LncRNA SOX2OT海綿吸附miR-34a促進(jìn)SOX2表達(dá)增強(qiáng)大腸癌多藥耐藥

郭飄婷 鄒陽

大腸癌是臨床常見的消化道惡性腫瘤，據(jù)美國(guó)癌癥協(xié)會(huì)公布的數(shù)據(jù)顯示，大腸癌是發(fā)病率和死亡率最高的消化系統(tǒng)惡性腫瘤[1]?；熓谴竽c癌的主要治療手段之一[2-3]，而多藥耐藥是大腸癌化療失敗的重要原因[4-6]。表觀遺傳的改變與大腸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[7-8]，作為長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)之一的SOX2OT本身不編碼蛋白質(zhì)，但可通過表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后等多個(gè)層次參與基因表達(dá)的調(diào)控，發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)功能[9-11]。近年來，多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，SOX2OT在腫瘤發(fā)生過程中過表達(dá)或表達(dá)抑制，作為癌基因或抑癌基因而發(fā)揮作用[12]，但其在大腸癌中的表達(dá)水平、對(duì)耐藥性的調(diào)節(jié)及其上下游分子機(jī)制尚不明。本研究檢測(cè)SOX2OT對(duì)大腸癌HCT-116細(xì)胞化療抵抗性細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，并進(jìn)一步探討SOX2OT通過靶向調(diào)控下游基因介導(dǎo)HCT-116化療抵抗作用的確切機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸癌細(xì)胞HCT-116購自上海中科院細(xì)胞庫。5-FU、CDDP購自美國(guó)Sigma公司；長(zhǎng)春新堿(VCR)購自深圳萬樂藥業(yè)有限公司；Taxol購自Bristol-Myers Squibb公司；TRIzol、BCP購自Sigma公司；異丙醇購自Acros organics公司；RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Promega公司；SYBR購自Thermo公司；DMEM培養(yǎng)基、胰酶購自GIBCO公司；胎牛血清購自BI公司；SOX2OT質(zhì)粒及空白質(zhì)粒、pMIR-SOX2OT-Luc質(zhì)粒、pMIR-Mut SOX2OT-Luc質(zhì)粒、pMIR-SOX2-Luc質(zhì)粒、pMIR-Mut SOX2-Luc質(zhì)粒由全基因合成；雙熒光素酶報(bào)告分析系統(tǒng)試劑盒購自Promega公司；miR-34a mimic、模擬物對(duì)照(NC mimic)購自上海吉瑪公司。引物由上海桑尼公司合成，β-actin-F(5′ to 3′)：AGCAGTTGTAGCTACCCGCCCA，β-actin-R(5′ to 3′)：GGCGGGCACGTTGAAGGTCT；SOX2OT-F(5′ to 3′)：GCATCTCTGCAAGGTAGGTT，SOX2OT-R(5′ to 3′)：GGCCATGAACTGACTCGAAA；SOX2-F(5′ to 3′)：CGGCAATAGCATGGCGA，SOX2-R(5′ to 3′)：CATGGAGTTGTACTGCAGGG；U6-F(5′ to 3′)：CTCGCTTCGGCAGCACA，U6-R(5′ to 3′)：AACGCTTCACGAATTTGCGT；miR-34a RT：GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGAT ACGACTGGCAG；miR-34a-F(5′ to 3′)：GGGTCCGAGGTAT，miR-34a-R(5′ to 3′)：ACAACCAGCTAAGACA。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

HCT-116細(xì)胞用含10%胎牛血清(FBS)、100 U/mL青霉素和鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，在5% CO237℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)至80%～90%時(shí)按1∶2 ～1∶4的密度傳代，每2～3天傳代1次，取其對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

