龐鉑實(shí),錢(qián) 強(qiáng),徐 園,肖君華,周宇荀,李 凱

(東華大學(xué)化學(xué)化工與生物工程學(xué)院,上海 201600)

白內(nèi)障是常見(jiàn)的嚴(yán)重眼科疾病,導(dǎo)致失明,其致病因素包括遺傳因素和環(huán)境因素,約三分之一的白內(nèi)障患者是由遺傳因素造成[1]。 白內(nèi)障致病機(jī)理復(fù)雜,研究者常利用動(dòng)物模型針對(duì)單基因進(jìn)行遺傳學(xué)鑒定。 先天性白內(nèi)障小鼠模型是廣泛用于白內(nèi)障功能基因鑒定的模式動(dòng)物之一,根據(jù)突變產(chǎn)生原因主要分為自發(fā)突變、誘發(fā)突變。 自發(fā)突變小鼠通常來(lái)源于長(zhǎng)時(shí)間大規(guī)模飼養(yǎng),誘發(fā)突變則主要利用X 射線、ENU 誘變劑等物理或化學(xué)手段[2]。Jackson 實(shí)驗(yàn)室的MGI 數(shù)據(jù)庫(kù)(Mouse Genome Informatics)中,共報(bào)道478 種具有白內(nèi)障表型的模式小鼠,其中由于自發(fā)突變引起的共計(jì)77 種。

2015 年作者單位在飼養(yǎng)FVB 小鼠的過(guò)程中,偶然發(fā)現(xiàn)由自發(fā)突變引起出生后50 d 左右患有白內(nèi)障的小鼠,且無(wú)其他生理生殖異常,經(jīng)鑒定為先天性晚發(fā)型白內(nèi)障。 晚發(fā)型先天性白內(nèi)障是較為特殊的一種類(lèi)型,表現(xiàn)為在出生后一年以內(nèi)發(fā)生晶狀體混濁[3]。 進(jìn)一步建立家系發(fā)現(xiàn),該晚發(fā)型白內(nèi)障以常染色體顯性方式穩(wěn)定遺傳。

本研究首先鑒定了先天性晚發(fā)型白內(nèi)障FVB小鼠的遺傳方式,其次,利用多重PCR 靶向測(cè)序技術(shù)設(shè)計(jì)全基因組SNP 掃描方案,對(duì)突變基因進(jìn)行染色體定位,最后對(duì)患病小鼠進(jìn)行全外顯子測(cè)序,篩選候選功能基因。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本研究所用SPF 級(jí)FVB/NJ 品系的自發(fā)突變白內(nèi)障小鼠、C3H/He 品系的正常小鼠,由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[SCXK(滬)2017-0005]提供,并飼養(yǎng)于東華大學(xué)SPF 級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)施內(nèi)[SYXK(滬)2014-0022],飼養(yǎng)室相對(duì)濕度為(55±10)%,溫度為(22±2)℃,每天光照12 h。 用于提取DNA并測(cè)序的小鼠共100 只,10 周齡,體重25 ～27 g,用于組織切片觀察的小鼠共12 只,5 ～10 周齡,體重16 ～27 g。 本研究經(jīng)由東華大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào):東華倫審[2016]13 號(hào)),所有操作均符合動(dòng)物倫理學(xué)要求,并按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的3R 原則給予人道關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器

儀器:PCR 儀(A-100 型,中國(guó)杭州朗基科學(xué)儀器有限公司)、PCR 儀(GeneAmpPCR system 9600型,美國(guó)ABI 公司)、全自動(dòng)紫外與可見(jiàn)光分析裝置(FR-200A 型,中國(guó)上海復(fù)日科技有限公司)、電泳儀(JY600+型,中國(guó)北京君意東方電泳設(shè)備有限公司)、光學(xué)顯微鏡(Nikon Eclipse ci 型,日本Nikon 公司) 等。 試 劑: 動(dòng) 物 基 因 組DNA 小 量 試 劑 盒(Axygen AxyPrep,美國(guó)Axygen 公司)、小鼠全外顯子提取試劑盒(Agilent SureSelectXT Mouse All Exon kit, 美國(guó)Agilent 公司)、Taq 酶(中國(guó)北京全式金生物技術(shù)有限公司)等。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 軟件與數(shù)據(jù)庫(kù)

