邢媛媛 陳金亮 陳建榮 呂學(xué)東

哮喘和慢性阻塞性肺疾病(簡稱：慢阻肺)是臨床上最常見的呼吸系統(tǒng)疾病[1]。相關(guān)研究表明，哮喘和慢阻肺的發(fā)病機理、臨床癥狀和誘發(fā)因素存在一定的重疊，其被稱為哮喘-慢性阻塞性肺重疊綜合征(asthma-chronic obstructive pulmonary overlap syndrome，ACOS)[2]。研究發(fā)現(xiàn)，ACOS患者生活質(zhì)量更差，肺功能下降更快、病死率更高[3]。ACOS是進行性疾病，并與肺部異常炎癥反應(yīng)相關(guān)，該過程的最終結(jié)果是肺實質(zhì)的破壞和喪失。目前已經(jīng)采用了各種方法來研究并可能量化ACOS中的炎癥，如支氣管壁活檢、支氣管鏡檢查和支氣管肺泡灌洗[4]。然而，這些方法對治療的反應(yīng)性滯后，敏感性較低，在預(yù)測急性發(fā)作方面價值不大。呼出氣冷凝液(exhaled breath condensate，EBC)測定方法作為一種非侵入性方法，通過將呼出氣體經(jīng)低溫冷卻即可形成1～3mL EBC，可用于研究細胞因子成分，有助于判斷參與者肺部病理生理的變化[5]。此外，在EBC樣本的收集過程不會導(dǎo)致氣道炎癥狀況的任何改變。因此，理論上應(yīng)用EBC分析ACOS患者氣道內(nèi)炎癥反應(yīng)可協(xié)助肺疾病診斷、嚴(yán)重程度分析、治療效果判斷及愈后估計。然而，目前關(guān)于EBC在肺部疾病患者中應(yīng)用的報告相對較少，尤其是ACOS患者。在這項研究中，我們對健康非吸煙志愿者、健康吸煙志愿者和ACOS患者的EBC細胞因子進行測量，并分析細胞因子與ACOS患者肺功能的關(guān)系。

資料與方法

一、一般資料

本實驗研究于2017年10月至2019年10月在本院呼吸內(nèi)科進行，共納入74例ACOS患者作為研究對象。其中40例ACOS穩(wěn)定期患者和34例ACOS急性加重期患者。ACOS的診斷標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)2012年關(guān)于慢阻肺重疊表型慢阻肺-哮喘的共識文件[6]，ACOS的診斷依據(jù)以下為主要標(biāo)準(zhǔn)：慢阻肺患者的支氣管舒張試驗結(jié)果強陽性(FEV1增加> 400 mL，改善率>15%)；痰嗜酸性粒細胞增多或哮喘的診斷。次要標(biāo)準(zhǔn)：慢阻肺患者總血清IgE升高；過敏史；超過2次支氣管舒張試驗結(jié)果陽性(FEV1增加> 200 mL，改善率>12%)。ACOS診斷需要滿足2個主要標(biāo)準(zhǔn)或1個主要和2個次要標(biāo)準(zhǔn)。納入標(biāo)準(zhǔn)：患者年齡20～70歲，符合診斷標(biāo)準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：最近2周內(nèi)上呼吸道感染；最近一個月使用全身性糖皮質(zhì)激素；盡管有氣流阻塞，但仍可診斷支氣管擴張、肺結(jié)核、囊性纖維化、彌漫性全細支氣管炎、閉塞性細支氣管炎；潛在的嚴(yán)重心血管、肝臟、腎臟或造血系統(tǒng)疾?。痪芙^合作或無法溝通。同時，選擇同期肺功能正常健康體檢者45例作為對照，包括24例非吸煙者和21例吸煙者。研究得到本院倫理研究委員會批準(zhǔn)，所有受試者均簽署知情同意書。

二、肺功能試驗

使用肺功能設(shè)備(德國JAEGER公司)進行肺功能和支氣管舒張試驗。肺功能檢查由本院肺功能檢查實驗室的專業(yè)人員完成。對每個人重復(fù)測試3次，記錄第1秒用力肺活量(FEV1)、用力肺活量(FVC)和以及FEV1/FVC。

三、EBC收集和標(biāo)記

EBC的收集是通過將EcoScreens呼氣冷凝液收集裝置(德國ViaSys公司)的專用導(dǎo)管插入呼吸機導(dǎo)管的呼氣支中進行，持續(xù)20 min。利用熱濕化器對吸氣進行濕化。檢查所有EBC樣品的淀粉酶活性(α-淀粉酶試劑盒；檢出限0.05 mmol/ls；合肥萊爾生物科技有限公司)，以便排除唾液污染。

四、支氣管肺泡灌洗

在ACOS患者中，有14例患者由于微生物感染原因進行支氣管肺泡灌洗，取一小份(2 mL)作為支氣管肺泡灌洗液(BALF)和EBC中細胞因子的比較。所有病例均在支氣管鏡檢查前進行EBC收集。