將細(xì)胞以2×105個(gè)/孔接種于6孔板中，置于孵育箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)至70～80%。構(gòu)建SOX2OT過表達(dá)的大腸癌HCT-116細(xì)胞：通過全基因合成pcDNA3.1-SOX2OT重組質(zhì)粒和空質(zhì)粒pcDNA3.1，用Lipo2000將其分別轉(zhuǎn)染HCT-116細(xì)胞，設(shè)為SOX2OT組和Control組；構(gòu)建miR-34a過表達(dá)的大腸癌HCT-116細(xì)胞：用Lipo2000分別將NC mimic、miR-34a mimic轉(zhuǎn)染細(xì)胞，設(shè)為NC mimic組和miR-34a mimic組。分別在轉(zhuǎn)染24 h和48 h后，提取總RNA，熒光定量PCR檢驗(yàn)lncRNA SOX2OT、miR-34a的過表達(dá)效率以確定最佳轉(zhuǎn)染時(shí)間。

1.4 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖

實(shí)驗(yàn)分為以下三組：Control+NC mimic(轉(zhuǎn)染NC minic)、SOX2OT+NC mimic(共轉(zhuǎn)染SOX2OT、NC mimic)、SOX2OT+miR-34a(共轉(zhuǎn)染SOX2OT、miR-34a mimic)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HCT-116細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化，以5×103個(gè)/孔的濃度接種于96孔板中，每孔加入100 μL完全培養(yǎng)基。過夜貼壁后加入5個(gè)濃度梯度的5-FU、VCR、CDDP和TAXOL，每孔設(shè)3個(gè)復(fù)孔，孵育48 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，待其完全混勻，放入孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h。用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔OD值(測(cè)定波長(zhǎng)450 nm，參比波長(zhǎng)650 nm)。計(jì)算5-氟嘧啶(5-Fu)、長(zhǎng)春新堿(VCR)、順鉑(CDDP)、紫杉醇(TAXOL)四種化療藥物對(duì)HCT-116細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)、耐藥指數(shù)(Resistance Factor，RF)和逆轉(zhuǎn)倍數(shù)(Reverse index，RI)。RF=SOX2OT+NC mimic組IC50值/Control+NC mimic組IC50值；RI=SOX2OT+NC mimic組IC50值/SOX2OT+miR-34a組IC50值。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)三次。

1.5 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)

借助生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫miRcode網(wǎng)站，發(fā)現(xiàn)miR-34a同時(shí)與SOX2OT、SOX2存在互補(bǔ)序列，分別利用LncBase Predicted v.2和bibiserv網(wǎng)站預(yù)測(cè)到miR-34a與SOX2OT、SOX2的結(jié)合序列。構(gòu)建pMIR-SOX2OT-Luc、pMIR-SOX2-Luc質(zhì)粒，對(duì)miR-34a在SOX2OT、SOX2的潛在結(jié)合序列進(jìn)行反義突變，合成pMIR-Mut SOX2OT-Luc質(zhì)粒、pMIR-Mut SOX2-Luc質(zhì)粒。基因測(cè)序鑒定后，用于雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)，以確定miR-34a與SOX2OT、SOX2結(jié)合具體位點(diǎn)及序列。

驗(yàn)證SOX2OT與miR-34a的結(jié)合關(guān)系時(shí)，設(shè)置分組：pMIR-SOX2OT-Luc+NC mimic組(pMIR-SOX2OT-Luc與NC mimic共轉(zhuǎn)染細(xì)胞24 h)、pMIR-Mut SOX2OT-Luc+NC mimic組(pMIR-Mut SOX2OT-Luc與NC mimic共轉(zhuǎn)染細(xì)胞24 h)、pMIR-SOX2OT-Luc+miR-34a mimic組(pMIR-SOX2OT-Luc與miR-34a mimic共轉(zhuǎn)染細(xì)胞24 h)、pMIR-Mut SOX2OT-Luc+miR-34a mimic組(pMIR-Mut SOX2OT-Luc與miR-34a mimic共轉(zhuǎn)染細(xì)胞24 h)；驗(yàn)證SOX2與miR-34a的結(jié)合關(guān)系時(shí)，設(shè)置分組：pMIR-SOX2-Luc+NC mimic組(pMIR-SOX2-Luc與NC mimic共轉(zhuǎn)染細(xì)胞24 h)、pMIR-Mut SOX2-Luc+NC mimic組(pMIR-Mut SOX2-Luc與NC mimic共轉(zhuǎn)染細(xì)胞24 h)、pMIR-SOX2-Luc+miR-34a mimic組(pMIR-SOX2-Luc與miR-34a mimic共轉(zhuǎn)染細(xì)胞24 h)、pMIR-Mut SOX2-Luc+miR-34a mimic組(pMIR-Mut SOX2-Luc與miR-34a mimic共轉(zhuǎn)染細(xì)胞24 h)。

