響應(yīng)面優(yōu)化黑曲霉生物發(fā)酵花生粕脫除黃曲霉毒素研究

邱天宇，王海鳴，朱 瑜，楊 陽，紀(jì) 劍，孫秀蘭

（1.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無錫 214122；2.廣州廣電計(jì)量檢測股份有限公司，廣東廣州 510665；3.漢中市質(zhì)量技術(shù)檢驗(yàn)檢測中心，陜西漢中 723000；4.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052）

0 引言

黃曲霉毒素是曲霉屬真菌的次生代謝產(chǎn)物，對人類和動(dòng)物危害顯著[1-2]，對食品的污染是食品安全領(lǐng)域最棘手的問題之一[3-4]。黃曲霉毒素主要分為4 種，分別為黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2，這4 種毒素化學(xué)結(jié)構(gòu)相似（如圖1），致毒基團(tuán)大致相同[5]，其中以AFB1毒性和致癌性最強(qiáng)[6-7]。并且，AFB1具有較高的分解溫度，在常規(guī)食品加工溫度范圍內(nèi)（80～121 ℃） 時(shí)被認(rèn)為是熱穩(wěn)定的[8]。多種谷物都易感染曲霉，尤其花生[9-10]?；ㄉ勺鳛榛ㄉビ偷母碑a(chǎn)品，產(chǎn)量高且蛋白質(zhì)含量豐富，可利用其成為一種蛋白質(zhì)功能性食品[11-13]，但由于其極易受霉菌污染，從而限制了應(yīng)用[14-15]。黃曲霉毒素殘留于花生粕中導(dǎo)致其污染率較高，應(yīng)盡可能降低其中黃曲霉毒素含量。然而，目前較多農(nóng)產(chǎn)品中存在著多種黃曲霉毒素，因此試驗(yàn)通過優(yōu)化生物發(fā)酵工藝條件盡可能降低花生粕中4 種黃曲霉素含量。

AFB1(a)，AFB2(b)，AFG1(c)，AFG2(d)化學(xué)結(jié)構(gòu)圖見圖1。

生物發(fā)酵是一種易于實(shí)施和較為經(jīng)濟(jì)的生物技術(shù)，不僅在農(nóng)產(chǎn)品應(yīng)用中占據(jù)著重要地位[16-17]，而且在脫除粕類有毒物質(zhì)方面也有著廣泛的應(yīng)用[18-20]。降解菌株FS10 已證明其生物安全性[21]，不僅表現(xiàn)出優(yōu)異的AFB1降解能力，而且有望作為工業(yè)發(fā)酵菌株在食品工業(yè)中發(fā)揮作用。

利用黑曲霉生物發(fā)酵花生粕的方法有效脫除花生粕中AFB1，AFB2，AFG1，AFG24 種黃曲霉毒素，研究接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、料液比4 個(gè)因素對花生粕中黃曲霉毒素的脫除，采用響應(yīng)面法對其中AFB1和總AFT（AFB1+AFB2+AFG1+AFG2） 脫除率進(jìn)行優(yōu)化，通過對發(fā)酵條件的優(yōu)化發(fā)現(xiàn)該黑曲霉對4 種黃曲霉毒素的脫除有著顯著效果。

1 材料與方法

1.1 試劑與培養(yǎng)基

AFB1，AFB2，AFG1，AFG2標(biāo)準(zhǔn)品，純度為99.9%，美國Sigma 公司提供；甲醇、乙腈（色譜純），美國TEDIA 公司提供；硫酸鎂等化學(xué)純試劑，上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA 培養(yǎng)基）：馬鈴薯300 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，氯霉素0.1 g，蒸餾水1 L，于121 ℃下高壓滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

WATERS MALDI SYNAPT Q-TOF MS，美國沃特世公司產(chǎn)品；VB-40 型立式高溫高壓滅菌鍋，德國SYSTEC 產(chǎn)品；BSC-1300 型超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司產(chǎn)品；SHP-150 型生化培養(yǎng)箱，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司產(chǎn)品；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；THZ-D 型臺式恒溫振蕩器，上海百典儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品；EX-OHOUS 型電子天平、旋渦振蕩儀，美國奧豪斯公司產(chǎn)品；Scientz-10N 型臺式冷凍干燥機(jī)、Scientz-10LS 型真空離心濃縮儀、SB-5200DT 型超聲波清洗機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司產(chǎn)品；Eppendorf 型離心機(jī)，德國艾本德公司產(chǎn)品；Milli-Q型超純水儀，美國Millipore 公司產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 黑曲霉及FS10 孢子懸浮液的制備

