細胞衰老過程中POLD1基因表達下調(diào)的甲基化調(diào)控機制

夏武杰 鄭如蓮 林維謙 宋 靜

衰老是細胞、組織、器官等隨著年齡增加，結構和功能出現(xiàn)漸進性退行性改變，最終走向不可逆的死亡過程。既往研究表明，基因組穩(wěn)定性的維持可能對衰老進程有決定性的影響[1,2]。在DNA修復基因缺失或突變的小鼠模型中，小鼠表現(xiàn)出類似于早衰的表型。如核苷酸切除修復蛋白ERCC1缺失可導致小鼠肝臟、大腦、皮膚和脾臟等組織的衰老[3,4]。反之，壽命的延長則與DNA修復效率提高有關[5]。POLD1是人源DNA聚合酶δ催化亞基的編碼基因，在DNA損傷修復以及維持基因組結構的完整性和穩(wěn)定性等方面發(fā)揮著重要作用[6]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，在阿爾茲海默癥患者中POLD1表達隨著年齡增長逐漸下降，且與病情進展呈正相關, 推測POLD1可能參與細胞衰老過程[7]。然而POLD1表達下調(diào)的機制尚不清楚。DNA甲基化是基因表達調(diào)控的重要方式之一，它與衰老、腫瘤、遺傳疾病等的發(fā)生和發(fā)展密切相關。本研究中筆者通過檢測人胚肺二倍體成纖維細胞(human embryonic lung diploid fibroblasts，2BS)衰老過程中POLD1基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)及POLD1 mRNA和蛋白表達水平變化，分析去甲基化對POLD1基因表達的影響，探討2BS衰老過程中POLD1基因表達的甲基化調(diào)控機制。

材料與方法

1.材料：(1)細胞株：人胚肺二倍體成纖維細胞株(2BS)由北京大學醫(yī)學部生物化學與分子生物學實驗室惠贈。(2)主要試劑：DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清均購自美國Gibco公司；RNA提取及反轉(zhuǎn)錄試劑盒、DNA提取試劑盒和DNA重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化試劑盒均購自天根生化科技(北京)有限公司；蛋白提取試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；全基因組DNA甲基化測定試劑盒購自美國Epigentek公司；BSP擴增試劑盒購自日本TaKaRa公司；POLD1兔抗人單克隆抗體購自英國Abcam公司，羊抗兔辣根過氧化物酶抗體購自北京中杉金橋生物技術有限公司；5-氮雜-2′-脫氧胞苷購自美國Sigma公司；引物由美國ThermoFisher公司合成。(3)主要儀器：ABI2720PCR擴增儀(美國ABI公司)；CX31-32RFL型生物顯微鏡(日本Olympus公司)；5417型臺式高速冷凍離心機(德國Eppendorf公司)。

2.細胞培養(yǎng)：使用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在飽和濕度、37℃、5%CO2通用培養(yǎng)條件下培養(yǎng)2BS。當細胞融合度約90%時，細胞1∶2傳代培養(yǎng)。30代以下為年輕細胞，55代及以上為衰老細胞。

3.RT-PCR檢測POLD1 mRNA表達：提取25PD和55PD 2BS總RNA、第一鏈cDNA的合成，引物序列及產(chǎn)物大小見表1，以GAPDH為內(nèi)參，PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像儀下成像，觀察PCR擴增結果。RT-PCR反應條件：95℃預變性2min；95℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共40個循環(huán)；72℃延伸5min。

4.Western blot法檢測POLD1蛋白表達：收集25PD和55PD 2BS提取總蛋白，BCA法進行蛋白定量，100℃煮沸5min使蛋白變性后，取50μg總蛋白進行10% SDS-PAGE電泳，蛋白電泳分離后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉1h，一抗封閉，4℃過夜，室溫封閉二抗2h，ECL顯色，觀察結果。以GAPDH表達為內(nèi)參，用Image J進行相對定量分析。

