serum creatinine, serum urea nitrogen, and liver XOD activity in acute hyperuricemia mice

表5 慢性高尿酸血癥大鼠血尿酸、血肌酐、血清尿素氮及肝XOD 活性檢測結(jié)果( ˉx ±s,n=10)Table 5 Results of serum uric acid, serum creatinine, serum urea nitrogen, and liver XOD activity in chronic hyperuricemia mice

2.6 慢性高尿酸血癥大鼠組織病理學結(jié)果

2.6.1 腎病理檢查結(jié)果

模型對照組所有動物均見腎損傷,表現(xiàn)為大量腎小管變性、壞死,腎小管尿酸鹽沉積,腎小管擴張,部分腎小管見炎性細胞浸潤,少量腎小管見細胞管型。 陽性對照組可見腎損傷有一定程度修復,損傷程度較模型對照組輕,表現(xiàn)為部分腎小管變性,腎小管擴張、尿酸鹽沉積情況明顯改善,僅少量腎小管內(nèi)見尿酸鹽沉積。 見圖2、3。

2.6.2 腎炎性細胞浸潤結(jié)果

與正常對照組相比,模型對照組腎炎性細胞浸潤評分顯著升高,有統(tǒng)計學差異(P＜0.01)。 與模型對照組相比,陽性對照組腎炎性細胞浸潤評分顯著下降,有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。 見表6、圖4。

2.6.3 腎小管間質(zhì)損傷及尿酸鹽結(jié)晶評分結(jié)果

與正常對照組相比,模型對照組腎小管間質(zhì)損傷及尿酸鹽結(jié)晶評分均顯著升高,有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。 與模型對照組相比,陽性對照組二者評分均顯著下降,有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。 見表6。

表6 慢性高尿酸血癥大鼠腎炎性細胞浸潤、腎小管間質(zhì)損傷、尿酸鹽結(jié)晶評分結(jié)果( ˉx ±s,n=10,%)Table 6 Results of renal inflammatory cell infiltration, renal tubular interstitial injury, and urate crystal score in chronic hyperuricemia rats

圖2 慢性高尿酸血癥對大鼠腎臟病理的影響(HE 染色)Figure 2 Effects of chronic hyperuricemia on renal pathology in rats. HE staining

圖3 慢性高尿酸血癥大鼠腎臟尿酸鹽結(jié)晶情況(Gomori 六胺銀染色)Figure 3 Renal urate crystallization of rats with chronic hyperuricemia. Gomori hexamine silver staining

圖4 慢性高尿酸血癥大鼠腎臟炎性細胞浸潤情況(HE 染色)Figure 4 Renal inflammatory cell infiltration of rats with chronic hyperuricemia. HE staining

3 討論

高尿酸血癥(HUA)在我國的發(fā)病率日趨升高,沿海發(fā)達城市發(fā)病率甚至高達25%,因此建立合適的HUA 模型以便開展藥物研發(fā)成為了研究的熱點。在眾多的研究中,部分學者會選擇單用尿酸前體物質(zhì)如腺嘌呤、次黃嘌呤或單用尿酸排泄抑制劑如氧嗪酸鉀、乙胺丁醇等進行造模[8],如Zhao[5]、Hu[6]等學者采用氧嗪酸鉀建立HUA 模型,楊佳梅等[7]學者則單用腺嘌呤或氧嗪酸鉀建模。 但氧嗪酸鉀和腺嘌呤的造模機理并不一樣,單用氧嗪酸鉀造模會忽略了人們飲食結(jié)構(gòu)改變,高嘌呤食物攝入增加這一臨床誘因;單用腺嘌呤造模則忽略了嚙齒類動物與人尿酸代謝的差異性:人不可將尿酸代謝而大小鼠卻可通過尿酸酶將尿酸代謝成尿素后排出。因此,本研究綜合上述因素,在模擬臨床發(fā)病誘因的同時結(jié)合大小鼠的尿酸代謝特點,采用尿酸前體物質(zhì)聯(lián)合尿酸排泄抑制劑建模,此舉可降低每種造模劑的劑量,起到提高成模率的同時降低不必要的毒副作用,更好地建立高尿酸血癥動物模型[8-11]。