從醬醅中篩選出一株具有降解黃曲霉毒素能力的FS10 黑曲霉菌株，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，編號為CCTCC NO:M2013703。從-80 ℃取出黑曲霉FS10 復(fù)蘇，接種于種子培養(yǎng)基，于28 ℃下培養(yǎng)7 d，然后用無菌生理鹽水（含0.05%吐溫-80） 將孢子洗下，調(diào)整孢子含量為1×106CFU/mL，備用。

1.3.2 生物發(fā)酵

將花生粕粉碎，過40 目篩后混合均勻收集樣品花生粕，備用。利用GB/T 14699.1—2005 方法采樣并稱取花生粕分裝于50 mL 三角錐形瓶中，4 層紗布報(bào)紙封口，進(jìn)行121 ℃，20 min 滅菌處理。

將滅菌處理過的花生粕轉(zhuǎn)移至發(fā)酵容器中，加入無菌水至一定料液比（花生粕質(zhì)量與無菌水體積的比值，g/mL），加入FS10 孢子懸浮液至一定接種量（菌液體積與花生粕質(zhì)量的百分比），攪拌均勻后于一定溫度下恒溫發(fā)酵，分別在發(fā)酵后一定時(shí)間取樣。

1.3.3 AFB1，AFB2，AFG1，AFG24 種黃曲霉毒素的測定

收集發(fā)酵完成的樣品，干燥后分別將每份花生粕導(dǎo)入離心管內(nèi)，加入乙腈-水溶液（70+30） 進(jìn)行提取并沖洗發(fā)酵容器一并導(dǎo)入離心管內(nèi)，避免因粕中毒素分布不均對試驗(yàn)結(jié)果的影響，混勻后超聲處理10 min，振蕩30 min，以轉(zhuǎn)速8 000 r/min 離心10 min，取過濾后上清液過固相凈化柱，收集液體后進(jìn)行冷凍濃縮，用甲醇-水溶液（50+50） 復(fù)溶過濾膜后，上LC-MS/MS 檢測。

取無菌花生粕樣品，該組為無菌對照組，按上述方法提取毒素、檢測。

配制黃曲霉毒素AFB1，AFB2，AFG1，AFG2混標(biāo)：質(zhì)量濃度梯度為0.5，1.0，2.0，5.0，10.0，20.0，50.0，100.0 ng/mL 的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3.4 色譜條件

色譜條件：色譜柱為BEH C18柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），流動(dòng)相A 為乙腈，B 為甲酸銨溶液，柱溫45 ℃，流速0.3 mL/min，進(jìn)樣量5 μL。

梯度洗脫見表1。

表1 梯度洗脫

質(zhì)譜條件：離子方式ESI+，毛細(xì)管電壓3.50 kV，錐孔電壓30 V，離子源溫度110 ℃，脫溶劑氣溫度400 ℃，流速700 lit/hr；錐形氣流50 lit/hr，碰撞能量6 eV，質(zhì)量范圍20～800 m/z，探測器電壓1 800 eV，碰撞氣體流量0.15 mL/min；多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）。

1.3.5 單因素試驗(yàn)

以AFB1，AFB2，AFG1，AFG2脫 除 率 為 指 標(biāo)，控制孢子懸浮液含量為1×106CFU/mL，分別對接種量1%，5%，10%，15%，20%；發(fā)酵溫度20，25，30，35，40 ℃；發(fā)酵時(shí)間24，36，48，60，72 h；料液比1∶0，1∶0.5，1∶1.0，1∶1.5，1∶2.0 進(jìn)行單因素試驗(yàn)，確定各因素對黃曲霉毒素脫除情況的影響。

1.3.6 響應(yīng)面法因素水平設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，利用Box-behnken 設(shè)計(jì)方法，選擇接種量（A）、發(fā)酵溫度（B）、發(fā)酵時(shí)間（C）、料液比（D） 作為4 個(gè)因素，以AFB1和總AFT脫除率作為響應(yīng)值進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)均重復(fù)3 次，采用SPSS19.0、Origin 2018、Design Expert 10 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析及圖像繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 接種量對4 種黃曲霉毒素毒素脫除率的影響

在孢子懸浮液含量為1×106CFU/mL，料液比1∶1，培養(yǎng)溫度30 ℃，發(fā)酵時(shí)間48 h 條件下，研究接種量分別為1%，5%，10%，15%，20%對4 種黃曲霉毒素脫除效果。

接種量對黑曲霉脫除4 種黃曲霉毒素的影響見圖2。

不同接種量對于黑曲霉脫除花生粕中的黃曲霉毒素有著重要影響，接種量過小或過大均不利于發(fā)酵的進(jìn)行。圖2 表明了不同接種量對脫除4 種黃曲霉毒素的影響結(jié)果，在接種量為15%，20%時(shí)，AFB1，AFB2，AFG2脫除率都比較高，在接種量為5%～15%時(shí)AFG1脫除率較為穩(wěn)定，但接種量為20%時(shí)，AFG1、AFG2脫除率有明顯下降現(xiàn)象，推測AFG1，AFG2是中間降解產(chǎn)物的可能，仍需進(jìn)一步研究。

