魏 杰,王 洪,劉甦蘇,賈松華,熊 芮,王辰飛,范昌發(fā),岳秉飛

(中國(guó)食品藥品檢定研究院,北京 102629)

Tim基因家族(T cell immunoglobulin and mucindomain containing molecules gene family)是一個(gè)通過(guò)編碼免疫球蛋白和粘蛋白分子而在Th1、Th2 細(xì)胞表面區(qū)別表達(dá)的一個(gè)基因家族,在機(jī)體過(guò)敏和腫瘤免疫等疾病中發(fā)揮著重要作用[1-5]。

小鼠的Tim基因家族有8 個(gè)成員,Tim4 與人的基因高度相似,但只能表達(dá)在APC 表面,在人體中Tim4 卻可以表達(dá)于活化的CD4+T 和CD8+T[6-7]。在小鼠中敲入人源化的Tim4 基因能夠更好的研究T 淋巴細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用,以及與Tim4 關(guān)聯(lián)密切的哮喘等免疫疾病[8]。

對(duì)免疫功能和免疫疾病表現(xiàn)通常伴有血象變化,轉(zhuǎn)基因后的hTIM4-EGFP模型鼠與野生型是否存在差異,以及后期應(yīng)用于感染實(shí)驗(yàn)的血象變化是否來(lái)自于基因編輯或是免疫反應(yīng),都需要進(jìn)行血液生理生化指標(biāo)的前期測(cè)定,從而為其應(yīng)用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

轉(zhuǎn)基因組hTIM4-EGFP與對(duì)照組野生型C57BL/6 各18 只,分別有雌性8 只、雄性10 只,SPF級(jí),體重25～30 g,均來(lái)自本單位實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源研究所[SCXK(京) 2017-0005]。 利用自行建立的CRISPR/Cas9 技術(shù)將hTIM4 基因定點(diǎn)敲入野生型C57BL/6 小鼠,胚胎注射、轉(zhuǎn)錄等操作均在屏障環(huán)境中完成[SYXK(京)2017-0013],PCR 檢測(cè)陽(yáng)性即為陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因鼠。 轉(zhuǎn)基因組與對(duì)照組均飼養(yǎng)于屏障環(huán)境[SYXK(京)2017-0013]。

滿(mǎn)12 周齡的兩組小鼠,空腹12 h 后,采20 μL眼靜脈抗凝血加入稀釋液中用于測(cè)定血液生理指標(biāo),取全血分離血清,用于測(cè)定血清生化指標(biāo)。 飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)操作均按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理3R 原則規(guī)程進(jìn)行,并經(jīng)中國(guó)食品藥品檢定研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理審查委員會(huì)審批(中檢動(dòng)(福)第(B)021號(hào))。

1.2 主要試劑與儀器

清洗液與溶血?jiǎng)┵?gòu)自上海東湖生物醫(yī)學(xué)有限公司;堿性磷酸酶等生化檢測(cè)試劑購(gòu)自中生北控生物科技股份有限公司。 日本光電Mek7222 血細(xì)胞分析儀;日立7080 全自動(dòng)生化分析儀。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

采用日本光電MEK-7222 K 血球分析儀測(cè)定22項(xiàng)血液生理指標(biāo),儀器精密度:WBC 2.0%,RBC 1.5%,HGB 1.5%,MCV 1.0%,PLT 4.0%。 生理測(cè)定項(xiàng)目分別為:白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC)、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)(RBC)、血小板計(jì)數(shù)(PLT)、血紅蛋白濃度(HGB)、平均紅細(xì)胞體積(MCV)、平均紅細(xì)胞血紅蛋白(MCH)、血紅蛋白濃度(MCHC)、紅細(xì)胞壓積(HCT)、平均紅細(xì)胞分布寬度(RDW)、白細(xì)胞五分類(lèi)計(jì)數(shù)、平均血小板體積(MPV)、血小板壓積(PCT)和血小板分布寬度(PDW)。

采用日立7080 全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定12 項(xiàng)血液生化指標(biāo):堿性磷酸酶(ALP)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(CHO)、葡萄糖(GLU)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、肌酐(CREA)、鈣(CA)、磷(P)、總膽紅素(Tbili)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