將HCT-116細(xì)胞接種于96孔板，培養(yǎng)24 h，使其細(xì)胞融合度達(dá)到80%，按上述實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。每孔加入100 μL 1×裂解緩沖液裂解細(xì)胞。離心，取20 μL上清加入到96孔板中，再加入50 μL LAR II，置于檢測(cè)儀檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)束后，取出96孔板，再加入50 μL Stop &Glo?Reagent，再次置于檢測(cè)儀檢測(cè)。計(jì)算相對(duì)熒光強(qiáng)度。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)三次。

1.6 熒光定量PCR

采用TRIzol一步法提取總RNA。計(jì)算出1.5 μg RNA需要量，用DEPC-H2O補(bǔ)充至13 μL，SOX2OT、miR-34a、SOX2逆轉(zhuǎn)錄時(shí)，每個(gè)樣本中分別再加入1 μL Random，miR-34a RT引物及oligo dT，70℃下靜置5 min后置于冰上。按SYBR Green實(shí)時(shí)PCR試劑盒說明進(jìn)行RNA逆轉(zhuǎn)錄及PCR反應(yīng)，共計(jì)40個(gè)循環(huán)。以2-△△CT法計(jì)算待測(cè)樣本mRNA相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)三次。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 miR-34a與SOX2OT、SOX2的結(jié)合關(guān)系驗(yàn)證

圖1A為miR-34a與SOX2OT的預(yù)測(cè)結(jié)合序列。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果顯示，與pMIR-SOX2OT-Luc+NC mimic組相比，pMIR-SOX2OT-Luc+miR-34a mimic組的熒光素酶活性顯著降低(P<0.01)；而pMIR-Mut SOX2OT-Luc+miR-34a mimic組的熒光素酶活性與pMIR-Mut SOX2OT-Luc+NC mimic組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(圖1B)。

圖1 驗(yàn)證miR-34a與SOX2OT、SOX2的靶向結(jié)合Figure 1 Verify the targeted binding of miR-34a to SOX2OT and SOX2Note：A.The predicted combination sequence of SOX2OT and miR-34a；B.The binding site of SOX2OT and miR-34a was confirmed by Dual Luciferase Reporter Gene Assay；C.The predicted combination sequence of SOX2 and miR-34a；D.The binding site of SOX2 and miR-34a was confirmed by Dual Luciferase Reporter Gene Assay.**P<0.01.

圖1C為miR-34a與SOX2的預(yù)測(cè)結(jié)合序列。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示，與pMIR-SOX2-Luc+NC mimic組相比，pMIR-SOX2-Luc+miR-34a mimic組的熒光素酶活性顯著降低(P<0.01)；而pMIR-Mut SOX2-Luc+miR-34a mimic組的熒光素酶活性與pMIR-Mut SOX2-Luc+NC mimic組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(圖1D)。

2.2 SOX2OT、miR-34a過表達(dá)效果鑒定

熒光定量PCR結(jié)果表明，HCT-116細(xì)胞中SOX2OT、miR-34a過表達(dá)有效，轉(zhuǎn)染24 h時(shí)SOX2OT、miR-34a的過表達(dá)效率更高(P<0.01)，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)將選擇24 h作為SOX2OT和miR-34a的最佳轉(zhuǎn)染時(shí)間(圖2A，2B)。