2.1.2 發(fā)酵溫度對4 種黃曲霉毒素毒素脫除率影響

在孢子懸浮液含量為1×106CFU/mL，料液比1∶1，接種量10%，發(fā)酵時(shí)間48 h 條件下，研究發(fā)酵溫度分別為20，25，30，35，40 ℃對4 種黃曲霉毒素脫除率影響。

發(fā)酵溫度對黑曲霉脫除4 種黃曲霉毒素的影響見圖3。

不同溫度會(huì)對微生物生命活動(dòng)產(chǎn)生極大的影響，且對同一微生物而言，微生物最適生長溫度與發(fā)酵速度最高的溫度不一定相同，故試驗(yàn)研究了不同溫度對黑曲霉脫除花生粕中黃曲霉毒素的影響。由圖3可以看出在溫度分別達(dá)到30，25 ℃時(shí)AFB1，AFG1脫除率已達(dá)最高，分別為82.69%，53.43%，而AFB2和AFG2脫除率在40 ℃時(shí)有突增現(xiàn)象，可能由于在低溫脫除過程中AFB1和AFG1的末端呋喃環(huán)雙鍵結(jié)構(gòu)已斷裂，導(dǎo)致所轉(zhuǎn)化的中間產(chǎn)物AFB2和AFG2在此時(shí)脫除率不明顯，而升高溫度促進(jìn)毒素其他結(jié)構(gòu)的破壞，從而出現(xiàn)升溫脫除率突增。有研究指出，在酸性溶液中AFB1和AFG1分別轉(zhuǎn)化成AFB2和AFG2[22]，所以在后續(xù)試驗(yàn)中對總AFT 脫除率的監(jiān)測是有必要的。

2.1.3 發(fā)酵時(shí)間對4 種黃曲霉毒素毒素脫除率的影響

在孢子懸浮液含量為1×106CFU/mL，料液比1∶1，接種量10%，培養(yǎng)溫度30 ℃條件下，研究發(fā)酵時(shí)間分別為24，36，48，60，72 h 對4 種黃曲霉毒素脫除率的影響。

發(fā)酵時(shí)間對黑曲霉脫除4 種黃曲霉毒素的影響見圖4。

發(fā)酵時(shí)間是發(fā)酵過程中的重要參數(shù)之一，由圖4可以看出AFB1，AFB2，AFG1，AFG24 種毒素脫除率隨時(shí)間的延長而升高，AFG1脫除率到36 h 后基本保持穩(wěn)定，AFB1，AFB2，AFG23 種毒素脫除率到60 h后基本保持穩(wěn)定，可能由于發(fā)酵后期菌體受到營養(yǎng)物質(zhì)及發(fā)酵環(huán)境的限制，影響了其代謝生長。

2.1.4 料液比對4 種黃曲霉毒素毒素脫除率的影響

在孢子懸浮液含量為1×106CFU/mL，接種量10%，培養(yǎng)溫度30 ℃，發(fā)酵時(shí)間48 h 條件下，研究料液比分別為1∶0，1∶0.5，1∶1.0，1∶1.5，1∶2.0對4 種黃曲霉毒素脫除率影響。

料液比對黑曲霉脫除4 種黃曲霉毒素的影響見圖5。

料液比在微生物發(fā)酵過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用，從圖5 可以看出在料液比為1∶0 時(shí)，嚴(yán)重限制了菌體正常代謝活動(dòng)，從而影響4 種毒素脫除效果。料液比為1∶1.5 時(shí)，AFB1，AFB2，AFG1，AFG24 種毒素脫除率分別為93.05%，53.23%，62.11%，65.06%，綜合4 種毒素脫除率，較為適宜的料液比為1∶1.5。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平

為了得到黑曲霉脫除花生粕中黃曲霉毒素的最佳條件，根據(jù)上述單因素試驗(yàn)得到的較優(yōu)條件，采用響應(yīng)面法對接種量、料液比、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度4 個(gè)因素兩兩交互影響進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)

通過單因素試驗(yàn)確定黑曲霉生物發(fā)酵脫除黃曲霉毒素的4 個(gè)單因素適宜范圍，由于AFB1毒性最大，現(xiàn)今國內(nèi)外對黃曲霉毒素總量關(guān)注度極高，所以試驗(yàn)選取AFB1和總AFT 脫除率為考查指標(biāo)進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化。

響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表3。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.2.2 響應(yīng)面回歸模型的建立與分析

通過Design Expert 10 對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸擬合及方差分析，得到以AFB1脫除率（Y1） 和總AFT 脫除率（Y2） 為響應(yīng)值，接種量（A）、發(fā)酵溫度（B）、發(fā)酵時(shí)間（C）、料液比（D） 的多元二次回歸方程：