表1 PCR 反應引物序列及擴增片段長度

5.DNA提取與亞硫酸氫鹽修飾后測序：提取25PD和55PD 2BS基因組DNA，將純化好的DNA溶液，用亞硫酸氫鹽DNA修飾試劑盒，按照操作手冊進行亞硫酸氫鈉的轉(zhuǎn)化。將修飾后的樣品進行巢式PCR擴增，引物見表2。然后將PCR產(chǎn)物通過1%瓊脂糖凝膠電泳分離后回收純化，連接T載體后將陽性克隆的樣本送日本TaKaRa公司進行測序。RT-PCR反應條件：95℃預變性5min；95℃變性30s，45℃退火30s，72℃延伸40s，共35 個循環(huán)；72℃延伸5min。

6.5-Aza-dc去甲基化處理：以2×105個/孔的細胞濃度，將48PD 2BS接種于6孔板中。接種第2天起，每24h更換培養(yǎng)基為5μmol/L 5-Aza-dc的完全DMEM培養(yǎng)基。培養(yǎng)96h后，收集細胞，提取總RNA，采用RT-PCR檢測POLD1 mRNA表達水平。

結 果

1.2BS衰老過程中POLD1 mRNA表達水平的變化：采用RT-PCR法檢測年輕(25PD)和衰老(55PD)2BS POLD1 mRNA表達情況(圖1)。衰老2BS POLD1 mRNA表達水平較年輕2BS顯著下降(P<0.01)。

2.2BS衰老過程中POLD1蛋白的表達水平的變化：采用Western blot法檢測年輕(25PD)和衰老(55PD)2BS POLD1蛋白表達情況(圖2)。衰老2BS POLD1蛋白表達水平較年輕2BS顯著下降(P<0.01)。

3.2BS衰老過程中POLD1基因甲基化狀態(tài)的變化：通過搜索UCSC基因數(shù)據(jù)庫，得到POLD1啟動子區(qū)基因序列，取轉(zhuǎn)錄起始位點-2000bp～+300bp區(qū)段序列作為研究對象，采用MethyPrimer在線分析軟件對POLD1啟動子區(qū)基因序列進行甲基化島預測分析，POLD1啟動子區(qū)存在4個CpG島。采用BSP法檢測年輕(25PD)和衰老(55PD)2BS POLD1啟動子區(qū)甲基化水平(圖3)。衰老2BS POLD1啟動子區(qū)甲基化水平較年輕2BS顯著升高(P<0.01)。

表2 BSP相關引物信息

圖1 不同代齡2BS POLD1 mRNA表達水平A.RT-PCR法檢測不同代齡2BS POLD1 mRNA表達量；B.不同代齡POLD1相對mRNA表達量統(tǒng)計分析結果,*P<0.01

圖2 不同代齡2BS POLD1 蛋白表達水平A.Western blot法檢測不同代齡2BS POLD1 蛋白表達量；B.不同代齡POLD1相對蛋白表達量統(tǒng)計分析結果,*P<0.01

圖3 不同代齡2BS POLD1啟動子區(qū)甲基化水平A.BSP法檢測不同代齡2BS POLD1 啟動子區(qū)CpG島的DNA甲基化水平；B.不同代齡POLD1啟動子區(qū)甲基化水平統(tǒng)計分析結果,*P<0.01

4.POLD1 mRNA表達與啟動子甲基化的關系：分析年輕和衰老2BS POLD1 mRNA表達水平和其啟動子甲基化水平相關性(圖4)。POLD1啟動子區(qū)甲基化水平與其mRNA表達水平呈負相關(n=6，r2=0.853，P=0.009)。為進一步闡明POLD1甲基化與其mRNA表達水平間的關系，以5μmol/L 5-Aza-dc去甲基化試劑處理48PD 2BS，采用RT-PCR法檢測POLD1 mRNA表達水平(圖5)。去甲基化試劑處理組POLD1表達水平明顯增加(P<0.01)。

討 論

POLD1是DNA復制和損傷修復中最重要的基因之一，位于第19號染色體q13.3-q13.4上，其cDNA全長約3.5kb，編碼1107個氨基酸[6]。POLD1基因缺陷不僅與腫瘤關系密切，也增加早老綜合征如沃納綜合征(Werner syndrome)的發(fā)生風險[8～11]。此外，研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)POLD1表達，細胞生長增殖能力顯著下降，細胞周期減慢，DNA合成減低，DNA損傷明顯增加[12]。動物實驗進一步證實，沉默POLD1基因表達可導致小鼠神經(jīng)元細胞發(fā)生早衰[7]。近年來，一些研究者觀察到DNA損傷修復基因如BRCA1、BLM等在衰老過程中表達均有所降低[13,14]。而本研究結果顯示，在2BS衰老過程中POLD1呈增齡性表達下調(diào)，也再次證實了上述觀點。