2.3 SOX2OT與miR-34a相互負(fù)向調(diào)節(jié)

qRT-PCR檢測(cè)HCT-116細(xì)胞中SOX2OT過表達(dá)后miR-34a的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)與Control組相比，miR-34a表達(dá)明顯下降(P<0.05)(圖3A)。過表達(dá)miR-34a，SOX2OT表達(dá)顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(圖3B)。

2.4 miR-34a可逆轉(zhuǎn)由SOX2OT導(dǎo)致的HCT-116細(xì)胞多藥耐藥

CCK-8結(jié)果顯示，SOX2OT+NC mimic組細(xì)胞對(duì)各化療藥物IC50值較Control+NC mimic組顯著升高(P<0.01)，提示過表達(dá)SOX2OT增強(qiáng)HCT-116細(xì)胞對(duì)各化療藥物的抗藥性(表1)。

共轉(zhuǎn)染組SOX2OT+miR-34a組5-FU，VCR，CDDP，TAXOL的IC50值與SOX2OT+NC mimic組IC50值相比均顯著下降(P<0.01)，其中5-FU、CDDP的IC50值與Control+NC mimic無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

2.5 SOX2OT作為海綿吸附miR-34a促進(jìn)SOX2的表達(dá)

qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染miR-34a mimic后，SOX2表達(dá)下降(P<0.01)(圖4A)，說明SOX2是miR-34a的一個(gè)功能性靶標(biāo)。與此同時(shí)，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-SOX2OT重組質(zhì)粒后，SOX2表達(dá)增加(P<0.01)(圖4B)。綜上表明SOX2OT作為海綿吸附miR-34a從而促進(jìn)SOX2的表達(dá)。

圖2 SOX2OT、miR-34a過表達(dá)效果檢測(cè)Figure 2 The overexpression efficiency testing of SOX2OT and miR-34aNote：A.Verify the overexpression of SOX2OT.**P<0.01，when compared with Control group；B.Verify the overexpression of miR-34a.**P<0.01，when compared with NC mimic group.

圖3 RT-qPCR驗(yàn)證SOX2OT與miR-34a的負(fù)性調(diào)控Figure 3 The negative regulation of SOX2OT and miR-34a was verified by RT-qPCRNote：A.Detection of miR-34a expression level by qRT-PCR.*P<0.05，when compared with control group；B.Detection of SOX2OT expression level by qRT-PCR.**P<0.01，when compared with NC mimic group.

表1 HCT-116細(xì)胞對(duì)不同種類化療藥物的IC50值

圖4 SOX2OT海綿吸附miR-34a上調(diào)SOX2Figure 4 SOX2OT sponged miR-34a to upregulate SOX2Note：A.miR-34a down-regulates SOX2 expression.**P<0.01，when compared with NC mimic group；B.SOX2OT up-regulates SOX2 expression.**P<0.01，when compared with Control group.

3 討論

目前大腸癌的治療主要包括手術(shù)和化療，其中早期大腸癌治療仍首選手術(shù)切除，但對(duì)于失去手術(shù)機(jī)會(huì)或術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的晚期患者，化療則是延長(zhǎng)生存期的主要治療手段[13]。多種結(jié)構(gòu)不同、作用機(jī)制不同的抗癌藥物，能在短期內(nèi)緩解大腸癌患者病情，然而所有針對(duì)腫瘤細(xì)胞的治療往往會(huì)由于基因突變而形成耐藥，使得大腸癌的治療十分棘手。腫瘤MDR指的是腫瘤細(xì)胞不僅對(duì)一種抗腫瘤藥物產(chǎn)生耐藥性，對(duì)其他多種結(jié)構(gòu)以及作用靶點(diǎn)不同的抗腫瘤藥物同時(shí)產(chǎn)生抗藥性的現(xiàn)象[14]，探尋MDR的有效逆轉(zhuǎn)策略和高效低毒的逆轉(zhuǎn)劑成為目前腫瘤治療的熱點(diǎn)，也是腫瘤治療新的領(lǐng)域。

