張淑靜 郭小平 黃志堅(jiān) 蔣蕓

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmoriary disease, COPD)是臨床上常見呼吸系統(tǒng)疾病，其病因與有害氣體或顆粒引起的異常炎癥反應(yīng)相關(guān)，該疾病并發(fā)癥中，糖尿病(diabetic mellitus, DM)發(fā)病率最高[1]。DM合并COPD的發(fā)生和進(jìn)展受患者肺功能、炎癥反應(yīng)、致病菌感染的影響，因此需通過對(duì)以上因素進(jìn)行合理控制達(dá)到治療目的[2]?？ㄍ衅绽?Captopril)是一種血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑，廣泛應(yīng)用于心腦血管疾病的治療[3]。相關(guān)研究顯示：卡托普利不但可治療糖尿病，還可有效保護(hù)糖尿病患者腎功能，還可減輕輻射引起的肺損傷，改善氧化劑-抗氧化劑和促炎因子-抑炎因子的不平衡[4-6]。本研究采用卡托普利對(duì)DM合并COPD模型進(jìn)行干預(yù)，通過檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)大鼠血清中IL-8和TNF-α的水平從而對(duì)其治療效果進(jìn)行分析。

資料與方法

一、研究對(duì)象與分組

雄性Sprague Dawley大鼠(購(gòu)自昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證批號(hào)：SCXK(滇)2011-0005)，體重約200±20 g，根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法平均分為3組，每組20只，分別為Control組、DM+COPD模型組、Captopril治療組。

二、方法

1 糖尿病模型建立[7]

采用靜脈內(nèi)注射鏈脲佐菌素建立糖尿病模型，采用雄性Sprague-Dawley大鼠，在誘導(dǎo)糖尿病前將研究動(dòng)物禁食12小時(shí)，然后對(duì)其腹膜注射溶于檸檬酸鹽緩沖液(pH 4.5)的鏈脲佐菌素(Sigma，USA)(70 mg/kg)，對(duì)照組注射等量溶劑檸檬酸鹽緩沖，連續(xù)4 w，從研究動(dòng)物的尾靜脈收集血液樣品，檢測(cè)其血糖濃度≥16.7 mmol/L并維持>2 w時(shí)，以證實(shí)糖尿病誘導(dǎo)成功。

2 慢性阻塞性肺疾病(COPD)模型建立[8]

將大鼠置于吸煙裝置中接觸香煙煙霧(香煙產(chǎn)生8 mg焦油，0.8 mg尼古丁和10 mg一氧化碳)由石家莊金陽(yáng)科技有限公司制造(型號(hào)：JY-01，中國(guó)石家莊)，連續(xù)燃燒20支香煙，并將其與氧氣一起吹入吸煙裝置中，使大鼠與香煙煙霧接觸，每次1小時(shí)，每天2次，每周5 d，共70 d。

3 糖尿病合并COPD模型建立

合并模型組大鼠均在糖尿病模型造模成功后進(jìn)行COPD模型建立。

4 卡托普利干預(yù)

造模成功后，根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)置分別給予各組大鼠生理鹽水溶液或卡托普利溶液(5 mg/kg/d)灌胃，連續(xù)6 w。

三、檢測(cè)指標(biāo)

1 IL-8和TNF-α含量檢測(cè)

分別于造模前(干預(yù)前1 d)、干預(yù)后1 w、2 w、4 w、6 w清晨灌胃前通過尾靜脈取血，室溫下離心15 min取血清，大鼠ELISA試劑盒(購(gòu)自武漢優(yōu)爾生科技股份有限公司)檢測(cè)血清中IL-8和TNF-α的含量，檢測(cè)步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作；灌胃及取血結(jié)束后，斷頸法處死各組大鼠，打開胸腔，各組大鼠取同一部分肺組織，研磨成組織勻漿后，相同方法檢測(cè)大鼠肺組織中IL-8和TNF-α的含量。

2 大鼠空腹血糖(fasting plasma glucose, FPG)檢測(cè)

分別于造模前、干預(yù)前1 d、和治療6 w后，空腹?fàn)顟B(tài)尾靜脈取血液于抗凝管中，迅速離心，取血漿，血糖儀分別檢測(cè)三組大鼠造模前、治療前1 d和治療6 w后FPG值。

3 大鼠肺組織HE染色

灌胃及取血結(jié)束后，斷頸法處死各組大鼠后，打開胸腔，取出完整肺組織，取右肺固定，根據(jù)石蠟切片常規(guī)制作步驟依次進(jìn)行脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、染色等，然后在光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

4 肺組織病理學(xué)評(píng)分

采用雙盲法，由我院病理科2位醫(yī)師按照表1肺組織病理學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)獨(dú)立對(duì)HE染色切片進(jìn)行評(píng)分，每個(gè)評(píng)分項(xiàng)目取均值?？偡钟?jì)算公式=A+3(B+C)+D+E(得分范圍：0～26分)(見表1)。

表1 肺組織病理學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[9]