圖4 POLD1啟動子區(qū)甲基化水平與其mRNA 表達水平的相關性分析

圖5 5μmol/L 5-Aza-dc處理前后POLD1mRNA表達水平A.RT-PCR法檢測5μmol/L 5-Aza-dc處理2BS前后POLD1 mRNA表達量；B.5μmol/L 5-Aza-dc處理前后POLD1相對mRNA表達量統(tǒng)計分析結果。NC.正常對照組；*P<0.01

近年來，DNA甲基化在衰老的發(fā)生、發(fā)展中的作用越來越受到國內(nèi)外研究者的重視，成為目前衰老領域研究的熱點之一。DNA甲基化是指DNA的5′-C胞嘧啶p磷酸G鳥嘌呤-3′(CpG)雙核苷酸位點的胞嘧啶在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的催化下，以S-腺苷甲硫氨酸為甲基供體，將甲基轉(zhuǎn)移到特定堿基上的化學修飾過程。一般來說，低甲基化可促進基因的表達，而高甲基化則抑制基因表達。體外研究發(fā)現(xiàn)，將已甲基化的序列轉(zhuǎn)入細胞后則其表達抑制，而許多內(nèi)源基因經(jīng)去甲基化試劑如5-Aza-dc處理后可被激活[15,16]。本研究結果顯示，在2BS衰老過程中POLD1啟動子區(qū)甲基化水平呈增高趨勢，且POLD1 mRNA表達水平與其啟動子區(qū)甲基化水平呈負相關；經(jīng)5-Aza-dc處理后，POLD1 mRNA表達水平明顯增高。POLD1表達水平與其啟動子甲基化水平呈負相關，提示POLD1啟動子區(qū)甲基化水平的改變與其增齡性表達下調(diào)有密切關系。

目前研究認為DNA甲基化影響基因表達的機制可能是：(1)某些可與DNA結合的轉(zhuǎn)錄因子對結合位點甲基化較敏感，當該位點處于甲基化狀態(tài)時，這類轉(zhuǎn)錄因子和其他轉(zhuǎn)錄相關蛋白無法正確地識別并結合到相應位點從而造成轉(zhuǎn)錄抑制。(2)DNA甲基化后，甲基化CpG結合蛋白與甲基化CpG殘基結合，并與其他轉(zhuǎn)錄抑制因子共同抑制基因轉(zhuǎn)錄，其介導的轉(zhuǎn)錄抑制取決于甲基化密度和啟動子強度，低密度甲基化可能抑制弱的啟動子，而一個強的啟動子可能不受甲基化的影響。(3)具有轉(zhuǎn)錄活性的基因序列甲基化后與甲基化CpG特異性結合蛋白相結合，使組蛋白脫乙?；?，染色質(zhì)結構變化致使轉(zhuǎn)錄抑制發(fā)生[17,18]。既往研究發(fā)現(xiàn)，POLD1可間接通過p53、E2F1和Sp1等轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控促進腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，推測POLD1啟動子區(qū)CpG位點甲基化可能通過阻礙轉(zhuǎn)錄因子與啟動子的結合，從而抑制POLD1基因的轉(zhuǎn)錄和表達[19,20]。

綜上所述，本研究結果表明，POLD1啟動子區(qū)CpG島的DNA甲基化水平是細胞衰老的重要特征，較高的甲基化水平參與該基因的表達調(diào)控。通過調(diào)節(jié)POLD1啟動子區(qū)DNA甲基化水平，對于衰老和衰老相關疾病的預防和治療具有一定的啟示作用。進一步深入研究POLD1啟動子區(qū)的DNA甲基化調(diào)控機制，有助于更好地闡釋細胞衰老過程中的表觀遺傳學調(diào)控機制。