本研究中用到的軟件及網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)資源見(jiàn)表1所示。

1.3.2 遺傳方式鑒定與家系構(gòu)建

白內(nèi)障FVB 雄鼠與野生型C3H 雌鼠交配,產(chǎn)生F1 代小鼠,F1 代小鼠自交,產(chǎn)生F2 代,記錄發(fā)病情況,驗(yàn)證該白內(nèi)障表型能否穩(wěn)定遺傳及其遺傳方式。

表1 主要實(shí)驗(yàn)軟件與網(wǎng)絡(luò)資源Table 1 Main experimental software and network resources

1.3.3 顯微鏡鑒定眼球組織切片

自5 周齡起,至10 周齡止,挑選每個(gè)周齡段的FVB 白內(nèi)障小鼠,雌雄個(gè)體各一只,解剖取右側(cè)眼球。 眼球經(jīng)過(guò)固定、脫水、包埋、制片及HE 染色后,在光學(xué)顯微鏡下觀察并描述不同類(lèi)型的病變部位。同時(shí),選取同年齡段FVB 野生型小鼠為對(duì)照。

1.3.4 小鼠基因組DNA 提取

剪取1 ～2 cm 小鼠尾尖組織,放于預(yù)冷好的研缽中,用力快速地研磨至勻漿狀;使用20 μL 蛋白酶K 消化鼠尾組織,按照動(dòng)物基因組DNA 抽提試劑盒說(shuō)明書(shū)提取小鼠基因組DNA。

1.3.5 高通量SNP 分型

通過(guò)NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中查找小鼠基因組上的高多態(tài)性SNP 位點(diǎn)共48 個(gè),分布于全部的19 條常染色體上。 挑選100 只患有白內(nèi)障的F2 代小鼠,針對(duì)48 個(gè)SNP 位點(diǎn)進(jìn)行多重PCR 建庫(kù),建庫(kù)策略采用錢(qián)強(qiáng)等人[4]的研究中所用方法,建庫(kù)產(chǎn)物送金唯智生物(蘇州金唯智生物科技有限公司,中國(guó)蘇州)進(jìn)行下一代測(cè)序,測(cè)序平臺(tái)為Illumina X-10,雙末端(Paired-End)測(cè)序,上機(jī)前產(chǎn)物經(jīng)過(guò)安捷倫2100質(zhì)控。

1.3.6 全外顯子測(cè)序

分別提取2 只白內(nèi)障FBV 小鼠(樣本編號(hào)N7、N8)、1 只野生型FVB 小鼠的基因組DNA(樣本編號(hào)N102),及4 只患有白內(nèi)障的F2 代小鼠的混合基因組DNA(樣本編號(hào)N4),采用Agilent SureSelectXT Mouse All Exon kit 進(jìn)行外顯子捕獲建庫(kù)。 4 例建庫(kù)產(chǎn)物送由北京諾禾致源公司進(jìn)行測(cè)序,測(cè)序平臺(tái)為Illumina HiSeq,雙末端測(cè)序。

1.3.7 測(cè)序數(shù)據(jù)分析

對(duì)于多重PCR 靶向測(cè)序數(shù)據(jù),使用本實(shí)驗(yàn)室先前建立的SNP 識(shí)別流程進(jìn)行SNP 的篩查[4]。 對(duì)于全外顯子測(cè)序數(shù)據(jù),使用GATK[5]軟件識(shí)別BAM 文件中的變異位點(diǎn)(variant)。 篩選測(cè)序深度大于10×的SNP 和Indel,隨后利用ANNOVAR 軟件對(duì)變異位點(diǎn)進(jìn)行注釋。

全外顯子數(shù)據(jù)中突變位點(diǎn)的篩選流程如下:(1)去除小鼠dbSNP142 數(shù)據(jù)庫(kù)中那些常見(jiàn)的突變位點(diǎn);(2)挑選出編碼區(qū)的變異位點(diǎn);去除那些同義突變的位點(diǎn);(3)篩選N7 和N8 共有的變異位點(diǎn)且在N102 中不存在這些位點(diǎn);利用N4 再次驗(yàn)證(4)的結(jié)果;(5)篩選出那些與白內(nèi)障疾病有關(guān)的基因,從而確定候選突變位點(diǎn)。