五、EBC細胞因子測定

采用多重微珠流式熒光免疫分析法(美國Becton-Dickinson公司)分析呼氣冷凝液中細胞因子濃度。將具有不同熒光強度的四個珠子群體的混合物，涂上針對8-異前列腺素(8-iso-PG)、腫瘤殺傷因子α(TNF-α)、白三烯B4(LTB4)和白介素-6(IL-6)蛋白的捕獲抗體，用2 mL凍干呼吸冷凝液孵育。在BD FACSCalibur流式細胞儀(美國Becton-Dickinson公司)中，用PE結(jié)合檢測抗體檢測EBC樣品中的細胞因子和與捕獲珠結(jié)合的重組標(biāo)準(zhǔn)物。為了確保用這種市售的系統(tǒng)正確檢測細胞因子，在4個樣品中研究了試劑量的減少以及對緩沖成分的要求：將規(guī)定的細胞因子濃度溶解在水中，并在冷凍保存和凍干前后進行測量，活性損失10.6%。加入1%的牛血清白蛋白，這種損失降低到1.8%。平均批內(nèi)重復(fù)性和批間重復(fù)性分別為92.8%(8-iso-PG：89.5%，LTB4：94.5%，IL-6：90.7%，TNF-α：91.6%)和87%(8-iso-PG：82.6%，LTB4：85.7%，IL-6：90.4%，TNF-α：88.9%)。

六、數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 21.0進行統(tǒng)計分析。兩組定量數(shù)據(jù)的比較采用t檢驗的方法,多組定量數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析,多組之間兩兩比較采用SNK-q檢驗的方法。應(yīng)用Pearson分析ACOS患者EBC細胞因子與肺功能指標(biāo)的關(guān)系。P0.05被認為差異有顯著性。

結(jié) 果

一、受試者的基本特征

4組受試者在年齡、BMI和性別方面差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與對照組相比，ACOS穩(wěn)定期組和ACOS急性加重期組的FEV1、FVC、FEV1/FVC和PaO2均顯著降低(P<0.05)(見表1)。

表1 受試者的基本特征

二、EBC中的炎性細胞因子

與對照組相比，ACOS穩(wěn)定期組和ACOS急性加重期組患者EBC中的8-iso-PG、LTB4、IL-6和TNF-α水平均顯著升高(P<0.05)，其中，ACOS急性加重期組患者EBC中的8-iso-PG、LTB4、IL-6和TNF-α水平的升高程度顯著高于ACOS穩(wěn)定期組(P<0.05)(見表2)。

表2 各組患者EBC中的炎性細胞因子

三、ACOS患者EBC細胞因子與肺功能的關(guān)系

采用Pearson分析ACOS患者EBC細胞因子與肺功能的關(guān)系，結(jié)果顯示，細胞因子8-iso-PG、LTB4、TNF-α水平與FEV1、FVC、FEV1/FVC肺功能指標(biāo)顯著相關(guān)(P<0.05)(見表3)。

表3 ACOS患者EBC細胞因子與肺功能的關(guān)系

四、吸入皮質(zhì)類固醇對 ACOS患者EBC細胞因子的影響

研究評估了吸入皮質(zhì)類固醇對ACOS穩(wěn)定期組患者和ACOS急性加重期組患者的EBC中細胞因子水平的影響。結(jié)果顯示，在吸入皮質(zhì)類固醇后，ACOS穩(wěn)定期組和ACOS急性加重期組患者的EBC中8-iso-PG、LTB4、IL-6和TNF-α均顯著降低(P<0.05)(見表4)。

表4 吸入皮質(zhì)類固醇對 ACOS患者EBC細胞因子的影響

五、BALF和EBC細胞因子水平的相關(guān)性分析

目前還不清楚BALF與EBC中相同細胞因子的相關(guān)性。本研究發(fā)現(xiàn)BALF和EBC中的8-iso-PG和LTB4細胞因子水平有顯著相關(guān)性(P<0.05)(見表5)。

表5 14例ACOS患者亞組中EBC和BALF細胞因子的相關(guān)性分析

討 論

慢性炎癥是ACOS的主要特征。這種炎癥過程的性質(zhì)已經(jīng)通過侵入性的方法，如活檢和支氣管鏡檢查進行了徹底的研究[7]。然而，這些方法具有相對的侵襲性，因此近年來更多的研究集中在開發(fā)無創(chuàng)技術(shù)來評估炎癥標(biāo)志物[8]。目前，EBC中細胞因子的檢測已在監(jiān)測慢阻肺患者炎癥過程中得到應(yīng)用，然而在ACOS患者中的應(yīng)用十分有限。本研究旨在通過分析健康非吸煙志愿者、健康吸煙志愿者和ACOS患者EBC中的細胞因子譜來表征炎癥。這項研究的重要發(fā)現(xiàn)是，與穩(wěn)定期ACOS患者、健康吸煙或不吸煙的志愿者相比，ACOS急性加重期患者的細胞因子水平顯著升高。其中急性加重期患者的8-iso-PG、LTB4、IL-6和TNF-α水平較穩(wěn)定期ACOS患者升高1.3～2.7倍，與Ayub等使用誘導(dǎo)痰進行分析的結(jié)果相似，但是觀察到的差異要大很多[9]。這主要是由于本研究采用多重微珠流式熒光免疫分析法，在發(fā)現(xiàn)急性與慢性炎癥中細胞因子水平差異方面非常敏感[10]。