按照品種和性別分類(lèi)整理數(shù)據(jù),用SPSS 軟件作獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析,結(jié)果均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差( ˉx ±s)表示。

2 結(jié)果

2.1 生理指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

轉(zhuǎn)基因組與對(duì)照組在WBC、RBC、HGB、HCT、MCH、RDW、PLT、NEUT、LYM%、NEUT%這10 項(xiàng)指標(biāo)中存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(詳見(jiàn)表1)。 其中,轉(zhuǎn)基因組在WBC、RBC、HGB、HCT、NEUT、NEUT%這6 項(xiàng)指標(biāo)上顯著低于對(duì)照組(P＜0.01),在MCH、RDW、PLT 三項(xiàng)指標(biāo)上也低于對(duì)照組(P＜0.05),在LYM%指標(biāo)上顯著高于對(duì)照組(P＜0.01)。

按照性別比較,轉(zhuǎn)基因雌性組與對(duì)照雌性組在WBC、RBC、HGB、HCT、MCH、MCHC、RDW、PLT、PCT、NEUT、LYM 這11 項(xiàng)指標(biāo)中存在差異(詳見(jiàn)表2)。 其中,轉(zhuǎn)基因雌性組在HCT、PCT、NEUT、LYM四項(xiàng)指標(biāo)低于對(duì)照雌性組(P＜0.05),其余7 項(xiàng)指標(biāo)上顯著低于對(duì)照組雌性(P＜0.01)。 轉(zhuǎn)基因雄性組與對(duì)照雄性組在轉(zhuǎn)基因組在WBC、RBC、HGB、HCT、NEUT、NEUT%這6 項(xiàng)指標(biāo)上顯著低于對(duì)照組,在MCH、RDW、PLT 三項(xiàng)指標(biāo)上也低于對(duì)照組(P＜0.05),在LYM%指標(biāo)上顯著高于對(duì)照組(P＜0.01)。 轉(zhuǎn)基因雄性組與對(duì)照雄性組在WBC、RBC、HGB、HCT、LYM、NEUT、LYM%、NEUT%這8 項(xiàng)指標(biāo)中存在差異。 其中,在RBC、HGB、HCT、NEUT、NEUT%五項(xiàng)指標(biāo)中,轉(zhuǎn)基因雄性組顯著低于對(duì)照雄性組(P＜0.01),在WBC、LYM 兩項(xiàng)指標(biāo)中低于對(duì)照雄性組組(P＜0.05),而在LYM%指標(biāo)上顯著高于對(duì)照雄性組(P＜0.01)。

對(duì)同組進(jìn)行組內(nèi)比較,兩組別雌雄間均有7 項(xiàng)指標(biāo)存在差異。 轉(zhuǎn)基因組雌雄在MCV、MCH、MCHC、RDW、PLT、NEUT、NEUT%存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,對(duì)照組雌雄間在RBC、HCT、MCV、LYM、NEUT、LYM%、NEUT%存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,詳見(jiàn)表2。

表1 hTIM4-EGFP 與C57BL/6 血液生理指標(biāo)的比較( ˉx ±s,n=18)Table 1 Comparison of blood physiological values of hTIM4-EGFP and C57BL/6 mice

表2 hTIM4-EGFP 與C57BL/6 血液生理指標(biāo)組間差異與性別差異比較Table 2 Comparison of blood physiological values of hTIM4-EGFP and C57BL/6 mice in different sexes and groups

2.2 生化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

轉(zhuǎn)基因組在ALT、AST、TG、P 這4 項(xiàng)指標(biāo)上均低于對(duì)照組(詳見(jiàn)表3)。 其中,在ALT、TG 和P 這3 項(xiàng)指標(biāo)上顯著低于對(duì)照組(P＜0.01),在AST 上低于對(duì)照組(P＜0.05)。

