李 菁, 張小飛, 譚清峰, 楊雨欣

(1.西安文理學(xué)院 生物與環(huán)境工程學(xué)院，陜西 西安 710065;2.西安市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，陜西 西安 710061)

玉米灰斑病是由尾孢菌Cercospora侵染引起的一種世界性病害，該病于1924年在美國伊利諾伊州首次被發(fā)現(xiàn)[1]，隨后逐步蔓延至世界主要玉米種植區(qū)[2,3]。我國于1991年首次報(bào)道了該病的發(fā)生[4]，至今在遼寧、吉林和黑龍江東北春玉米區(qū)和西南地區(qū)普遍發(fā)生，在陜西發(fā)生呈現(xiàn)快速上升趨勢(shì)[5]。值得注意的是，在西南地區(qū)和陜西等地發(fā)生的玉米灰斑病病原為玉米尾孢(Cercosporazeina)，與我國北方地區(qū)玉米灰斑病病原玉蜀黍尾孢(Cercosporazeae-maydis)分屬于不同的種[6～9]。研究者認(rèn)為玉米灰斑病屬數(shù)量性狀遺傳，同時(shí)受基因加性、顯性和上位性效應(yīng)控制[10～12]；由于兩種病原菌的致病力不同，所以對(duì)C. zeae-maydis侵染的灰斑病抗性遺傳研究并不能完全反映玉米灰斑病的抗病遺傳規(guī)律。筆者研究利用尾孢灰病抗性差異顯著的優(yōu)良高抗自交系R225和高感材料掖478組配的 F2群體為作圖群體，構(gòu)建高密度遺傳連鎖圖譜。采用田間誘發(fā)鑒定對(duì)F2:3群體進(jìn)行多年多點(diǎn)抗性綜合分析。利用QTL IciMapping 分子標(biāo)記作圖軟件分析玉米尾孢菌抗性QTL，為抗病基因的精細(xì)定位提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 群體構(gòu)建

根據(jù)多年的田間鑒定結(jié)果并參考農(nóng)藝性狀表現(xiàn)，選取玉米自交系R225和掖478 為作圖群體的親本。2011年冬季在海南島以R225(高抗灰斑病的優(yōu)良自交系)為父本，掖478(高感灰斑病骨干自交系)為母本進(jìn)行雜交，獲得F1 種子，2012年夏季將F1植株套袋自交產(chǎn)生F2種子，2012年冬播種F2種子，選取其中的345個(gè)F2單株作為研究群體。

1.2 表型鑒定

于2013年和2014年，在云南德宏和湖北恩施種植345個(gè)F2:3家系及其親本，進(jìn)行田間自然誘發(fā)鑒定。每50～100份鑒定材料設(shè)抗病親本、感病親本做對(duì)照，鑒定小區(qū)行長4 m，行距0.7 m，留苗15～20株，株距略小于大田生產(chǎn)，其他田間管理措施同當(dāng)?shù)厣a(chǎn)管理，整個(gè)生育期不打殺菌劑。乳熟期記載單株發(fā)病級(jí)別。

1.3 基因組DNA提取

取少量幼嫩組織于液氮中研磨，加入CTAB裂解緩沖液(10%CTAB、5 mol·L-1NaC1、1 mol·L-1、pH 值8.0 Tris-HC1、0.5 mol·L-1EDTA、0.2%巰基乙醇)，氯仿/異戊醇(24∶)抽提兩次，用異丙醇沉淀、乙醇洗滌，干燥后加入1×TE緩沖液溶解DNA，用Nanodrop 2000測(cè)定濃度，統(tǒng)一稀釋到30 ng·μL-1備用。

1.4 SSR標(biāo)記的檢測(cè)

SSR引物序列選自MaizeDB(http://www.maizegdb.org)，由上海生工生物工程公司合成，采用10 PCR反應(yīng)體系，Taq酶(5U·μL-1)0.2 μL，10×PCR buffer 1 μL，25 mmol·L-1MgCl21μL，2.5 mmol·L-1dNTP 0.5 μL，10 mmol·L-1SSR引物各1 μL，30 ng DNA模板，加ddH2O補(bǔ)足至10 μL，反應(yīng)液上加蓋20 μL礦物油。擴(kuò)增程序?yàn)?4℃預(yù)變性4 min，1個(gè)循環(huán)；94℃變性30s；65℃復(fù)性40s；72℃延伸40s，然后每個(gè)循環(huán)降低1℃，至退火溫度為55℃，再循環(huán)30次；72℃延伸10 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物與2 μl上樣緩沖液混合用6.0%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，記錄下親本及各家系的帶型情況。

1.5 QTL作圖及基因效應(yīng)分析

利用QTL Icimapping 軟件進(jìn)行抗病QTL定位分析。打開軟件，導(dǎo)入構(gòu)建準(zhǔn)備好的map格式圖譜的數(shù)據(jù)，點(diǎn)擊分組出現(xiàn)group群，完成分組后，擊ordering命令，轉(zhuǎn)換成染色體，點(diǎn)擊工具欄上的map圖標(biāo)進(jìn)行遺傳連鎖圖譜構(gòu)建。結(jié)合灰斑病抗病性表型數(shù)據(jù)進(jìn)行QTL定位，采用ICIM-ADD進(jìn)行QTL檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 遺傳圖譜的構(gòu)建