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)血清中IL-8的水平比較

卡托普利干預(yù)前1 d，與Control組相比，DM+COPD模型組和Captopril治療組大鼠血清中IL-8的水平均顯著增加(P均<0.05)，而后兩組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)；卡托普利干預(yù)1 w～6 w后，與Control組相比，DM+COPD模型組和Captopril治療組大鼠血清中IL-8的水平均顯著增加(P均<0.05)，而與DM+COPD模型組相比，Captopril治療組上述指標(biāo)顯著均降低(P均<0.05)；Control組和DM+COPD模型組大鼠血清中IL-8的水平與時(shí)間無(wú)顯著相關(guān)性(rc=0.617，Pc=0.115；rD+C=0.018，PD+C=0.789)，而Captopril治療組則IL-8的水平則隨時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸降低，呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.901，P=0.014)(見表2)。

表2 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)血清中IL-8的水平比較

二、各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)血清中TNF-α的水平比較

卡托普利干預(yù)前1 d，與Control組相比，DM+COPD模型組和Captopril治療組大鼠血清中TNF-α的水平均顯著增加(P均<0.05)，而后兩組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)；卡托普利干預(yù)1 w～6 w后，與Control組相比，DM+COPD模型組和Captopril治療組大鼠血清中TNF-α的水平均顯著增加(P均<0.05)，而與DM+COPD模型組相比，Captopril治療組上述指標(biāo)顯著均降低(P均<0.05)；Control組和DM+COPD模型組大鼠血清中TNF-α的水平與時(shí)間無(wú)顯著相關(guān)性(rC=0.476，PC=0.197；rD+C=0.037，PD+C=0.757)，而Captopril治療組則IL-8的水平則隨時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸降低，呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.991，P=0.0004)(見表3)。

表3 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)血清中TNF-α的水平比較

三、三組大鼠血糖指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果比較

造模前三組大鼠FPG水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，治療前1 d，與Control組相比，DM+COPD對(duì)照組和Captopril治療組FPG水平均顯著上升(P<0.05)，而后兩組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；治療后6 w，DM+COPD模型組和Captopril治療組FPG水平仍較Control組上升(P<0.05)，而Captopril治療組FPG水平較DM+COPD模型組顯著下降(P<0.05)(見表4)。

表4 三大鼠血糖指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果比較

四、各組大鼠肺組織中IL-8和TNF-α含量比較

與Control組相比，DM+COPD模型組和Captopril治療組大鼠肺組織中IL-8和TNF-α含量均顯著增加(P<0.05)，且DM+COPD組也分別較DM對(duì)照組和COPD對(duì)照組顯著增加(P<0.05)，而經(jīng)Captopril治療后，治療組大鼠肺組織中IL-8和TNF-α含量較DM+COPD模型組顯著降低(P<0.05)(見表5)。

表5 各組大鼠肺組織中IL-8和TNF-α含量比較

五、三組大鼠肺組織病理學(xué)評(píng)分結(jié)果比較

DM+COPD模型組和Captopril治療組大鼠肺組織病理學(xué)評(píng)分分別為(13.91±2.07)分和(8.46±1.13)分，均較對(duì)照組(0分)顯著增加(P<0.05)；而經(jīng)Captopril治療后，治療組大鼠肺組織病理學(xué)評(píng)分(8.46±1.13)分較DM+COPD模型組(13.91±2.07)分,顯著降低，以上差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

六、肺組織和血清中炎性因子變化相關(guān)性分析

相關(guān)性分析結(jié)果顯示：大鼠肺組織中炎癥因子IL-8、TNF-α變化與血清中炎性因子變化均呈顯著正相關(guān)(rIL-8=0.517，PIL-8=0.033；rTNF-α=0.643，PTNF-α=0.014)。

討 論

慢性阻塞性肺疾病是臨床呼吸系統(tǒng)多發(fā)疾病，易發(fā)于男性吸煙者、粉塵、煙霧、有害氣體環(huán)境作業(yè)者以及污染環(huán)境長(zhǎng)期接觸者，其發(fā)病率及死亡率均較高,且呈逐年上升趨勢(shì)[10-11]。隨著病程的增加，該疾病患者肺部受到嚴(yán)重?fù)p害，功能逐漸喪失，另外，該疾病還可引發(fā)多種常見全身性疾病的發(fā)生，如：其常見合并癥——糖尿病[12]。相關(guān)研究提出，慢性阻塞性肺疾病的發(fā)病原因與慢性異常炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，該疾病患者炎癥不僅體現(xiàn)在肺部，極易引發(fā)全身炎癥[13]。因此，可有效控制炎癥的治療方式則極大可能是治療COPD合并DM疾病的有效方式。

