hsa_circ_0006411慢病毒載體的構(gòu)建及驗(yàn)證

盧 韜 董學(xué)君

非編碼RNA是指一類(lèi)不能編碼蛋白質(zhì)的RNA類(lèi)型(近年來(lái)發(fā)現(xiàn)有些非編碼RNA也具有編碼肽功能)，包括微小RNA、長(zhǎng)鏈非編碼RNA和環(huán)狀RNA等類(lèi)型[1,2]。環(huán)狀RNA是由mRNA前體反向剪接產(chǎn)生的閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)，雖然大多數(shù)不能編碼蛋白質(zhì)，但卻可以通過(guò)一系列機(jī)制調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，來(lái)發(fā)揮細(xì)胞學(xué)功能，在癌癥中也具有重要的調(diào)控作用[3]。PIK3R1基因可編碼p85a蛋白，作為磷脂酰肌醇3激酶(phosphoinositide 3-kinase,PI3K)通路中PI3K的調(diào)節(jié)亞基，在諸如乳腺癌，宮頸癌等實(shí)體瘤中顯著低表達(dá)，其可與PTEN結(jié)合，從而增強(qiáng)PTEN的脂質(zhì)磷酸酶活性，發(fā)揮抑癌作用[4～6]。本研究發(fā)現(xiàn)，來(lái)源于PIK3R1母基因的環(huán)狀RNA(hsa_circ_0006411)在多種實(shí)體瘤組織中低表達(dá)，為了研究其功能，擬構(gòu)建其慢病毒載體，并驗(yàn)證實(shí)用性后，用于后續(xù)的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。

對(duì)象與方法

1.試劑與儀器：In-Fusion?HD 克隆試劑盒(日本TaKaRa公司)，膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒(美國(guó)Omega公司)，pLC5-ciR載體(廣州吉賽公司)，RPMI1640培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司)，胎牛血清(美國(guó)ExCell Bio公司)，脂質(zhì)體2000(美國(guó)Invitrogen公司)；儀器主要有PCR儀(德國(guó)羅氏公司)，電泳儀(美國(guó)Bio-Rad公司)和冷凍離心機(jī)等。

2.載體構(gòu)建及測(cè)序鑒定：(1)目的片段擴(kuò)增：設(shè)計(jì)帶有EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位點(diǎn)的引物，序列見(jiàn)表1，以人細(xì)胞混合樣本cDNA為模板擴(kuò)增環(huán)狀RNA hsa_circ_0006411，目的片段在1.5%的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳后，按照膠回收試劑盒操作說(shuō)明回收純化目的片段。(2) 目的片段與載體連接：分別向目的片段和載體pLC5-ciR中加入EcoRⅠ和BamHⅠ酶，得到的產(chǎn)物連接成攜帶circ_0006411的pLC5-ciR表達(dá)載體。該表達(dá)載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，陽(yáng)性菌落擴(kuò)增后行PCR測(cè)序，與BLAST序列比對(duì)，看是否為目的hsa_circ_0006411 RNA序列；并比對(duì)測(cè)序得到的環(huán)化接頭位點(diǎn)與circbase中的環(huán)化位點(diǎn)序列，看是否完全一致，測(cè)序引物列見(jiàn)表1。

3.hsa_circ_0006411載體的驗(yàn)證：293T細(xì)胞接種于6孔板中，當(dāng)細(xì)胞80%匯合時(shí)轉(zhuǎn)染，分成hsa_circ_0006411載體、PLC5-ciR空載體及對(duì)照組分別轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，培養(yǎng)6h后換液，更換為完全培養(yǎng)基，40h以后觀察細(xì)胞GFP的表達(dá)，并收集細(xì)胞，PCR擴(kuò)增檢測(cè)circ_0006411的表達(dá)情況，以GAPDH為管家基因，2-ΔΔCT表示irc_0006411的相對(duì)表達(dá)量，引物序列見(jiàn)表1。

表1 各基因引物表

結(jié) 果

1.載體測(cè)序結(jié)果：構(gòu)建的PLC- hsa_circ_0006411載體經(jīng)轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞后，可在LA平板上檢測(cè)出陽(yáng)性菌落，該菌落PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果如圖1，經(jīng)BLAST序列比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，與GenBank上的人hsa_circ_0006411序列完全一致，測(cè)序后得到的環(huán)化接頭位點(diǎn)與circbase中的環(huán)化位點(diǎn)序列也完全一致(圖1)，載體構(gòu)建成功。