篩選了玉米各個(gè)染色體上1 000多對(duì)引物，有127對(duì)多態(tài)性明顯，帶型清晰，重復(fù)性好的引物。利用這些引物構(gòu)建了含127個(gè)SSR標(biāo)記的玉米遺傳連鎖圖譜，圖譜總長1 738 cM，圖距約為13.6 cM。經(jīng)x2檢驗(yàn)，多數(shù)SSR標(biāo)記符合孟德爾分離比例(1∶2∶1)，個(gè)別 SSR標(biāo)記表現(xiàn)偏分離。玉米染色體多態(tài)性標(biāo)記介于8～20個(gè)，平均13個(gè)，其中1號(hào)和4號(hào)染色體多態(tài)性引物最多，為20個(gè)，9號(hào)染色體最少為8個(gè)，引物在染色體的順序與IBM2 2008 Neighbors Frame6上的位置一致。

2.2 表型鑒定

在云南德宏和湖北恩施兩試驗(yàn)點(diǎn)，抗病親本R225均表現(xiàn)一致，評(píng)價(jià)病情指數(shù)為18.15、感病親本掖478均表現(xiàn)為高感，評(píng)價(jià)病情指數(shù)為89.03、F1表現(xiàn)中抗、F2:3群體病情指數(shù)介于11.11～100，連續(xù)分布。筆者試驗(yàn)測(cè)得各個(gè)點(diǎn)2次重復(fù)家系單株病級(jí)，計(jì)算病情指數(shù)(圖2)，結(jié)果表明，病情指數(shù)在群體不同家系間分離比較明顯，不同環(huán)境下表現(xiàn)比較一致。

2.3 抗尾孢灰斑病QTL 分析

利用復(fù)合區(qū)間作圖法進(jìn)行抗病QTL初步定位，綜合2點(diǎn)聯(lián)合QTL檢測(cè)結(jié)果，其中有多個(gè)QTL在2個(gè)環(huán)境都能檢測(cè)到，分別位于2、5、8、9染色體上，可分別解釋4.78%～37.77%的表型變異，尤其是第2染色體上的QTL“qRcz2”效應(yīng)明顯，多個(gè)環(huán)境都能檢測(cè)到，是一個(gè)可靠的主效QTL。

表1 玉米尾孢菌灰斑病 QTLs 的定位情況

3 討論

利用分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)數(shù)量性狀位點(diǎn)(quantitative trait locus, QTL)進(jìn)行分析和定位是抗性遺傳研究的經(jīng)典方法。近年來已在玉米上對(duì)若干控制主效抗病基因或數(shù)量性狀位點(diǎn)進(jìn)行了分析和定位[13～19]，如：絲黑穗病、大斑病、穗腐病、小斑病、粗縮病、莖腐病、粗縮病。近年來，針對(duì)玉米灰斑病開展了大量的抗病基因定位和發(fā)掘工作。定位了多個(gè)抗病相關(guān)QTL位點(diǎn)，獲得了一批抗病候選基因[20～23]。目前報(bào)道多數(shù)是關(guān)于玉蜀黍尾孢菌灰斑病抗性QTL研究，而關(guān)于玉米尾孢菌QTL分析研究較少。由于試驗(yàn)所用材料、鑒定環(huán)境和方法的不同，所檢測(cè)的QTL都不完全一致，尚未取得相對(duì)一致且較完善的結(jié)論。

筆者研究主要針對(duì)近幾年玉米尾孢菌C. zeina引起的灰斑病進(jìn)行QTL分析，對(duì)國內(nèi)外種質(zhì)資源經(jīng)過多年多點(diǎn)的抗灰斑病鑒定，篩選出優(yōu)良自交系R225(高抗材料)，通過與掖478(高感材料) 配制作圖群體F2(345個(gè)單株)、性狀評(píng)價(jià)群體F2:3，根據(jù)兩年3點(diǎn)抗灰斑病鑒定結(jié)果進(jìn)行QTL初定位，確定了抗性QTL相關(guān)信息[24]，研究結(jié)果以摘要形式在2015年中國植物保護(hù)學(xué)會(huì)論文初報(bào)，本文做詳細(xì)報(bào)道。筆者研究結(jié)果與已報(bào)道的抗玉米尾孢菌C. zeina灰斑病QTL位點(diǎn)有所不同[25]，尤其是第2染色體上的QTL(命名為“qRcz2”)效應(yīng)明顯，后期通過回交群體進(jìn)行驗(yàn)證，是一個(gè)主效QTL。研究結(jié)果豐富了玉米尾孢菌抗性遺傳研究，對(duì)玉米灰斑病的控制有重要意義。