2 結(jié)果

2.1 遺傳方式鑒定結(jié)果

患白內(nèi)障的FVB 雄鼠與野生型C3H 雌鼠交配后,子代全部發(fā)生白內(nèi)障,子代小鼠自交后,其后代中白內(nèi)障患病率達(dá)80%,與顯性遺傳理論值(75%)相接近,且雌雄患病比例接近1 ∶1。 表明該白內(nèi)障自發(fā)突變基因的遺傳方式為常染色體顯性遺傳。

2.2 眼球組織切片鑒定結(jié)果

圖1A 中,肉眼可見(jiàn)正常野生型小鼠的眼球眼球呈黑色,無(wú)混濁;而患有白內(nèi)障的小鼠晶狀體呈白色混濁狀。 圖1B 中,對(duì)照組的組織切片中,野生型FVB 小鼠的晶狀體上皮下皮質(zhì)纖維排列緊密,分布整齊,以板層結(jié)構(gòu)呈橢圓形向心排列,上皮細(xì)胞形態(tài)正常,排列整齊,晶體囊厚度均勻,結(jié)構(gòu)正常,組織未見(jiàn)明顯異常;實(shí)驗(yàn)組中,晶體囊厚度不均勻,上皮細(xì)胞明顯腫脹,胞質(zhì)疏松或呈空泡狀,部分上皮細(xì)胞核嗜酸性增強(qiáng),赤道部附近纖維明顯水腫,纖維間隙增寬,晶狀體皮質(zhì)結(jié)構(gòu)紊亂,板層結(jié)構(gòu)消失,纖維腫脹,裂解成不規(guī)則團(tuán)塊狀,或呈無(wú)形態(tài)均質(zhì)樣,皮質(zhì)還可見(jiàn)少量淡黃色顆粒物。

2.3 全基因組SNP 掃描結(jié)果

100 只F2 代白內(nèi)障小鼠基因組掃描結(jié)果顯示(圖2),11 號(hào)染色體上的rs4228772 位點(diǎn)FVB 純合基因型占比最高,達(dá)到了82.11%,而其余位點(diǎn)的純合占比均低于35%,(理論值25%),故白內(nèi)障基因位于11 號(hào)染色體上,與rs4228772 連鎖。

2.4 全外顯子測(cè)序數(shù)據(jù)分析結(jié)果

全外顯子測(cè)序結(jié)果顯示,超過(guò)99.7%的reads比對(duì)到外顯子,約99%的小鼠外顯子區(qū)域深度超過(guò)10 倍,滿足后續(xù)分析的要求(見(jiàn)表2)。

測(cè)序樣本N7,N8,N02,N4 的全外顯子測(cè)序數(shù)據(jù)原始變異數(shù)據(jù)集中,分別包含169457、165703、144476和186438 個(gè)編碼區(qū)SNP 變異,以及47867、45236、35100 和38998 個(gè)Indel 變異,經(jīng)過(guò)篩選后,最后得出28 個(gè)SNP 位點(diǎn)以及3 個(gè)Indel 突變(見(jiàn)表3):分別有20 個(gè)錯(cuò)義突變(missense)、7 個(gè)無(wú)義突變(stop-gain)和1 個(gè)終止密碼子丟失(stop-loss)的SNP 的突變;1個(gè)frameshift deletion、1 個(gè)frameshift insertion 和1 個(gè)non-frameshift deletion 的Indel 的突變。

圖3 中展示了這些變異位點(diǎn)在染色體上的分布,并結(jié)合2.2 中全基因組SNP 掃描的結(jié)果,標(biāo)記了11 號(hào)染色體上的3 個(gè)候選突變基因(Sfi1,Obscn,Ptrh2)。 根據(jù)基因注釋結(jié)果,Ptrh2 基因在86689778位置上發(fā)生C→T 的無(wú)義突變(stop-gain),使得基因在該位置提前產(chǎn)生終止密碼子;Sfi1 基因在3134337位置上發(fā)生G→A 的錯(cuò)義突變(missense);Obscn基因在59054628 位置上發(fā)生C →CA 的移碼突變(frameshift insertion)。

圖1 眼球組織切片鑒定結(jié)果Figure 1 Identification results of eyeball tissue sections

表2 四例樣本數(shù)據(jù)比對(duì)率及其覆蓋率Table 2 Comparison of sample data and coverage rate of four samples

圖2 各染色體上SNP 位點(diǎn)FVB 純合子所占比例Figure 2 Proportion of homozygous FVB at SNP sites on each chromosome