本實驗之所以采用次黃嘌呤結(jié)合氧嗪酸鉀建立急性高尿酸血癥模型,原因在于次黃嘌呤只需代謝成黃嘌呤即可形成尿酸,代謝路徑較短,可快速形成尿酸[10],而氧嗪酸鉀與尿酸的嘌呤環(huán)相似,可抑制尿酸酶的活性,快速減少尿酸的分解[12],二者結(jié)合能夠在較短時間內(nèi)引起血尿酸升高,起到模擬高尿酸血癥急性發(fā)作的特點。 人體高尿酸血癥的急性發(fā)作在于一次性攝入高嘌呤物質(zhì),而體內(nèi)未能及時將其代謝,因此出現(xiàn)血尿酸的急性升高及輕微的腎損傷(表現(xiàn)為血肌酐的升高),而此時的XOD不會有明顯的變化,因為XOD 作為一種非專一性酶類,在短時間內(nèi)其活性不會起顯著性變化。 本次的實驗結(jié)果顯示,500 mg/kg 劑量的次黃嘌呤結(jié)合200 mg/kg 劑量的氧嗪酸鉀構(gòu)建急性高尿酸血癥模型,動物血尿酸在建模2 h 后顯著升高,血肌酐也隨之升高,肝黃嘌呤氧化酶(XOD)的確無明顯變化,這與高尿酸血癥急性發(fā)作的特點相吻合。 抗急性高尿酸血癥藥物的藥效評價主要側(cè)重于快速降尿酸,本實驗建立的急性模型,其血尿酸濃度不會升高太過,且在給予別嘌醇后,血尿酸可以快速地下降,這對于藥物的初篩具有良好的適用性,不會輕易淘汰具有開發(fā)潛力的藥物。 其次,使用小鼠建模,對于開發(fā)初期的藥物,特別是合成化藥,中藥單體,能夠節(jié)省藥物用量,一定程度上起到高通量篩選的作用。

對于慢性高尿酸血癥,則主要在于尿酸的長期積累,腺嘌呤代謝成尿酸需要較長的代謝路徑,而乙胺丁醇對腎臟排泄的抑制作用也非一蹴而就,因此二者結(jié)合可用于長時間持續(xù)造模,使動物逐漸形成慢性高尿酸血癥。 因此,本實驗利用150 mg/kg劑量的腺嘌呤聯(lián)合250 mg/kg 劑量的乙胺丁醇制備了慢性高尿酸血癥模型。 此建模方法無論從血生化上還是從組織病理學上進行評價均有較好的成模性。 在臨床上,慢性高尿酸血癥患者除血尿酸明顯升高外,XOD 作為催化嘌呤合成尿酸的關(guān)鍵酶類,其活性也隨之升高,鄧建平等[13]通過檢測20 例高尿酸血癥及痛風患者的XOD 活性,發(fā)現(xiàn)其XOD活性要比正常人顯著升高,此外,由于人體產(chǎn)生的尿酸約有2/3 經(jīng)腎排出,因此,臨床上慢性高尿酸血癥還伴隨腎功能減退及腎損傷,包括腎炎癥的發(fā)生[14-16]。 本實驗模型大鼠在21 d 建模后,血尿酸高出正常大鼠約65%,XOD 活性高出約16%,血肌酐,血清尿素氮均明顯升高,且病理結(jié)果與之吻合,出現(xiàn)腎尿酸鹽結(jié)晶沉積,大量腎小管變性、壞死,炎性細胞浸潤。 這些指征表明,本實驗模型具有明顯的慢性高尿酸血癥的特點,且能夠較好地貼近于臨床表征。 該模型還采用了黃嘌呤氧化酶抑制劑別嘌醇作為陽性藥,給藥后,模型大鼠血尿酸、XOD 活性均明顯下降,腎損傷也得到一定程度恢復,說明本模型具有治愈性,且可探究所研發(fā)藥物對XOD 的作用程度。

綜上所述,本實驗提供的建模方法操作簡單且實用性強,為相關(guān)藥物的開發(fā)提供了評價工具及基礎的建模數(shù)據(jù)。