按照性別比較,轉(zhuǎn)基因雌性組與對(duì)照雌性組在ALP、CHO、TG 這3 項(xiàng)指標(biāo)中存在差異(詳見(jiàn)表4)。其中,轉(zhuǎn)基因雌性組在ALP 指標(biāo)顯著高于對(duì)照雌性組(P＜0.01),其余2 項(xiàng)指標(biāo)低于對(duì)照組雌性(P＜0.05)。 轉(zhuǎn)基因雄性組與對(duì)照雄性組在轉(zhuǎn)基因組在ALT、AST、P 這3 項(xiàng)指標(biāo)上均低于對(duì)照組。

對(duì)同組進(jìn)行組內(nèi)比較,兩組別雌雄間各有2 項(xiàng)和4 項(xiàng)指標(biāo)存在差異。 轉(zhuǎn)基因組雌雄在ALP 和CHO 存在顯著差異,對(duì)照組雌雄間在ALT、AST、TP、P 指標(biāo)上存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,詳見(jiàn)表4。

3 討論

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的血液生理生化指標(biāo)包含了血細(xì)胞的分類(lèi)構(gòu)成、血清蛋白含量、血糖、酶活力等反應(yīng)機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的生理代謝參數(shù),反映了個(gè)體物質(zhì)代謝、能量代謝水平,是判斷動(dòng)物健康狀態(tài)及遺傳穩(wěn)定性等的標(biāo)準(zhǔn),其測(cè)定受到物種、年齡、性別、環(huán)境、營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)、疾病等因素的影響[9-12]。

表3 hTIM4-EGFP 與C57BL/6 血液生化指標(biāo)的比較( ˉx ±s,n=18)Table 3 Comparison of serum biochemical values of hTIM4-EGFP and C57BL/6mice

表4 hTIM4-EGFP 與C57BL/6 血液生化指標(biāo)組間差異與性別差異比較Table 4 Comparison of serum biochemical values of hTIM4-EGFP and C57BL/6 mice in different sexes and groups

6～8 周齡的性成熟小鼠是開(kāi)展實(shí)驗(yàn)通常選擇的實(shí)驗(yàn)對(duì)象,而12 周齡前后,小鼠的骨生物功能才趨于穩(wěn)定,骨髓造血也趨于穩(wěn)定,因此本研究選擇了12 周齡的Tim4 轉(zhuǎn)基因鼠與野生型進(jìn)行比較分析,能夠在一定程度反映Tim4 基因敲入對(duì)生理生化指標(biāo)的影響[13]。

從測(cè)定的生理指標(biāo)上分析,無(wú)論按照同性別比較或總體比較,除LYM%指標(biāo),均存在WBC、RBC、PLT 等主要指標(biāo)在內(nèi)的11 項(xiàng)或9 項(xiàng)指標(biāo)轉(zhuǎn)基因組低于野生型對(duì)照組的情況,整體血生理參數(shù)與野生型差異較大,但LYM 計(jì)數(shù)兩者并無(wú)明顯差異,所以在LYM%指標(biāo)上出現(xiàn)了轉(zhuǎn)基因組高于野生組的情況。 淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)指標(biāo)尤其可以為研究與Tim基因有關(guān)的免疫功能提供借鑒。

從測(cè)定的生化指標(biāo)上分析,轉(zhuǎn)基因組在ALT、AST、TG、P 四項(xiàng)指標(biāo)上均低于野生型對(duì)照組;從同性別比較而言,除轉(zhuǎn)基因雌性組的ALP 高于野生型雌性組外,轉(zhuǎn)基因組雌性和雄性分別在ALP、CHO、TG 以及ALT、AST、P 各3 項(xiàng)指標(biāo)中低于野生型對(duì)應(yīng)性別組,反映出兩者在在肝功、脂代謝以及內(nèi)分泌功能上均可存在一定差異。

無(wú)論生理生化指標(biāo),均存在組間差異大于組內(nèi)差異。 在周齡、飼養(yǎng)等條件一致的情況下,基因敲入可能是導(dǎo)致生理指標(biāo)差異的最主要因素[14];由于hTim4 基因的轉(zhuǎn)入可能會(huì)帶來(lái)血液生理穩(wěn)態(tài)改變、以及調(diào)低肝脂代謝和內(nèi)分泌等。 該測(cè)定建立的血液生理和血清生指標(biāo)背景資料,為hTIM4-EGFP小鼠的應(yīng)用研究提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。