圖3 候選SNP 及Indel 染色體分布圖Figure 3 Distribution of candidate SNPs and indels on each chromosome

表3 候選的突變SNP 和Indel 位點(diǎn)信息Table 3 Candidate mutation SNPs and indel site information

3 討論

人類(lèi)白內(nèi)障發(fā)病機(jī)制尚不完全清晰,且相關(guān)遺傳學(xué)研究難以開(kāi)展,使用突變小鼠模型研究相關(guān)基因功能是目前的有效手段之一[6-7]。 本研究針對(duì)FVB 小鼠的先天性晚發(fā)型白內(nèi)障表型,利用全基因組SNP 掃描和全外顯子測(cè)序,確定了自發(fā)突變位于11 號(hào)染色體,遺傳方式為常染色體顯性,并篩選出三個(gè)強(qiáng)有力的候選突變基因Sfi1,Obscn和Ptrh2。

據(jù)報(bào)道,目前有數(shù)百個(gè)基因可直接或間接參與遺傳性白內(nèi)障的發(fā)生,其中約有35 個(gè)基因僅導(dǎo)致遺傳性白內(nèi)障而不造成其它生理疾病[8]。 例如,Bfsp1和Bfsp2 基因在晶狀體特異性表達(dá),當(dāng)發(fā)生結(jié)構(gòu)性突變時(shí),便會(huì)直接導(dǎo)致白內(nèi)障[9-10]。 之前,本課題組通過(guò)全基因組掃描和精細(xì)定位定位白內(nèi)障相關(guān)基因,最后在Crygc 外顯子3 中發(fā)現(xiàn)缺失1-bp 導(dǎo)致的終止密碼子提前,是小鼠遺傳性白內(nèi)障的發(fā)病原因[3]。

根據(jù)病因?qū)W研究統(tǒng)計(jì),先天性白內(nèi)障基因中晶體蛋白基因(crystalline genes)約占一半,還有連接蛋白基因(connexin genes)、熱休克蛋白轉(zhuǎn)錄因子等。 然而,基因突變也僅是造成先天性白內(nèi)障的因素之一,也有研究發(fā)現(xiàn)某些基因啟動(dòng)子甲基化修飾也會(huì)導(dǎo)致晶狀體發(fā)育異常[11]。 即使先天性白內(nèi)障在同一位點(diǎn)發(fā)生突變,晶狀體形態(tài)、顏色或密度上仍有差異[12]。

人與小鼠的Sfi1,Obscn和Ptrh2 都是蛋白質(zhì)編碼基因,氨基酸序列一致性分別為64.13%,33.87%和79.01%。Sfi1 編碼中心體蛋白Sfi1,重要功能之一是在紡錘體極體與Cdc31 蛋白相互作用調(diào)控細(xì)胞周期[13];Obscn編碼的OBSCURIN 蛋白,在心肌和骨骼肌組織中高表達(dá),功能十分繁多,Obscn突變導(dǎo)致的蛋白質(zhì)表達(dá)量下調(diào)常常引發(fā)肌肉疾病或癌癥[14];Ptrh2 編碼的Ptrh2(Peptidyl-tRNA hydrolase 2),參與調(diào)控細(xì)胞凋亡信號(hào)通路,且在肌肉發(fā)育過(guò)程中起關(guān)鍵作用,Ptrh2 突變小鼠會(huì)表現(xiàn)出先天性肌肉萎縮[15]。 三個(gè)候選基因中有兩個(gè)與肌肉發(fā)育相關(guān),提示突變基因很可能引起了眼部肌肉組織的發(fā)育異常,從而導(dǎo)致了晶狀體混濁。

全基因組掃描與全外顯子測(cè)序?qū)τ诤Y選突變基因各有優(yōu)勢(shì)。 全基因組連鎖分析可將基因定位到性狀連鎖染色體或染色體目標(biāo)區(qū)間,全外顯子可直接提供影響蛋白功能的突變,但前者區(qū)間過(guò)大、后者測(cè)序后往往突變基因較多。 本研究將全基因組SNP 連鎖分析與全外顯子測(cè)序技術(shù)相結(jié)合,在基因組層面篩選出了先天性晚發(fā)型白內(nèi)障新的候選基因,豐富了白內(nèi)障模型小鼠的遺傳背景研究,可為白內(nèi)障基因研究提供新思路。