圖1 hsa_circ_0006411部分測(cè)序圖及環(huán)狀位點(diǎn)測(cè)序圖A.hsa_circ_0006411測(cè)序結(jié)果部分顯示的圖譜；B.hsa_circ_0006411環(huán)化位點(diǎn)處的顯示圖

2.轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后hsa_circ_0006411表達(dá)量及測(cè)序結(jié)果：轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后hsa_circ_0006411載體組、PLC5-ciR空載體及對(duì)照組相對(duì)表達(dá)量分別為9947.08±514.42、3.71±0.71和1.00±0.10，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2)，其擴(kuò)增曲線見(jiàn)圖3；顯微鏡下可見(jiàn)在293T細(xì)胞中的綠色熒光蛋白的表達(dá)，表明hsa_circ_0006411載體可在293T細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)circ_0006411環(huán)狀基因。

圖2 轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后基因表達(dá)情況

圖3 hsa_circ_0006411 PCR擴(kuò)增曲線黃色為GAPDH基因，其他為circ_0006411基因

討 論

環(huán)狀RNA在1976年首次在病毒中被發(fā)現(xiàn)[7]。作為非編碼RNA群體的一個(gè)重要組成部分，其形成機(jī)制為線狀mRNA前體物質(zhì)反向剪接形成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，其5′和3′末端通過(guò)磷酸二酯鍵連接，而不形成懸空的自由末端，相對(duì)于線性結(jié)構(gòu)而言，其環(huán)狀結(jié)構(gòu)使得其能夠更加穩(wěn)定的表達(dá)存在于組織、血液及其他體液中[8,9]。由于其非編碼特性，在生物體生命活動(dòng)，疾病發(fā)展過(guò)程中的作用一直以來(lái)都被忽視。直到近年來(lái)發(fā)現(xiàn)很多非編碼RNA的重要調(diào)控基因表達(dá)的功能被提出，才對(duì)circRNA的研究重新引起重視。加上現(xiàn)代生物技術(shù)和研究工具的發(fā)展，越來(lái)越多的研究表明，circRNA在人類(lèi)生命活動(dòng)過(guò)程中的重要作用，目前而言主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：①作為競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA(ceRNA機(jī)制，即競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miRNA，從而解除對(duì)與其結(jié)合的靶基因的抑制作用，來(lái)提高miRNA靶基因表達(dá))來(lái)調(diào)控特異性基因的表達(dá)[10,11]；②與RNA結(jié)合蛋白相互作用來(lái)抑制或調(diào)控該蛋白的活性[12,13]；③通過(guò)順式/反式作用與RNA直接結(jié)合來(lái)調(diào)控RNA的水平[14,15]；④可以作為模板翻譯成多肽[16～18]。上述circRNA的穩(wěn)定性特征及諸多功能，賦予其作為腫瘤發(fā)生、發(fā)展、診斷和治療等多種路徑分子的可能性，科學(xué)家的確發(fā)現(xiàn)其與肺癌、乳腺癌、泌尿生殖系統(tǒng)和消化系統(tǒng)等幾乎所有癌種的密切關(guān)系。

本研究主要為肺癌相關(guān)的環(huán)狀RNA的研究。前期研究發(fā)現(xiàn)，在肺癌組織中相對(duì)于癌旁組織低表達(dá)的circ_0006411,其母基因?yàn)榫幋aPI3K信號(hào)通道中調(diào)節(jié)亞基P85a的基因PIK3R1，該基因在不同腫瘤中的表達(dá)高低具有明顯的組織特異性，在乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、結(jié)腸癌和非小細(xì)胞肺癌中明顯低表達(dá)，其可能主要是發(fā)揮抑制PI3K/AKT下游的動(dòng)物雷帕素靶蛋白(mTOR)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來(lái)抑制腫瘤的增殖，促進(jìn)凋亡的作用[19,20]。今后擬進(jìn)一步研究circ_0006411在非小細(xì)胞肺癌中的作用機(jī)制，需先構(gòu)建該環(huán)狀RNA的載體。本研究以慢病毒載體PLC5-ciR為工具，通過(guò)基因工程的手段，成功構(gòu)建了攜帶該環(huán)狀基因的慢病毒載體，并在293T細(xì)胞中能顯著高表達(dá)，可以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。