lncRNAs是包含最大人類基因組的多種類非編碼RNA，轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度超過200個(gè)核苷酸。雖僅有1%～2%的轉(zhuǎn)錄因子具有蛋白翻譯的能力，lncRNAs可通過染色質(zhì)重塑、轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及轉(zhuǎn)錄后等多途徑參與機(jī)體的表觀遺傳調(diào)控[15]。SOX2基因嵌入非編碼RNA的內(nèi)含子區(qū)，引起SOX2重疊轉(zhuǎn)錄，稱為SOX2OT(SRY-box 2 overlapping transcript)[16]。研究顯示在胰腺癌[17]、乳腺癌[18]等多種惡性腫瘤中均存在SOX2OT異常表達(dá)，Zhang等[19]研究發(fā)現(xiàn)，SOX2OT在胃癌組織和細(xì)胞系中比正常胃組織、正常胃上皮細(xì)胞系明顯增高，其表達(dá)水平與腫瘤浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、臨床分期密切相關(guān)，提示SOX2OT可作為臨床有用的診斷或預(yù)后生物標(biāo)記物或癌癥治療靶點(diǎn)。目前SOX2OT在大腸癌HCT-116細(xì)胞耐藥中發(fā)揮的角色仍不清晰，其對(duì)大腸癌耐藥產(chǎn)生影響的具體機(jī)制有待明確。

微小RNA(miRNAs)是一類非編碼小分子RNA，長(zhǎng)度一般為18～22個(gè)核苷酸分子[20]。LncRNA可作為競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA(ceRNA)，通過海綿機(jī)制結(jié)合miRNA，從而降低miRNA活性，間接上調(diào)miRNA相關(guān)靶基因的表達(dá)[21]。miR-34a屬于miR-34家族，位于人染色體1p36.22位點(diǎn)上。多項(xiàng)研究證明，miR-34a在乳腺癌[22]、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤[23]等腫瘤組織中呈低表達(dá)，發(fā)揮抑制增殖、逆轉(zhuǎn)耐藥等功能，但在miR-34a與SOX2OT互作并參與大腸癌耐藥性調(diào)控方面目前暫無相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。

本研究以人大腸癌細(xì)胞HCT-116為研究對(duì)象，構(gòu)建SOX2OT、miR-34a過表達(dá)大腸癌細(xì)胞模型，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)SOX2OT可抑制miR-34a，上調(diào)SOX2表達(dá)；過表達(dá)miR-34a可同時(shí)下調(diào)SOX2OT、SOX2水平。CCK-8檢測(cè)證明SOX2OT過表達(dá)后HCT-116細(xì)胞對(duì)化療藥物5-FU、VCR、CDDP和TAXOL的敏感性降低，而miR-34a逆轉(zhuǎn)由SOX2OT導(dǎo)致的化療抵抗。結(jié)合我們通過生物信息學(xué)的方法發(fā)現(xiàn)的結(jié)論：miR-34a與SOX2OT、SOX2同時(shí)存在互補(bǔ)序列，基于此我們進(jìn)一步挖掘出miR-34a與SOX2OT、SOX2之間的潛在結(jié)合位點(diǎn)，獲取結(jié)合序列，通過設(shè)計(jì)并化學(xué)合成可能作用位點(diǎn)反義突變處理的突變型重組雙熒光素酶基因報(bào)告載體。運(yùn)用雙熒光素酶報(bào)告基因技術(shù)證明miR-34a可與SOX2OT和SOX2進(jìn)行靶向結(jié)合。以上實(shí)驗(yàn)充分證實(shí)在大腸癌細(xì)胞HCT-116中SOX2OT作為海綿吸附miR-34a從而促進(jìn)SOX2的表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致多藥耐藥。

綜上所述，本研究揭示了SOX2OT增強(qiáng)大腸癌HCT-116細(xì)胞多藥耐藥，其作用機(jī)制與海綿吸附miR-34a從而促進(jìn)SOX2的表達(dá)有關(guān)。SOX2OT可能作為抗癌藥物的作用靶點(diǎn)。