中性粒細胞是ACOS氣道炎癥的重要組成部分，在支氣管活檢標(biāo)本和支氣管肺泡灌洗液中都有發(fā)現(xiàn)[11]。LTB4是嗜中性粒細胞的強效和選擇性趨化劑，可從巨噬細胞和上皮細胞以及活化的嗜中性粒細胞中釋放出來。在疾病惡化期間，LTB4的增加可能導(dǎo)致嗜中性粒細胞流入的增加[12]。8-iso-PG是活性氧損傷細胞膜脂質(zhì)花生四烯酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化而形成的穩(wěn)定的終末產(chǎn)物，是很強的血管收縮劑，且與去甲腎上腺素和血管緊張素具有協(xié)同作用；氧化損傷后細胞膜上酯化的8-iso-PG增加，可作為體內(nèi)氧化應(yīng)激的良好指標(biāo)[13]。TNF-α是由多種不同的細胞(如刺激的單核細胞，成纖維細胞和內(nèi)皮細胞)產(chǎn)生的多效性炎性細胞因子[5]。熊小明等[2]發(fā)現(xiàn)，LTB4、8-iso-PG等炎癥因子參與了ACOS患者氣道炎癥過程，并具有潛在的鑒別ACOS生物標(biāo)志物價值。劉洋等[14]研究證實ACOS患者在治療后EBC中8-iso-PG、LTB4、TNF-α均顯著降低，并且發(fā)現(xiàn)FEV1與8-iso-PG、LTB4、TNF-α呈負相關(guān)。與先前研究相似，本研究通過Pearson分析發(fā)現(xiàn)，EBC中細胞因子8-iso-PG、LTB4、TNF-α水平與ACOS患者的FEV1、FVC、FEV1/FVC肺功能指標(biāo)顯著相關(guān)，提示ACOS患者全身炎癥反應(yīng)較重，并且與肺功能損傷嚴(yán)重相關(guān)，存在更明顯的氣流阻塞[15]。因此，這些測量值可用于評估ACOS患者氣道炎癥的嚴(yán)重程度。

由于類固醇會影響許多系統(tǒng)中的細胞因子水平，因此我們評估了吸入皮質(zhì)類固醇對ACOS穩(wěn)定期組患者和ACOS急性加重期亞組中細胞因子水平的影響。觀察到在吸入皮質(zhì)類固醇后，ACOS穩(wěn)定期組和ACOS急性加重期組患者的EBC中8-iso-PG、LTB4、IL-6和TNF-α均顯著降低。實際上，吸入皮質(zhì)類固醇在ACOS中的作用是一個不斷爭論的問題。從這項研究可以得出結(jié)論，吸入皮質(zhì)類固醇對EBC中的細胞因子肯定有作用，甚至可以通過證明吸入皮質(zhì)類固醇對8-iso-PG、LTB4、IL-6和TNF-α的影響來強調(diào)這種作用。Ojanguren等[16]觀察到與本研究相似地結(jié)果，從穩(wěn)定的ACOS患者的活檢組織中采集的人支氣管上皮細胞上清液中的8-iso-PG和LTB4濃度較低，并且二者與吸入皮質(zhì)類固醇劑量呈負相關(guān)。此外，本研究還對同一患者的EBC與BALF液細胞因子水平的相關(guān)性進行分析。盡管每種細胞因子的數(shù)量各不相同，但仍然可以發(fā)現(xiàn)EBC與BALF液中8-iso-PG和LTB4細胞因子水平有顯著相關(guān)性。雖然，研究無法對不同細胞因子的不同行為提供很好的解釋，但是目前越來越多研究表明EBC在呼吸道醫(yī)學(xué)中的有用性[5,17]。因此，EBC中8-iso-PG和LTB4細胞因子在估計ACOS中氣道/肺部的炎癥程度似乎表現(xiàn)更好，并且有助于醫(yī)生監(jiān)測疾病并合理地跟隨治療。

這項研究證實了8-iso-PG、LTB4在ACOS患者炎癥監(jiān)測中的重要作用。EBC中的8-iso-PG、LTB4在ACOS患者中明顯增加，尤其是急性加重期患者，并且與患者的肺功能降低密切相關(guān)。因此，EBC中LTB4和8-iso-PG的測定為表征ACOS患者的炎癥程度提供另一種有用的診斷工具，并可能有助于檢測ACOS病情進展。