為檢驗(yàn)回歸方程有效性，對回歸方程進(jìn)行方差和顯著性分析。

AFB1脫除率回歸模型方差分析見表4，總AFT脫除率回歸模型方差分析見表5。

表4 AFB1 脫除率回歸模型方差分析

結(jié)果表明，2 個(gè)回歸模型均極顯著（p＜0.001），2 個(gè)失擬項(xiàng)均不顯著（p＞0.05），R2分別為0.977 8，0.978 6，R2adj分別為0.958 6，0.957 2，表明該模型能夠較好地?cái)M合數(shù)據(jù)，該回歸方程可用于預(yù)測分析且能較好地反映各因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系。由表3、表4 可知，AFB1脫除率的影響因素主次順序?yàn)榘l(fā)酵時(shí)間＞接種量＞發(fā)酵溫度＞料液比，總AFT 脫除率的影響因素主次順序?yàn)榘l(fā)酵時(shí)間＞接種量＞料液比＞發(fā)酵溫度。

2.2.3 各因素兩兩交互作用

各因素交互作用對AFB1脫除率影響的響應(yīng)面圖見圖6，各因素交互作用對總AFT 脫除率影響的響應(yīng)面圖見圖7。

圖6（a）、6（b）、6（c） 反映了接種量與其他3 個(gè)因素的交互作用，當(dāng)接種量介于5%～11%時(shí)，AFB1脫除率可達(dá)到最高點(diǎn)，且接種量與料液比的交互作用顯著。圖6（a）、6（d）、6（e） 反映了溫度與其他3 個(gè)因素的交互作用，當(dāng)溫度介于28～37 ℃時(shí)，AFB1脫除率可達(dá)最高點(diǎn)，且溫度與時(shí)間、料液比的交互作用顯著。圖6（b）、6（d）、6（f） 反映了時(shí)間與其他3 個(gè)因素的交互作用，當(dāng)時(shí)間介于54～72 h 時(shí)，AFB1脫除率可達(dá)到最高點(diǎn)，且時(shí)間與溫度、料液比的交互作用顯著。圖6（c）、6（d）、6（f） 反映了料液比與其他3 個(gè)因素的交互作用，當(dāng)料液比介于1.2～1.8 時(shí)，AFB1脫除率可達(dá)到最高點(diǎn)，且料液比與其他3 個(gè)因素交互作用均顯著。

表5 總AFT 脫除率回歸模型方差分析

圖7（a） -7（f） 反映了四因素兩兩交互作用，當(dāng)接種量5%～11%，溫度28～34 ℃，時(shí)間54～63 h，料液比1.4～1.6 時(shí)，總AFT 脫除率可達(dá)最高點(diǎn)。等高線中心點(diǎn)均在上述條件范圍內(nèi)，總AFT 脫除率可達(dá)70%以上。

2.2.4 響應(yīng)面最優(yōu)條件的確定

運(yùn)用Design Expert 10 軟件分析得最優(yōu)脫除毒素的條件為接種量9.28%，發(fā)酵溫度31.80 ℃，發(fā)酵時(shí)間63.30 h，料液比1∶1.56。此條件下預(yù)測的AFB1脫除率為95.99%，總AFT 脫除率為71.48%。在此條件下進(jìn)行黑曲霉生物發(fā)酵花生粕，重復(fù)試驗(yàn)3 次，得到AFB1脫除率（95.01%±0.50%），含量降至0.95 μg/kg，總AFT 脫除率為（72.90%±0.35%），含量降至26.80 μg/kg。與理論值相對誤差分別為1.03%，1.95%，說明該優(yōu)化條件可行，具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

3 結(jié)論

利用黑曲霉FS10 生物發(fā)酵花生粕，研究了接種量、料液比、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度4 個(gè)因素對花生粕中AFB1，AFB2，AFG1，AFG2脫除效果的影響，運(yùn)用響應(yīng)面法優(yōu)化上述4 個(gè)條件對AFB1和總AFT 毒素脫除效果，研究結(jié)果表明，在接種量9.28%，發(fā)酵溫度31.80 ℃，發(fā)酵時(shí)間63.30 h，料液比1∶1.56 的條件下，花生粕中的AFB1脫除率為95.01%，總AFT 脫除率為72.90%，通過對發(fā)酵條件的優(yōu)化發(fā)現(xiàn)該黑曲霉對4 種黃曲霉毒素的脫除有著顯著的效果，發(fā)酵后花生粕中AFB1含量不僅符合國內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)，也符合歐盟制定標(biāo)準(zhǔn)（＜2 μg/kg）[23]，使花生粕有成為一種低脂高蛋白農(nóng)產(chǎn)品資源的潛力。