目前卡托普利作用于COPD和DM單一疾病的治療的相關(guān)研究較多，其作用劑量不固定(1.5mg/kg～15mg/kg)，本研究經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定采用劑量為5 mg/kg卡托普利對(duì)糖尿病合并慢性阻塞性肺疾病模型大鼠進(jìn)行干預(yù)治療，結(jié)果顯示：經(jīng)Captopril治療1 w～6 w后，與DM+COPD模型組相比，治療組大鼠血清中IL-8和TNF-α含量均較DM+COPD對(duì)照組顯著降低(P<0.05)，表明：卡托普利可顯著改善大鼠血清中炎癥反應(yīng)相關(guān)指標(biāo)，其對(duì)COPD合并DM疾病具有顯著治療效果。另外，Control組和DM+COPD模型組大鼠血清中IL-8和TNF-α的水平在不同時(shí)間點(diǎn)變化均不顯著，Captopril治療組從第1 w～6 w血清中IL-8和TNF-α的水平隨時(shí)間延長(zhǎng)呈降低趨勢(shì)，表明隨著卡托普利作用時(shí)間的延長(zhǎng)，其對(duì)COPD合并DM疾病的治療效果也逐漸增強(qiáng)。治療結(jié)束后，Captopril治療組大鼠肺組織中IL-8和TNF-α含量和肺組織病理學(xué)評(píng)分均較DM+COPD對(duì)照組顯著降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明卡托普利可顯著改善大鼠肺組織中炎癥反應(yīng)相關(guān)指標(biāo)以及病理學(xué)狀況。相關(guān)研究認(rèn)為：糖尿病患者通常伴隨著全身炎癥反應(yīng)的發(fā)生，而COPD的發(fā)病也不只是單純的氣道炎癥，也與全身炎癥反應(yīng)的發(fā)生密切相關(guān)[12，14]。結(jié)合相關(guān)研究結(jié)論，我們推測(cè)：卡托普利作為一種血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑，可通過減緩氣道平滑肌與肺血管的收縮作用，抑制微血管滲透，降低炎癥反應(yīng)水平，從而對(duì)COPD的合并DM疾病具有顯著臨床干預(yù)效果[15-16]。

目前卡托普利應(yīng)用于改善糖尿病、高血壓患者血糖、血壓水平以及對(duì)糖尿病患者發(fā)揮心、腎保護(hù)作用等相關(guān)研究已較為成熟，尤其是卡托普利與其他藥物聯(lián)用對(duì)糖尿病相關(guān)疾病的作用效果分析為該藥物的熱點(diǎn)研究?jī)?nèi)容。本研究中卡托普利對(duì)DM合并COPD大鼠血糖影響結(jié)果顯示：治療前1 d，與Control組相比，DM+COPD對(duì)照組和Captopril治療組FPG水平均顯著上升(P<0.05)，而治療后6 w，DM+COPD模型組和Captopril治療組FPG水平仍較Control組上升(P<0.05)，而Captopril治療組FPG水平較DM+COPD模型組顯著下降(P<0.05)，表明：應(yīng)用卡托普利治療后，DM合并COPD大鼠血糖水平改善顯著，與前人研究結(jié)果一致。但可能由于作用時(shí)長(zhǎng)有限，Captopril治療組DM合并COPD大鼠血糖水平與正常大鼠血糖水平仍存在較大差距，因此卡托普利是否可以將DM合并COPD大鼠降至或接近正常水平，仍需進(jìn)一步研究。相關(guān)研究認(rèn)為：糖尿病患者通常伴隨著全身炎癥反應(yīng)的發(fā)生，而COPD的發(fā)病也不只是單純的氣道炎癥，也與全身炎癥反應(yīng)的發(fā)生密切相關(guān)[15-16]，結(jié)合上述結(jié)果我們推測(cè)：卡托普利可能通過中斷血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)換為Ⅱ的過程，從而減緩了血管緊張素Ⅱ?qū)M合并COPD疾病惡化的促進(jìn)作用，并一定程度上抑制了大鼠全身炎癥反應(yīng)水平，從而改善DM合并COPD大鼠的血糖水平及肺組織病理學(xué)狀態(tài)，其相關(guān)作用通路及調(diào)控的分子機(jī)制仍需進(jìn)一步分析。另外，相關(guān)性分析結(jié)果顯示：肺組織和血清IL-8和TNF-α的變化均呈顯著正相關(guān)(P均<0.05)，表明可通過觀察DM合并COPD患者血清中炎性因子的變化趨勢(shì)，從而對(duì)患者病程進(jìn)行初步評(píng)估和診斷或?qū)υ摷膊⌒滤幬镒饔眯ЧM(jìn)行評(píng)價(jià)。

本研究不足之處在于所設(shè)置研究時(shí)長(zhǎng)較短，在所研究時(shí)間范圍內(nèi)卡托普利作用效果呈遞增趨勢(shì)，未獲得其作用效果趨于穩(wěn)定(即最佳效果)的時(shí)間點(diǎn)，將在后續(xù)研究展開進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。綜上所述，DM合并COPD模型大鼠經(jīng)卡托普利治療后，其血清及肺組織IL-8和TNF-α含量降低且血糖水平和肺組織病理狀況改善，且在本研究時(shí)間范圍內(nèi)，其療效隨作用時(shí)間延長(zhǎng)而增加。