氨氮降解菌的篩選及降解氨氮條件研究*

蔡盡忠，張慧美，邱彩玲，范淑捷，鄧 盈

(1 廈門華廈學(xué)院 環(huán)境與公共健康學(xué)院，福建 廈門 361024;

近年來(lái)，隨著城市化和工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的發(fā)展，大量富含氮、磷等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的城市污水、工農(nóng)業(yè)廢水流入自然水域，進(jìn)而導(dǎo)致水體的富營(yíng)養(yǎng)化[1]。同時(shí)因富營(yíng)養(yǎng)化水中含有硝酸鹽和亞硝酸鹽，人畜長(zhǎng)期飲用這些物質(zhì)含量超過(guò)一定標(biāo)準(zhǔn)的水，也會(huì)中毒致病[2-3]。隨著水環(huán)境污染和水質(zhì)富營(yíng)養(yǎng)問(wèn)題的日益尖銳以及公共環(huán)境意識(shí)的日益增強(qiáng)，污水脫氮問(wèn)題在全球范圍內(nèi)引起了廣泛的重視。因此采取一定措施降低水中的氨氮含量對(duì)于城鎮(zhèn)居民生活環(huán)境的治理有著重要作用。處理氨氮的方法一般有物理、化學(xué)、生物等處理方法。魯秀國(guó)等[4]使用解氨劑-超重力法處理氨氮廢水，探索了處理脫氮過(guò)程的最佳工藝條件，論證了解氨劑-超重力法處理氨氮廢水技術(shù)上的可行性。在化學(xué)沉淀法處理氨氮廢水方面，華南理工大學(xué)、蘭州化學(xué)工業(yè)公司環(huán)保所等進(jìn)行了較系統(tǒng)研究，處理后的廢水氨氮含量小于1×10-6，沉淀物可以作為復(fù)合肥回收利用。生物降解法中常用的添加劑是微生態(tài)制劑，由于它安全高效、綠色環(huán)保，不僅僅能改善水體環(huán)境，還可以減少動(dòng)物因飲用此類富營(yíng)養(yǎng)化水體而造成疾病的發(fā)生。由于生物降解方法成本低、運(yùn)作簡(jiǎn)單、不會(huì)造成二次污染、安全環(huán)保等特點(diǎn)，備受大眾的青睞與推崇[5]。本研究從廈門華廈學(xué)院天鵝湖底泥中，分離篩選出能降解氨氮的菌株，研究菌株降解氨氮的最適條件，為水體氨氮污染的生物降解提供應(yīng)用基礎(chǔ)。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基(g): 葡萄糖 5.0，NaCl 2.0，(NH4)2SO42.0，K2HPO41.0，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.4，MgSO4·7H2O 0.5，水1000 mL。

分離培養(yǎng)基(g): 葡萄糖 5.0，NaCl 2.0，(NH4)2SO42.0，K2HPO41.0，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.4，MgSO4·7H2O 0.5，瓊脂粉15.0，水1000 mL。

1.1.2 儀 器

7230可見(jiàn)分光光度計(jì)，廈門星鯊;CT15RT多用途冷凍離心機(jī)，廈門萊勝;PHX-280H生化培養(yǎng)箱，寧波萊福;SHZ-82A氣浴恒溫震蕩器，常州華普達(dá)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 氨氮降解菌的富集

取1 g廈門華廈學(xué)院天鵝養(yǎng)殖處天鵝湖中的水底污泥加入9 mL無(wú)菌水制成懸液，接種至100 mL富集培養(yǎng)基中，在轉(zhuǎn)速為120 r·min-1，溫度為30 ℃的搖床中培養(yǎng)7 d，這期間每天向培養(yǎng)基中加入1 mL5%的(NH4)2SO4溶液，用于富集可以利用氨氮的微生物。

1.2.2 降解氨氮菌的分離純化及降解氨氮效率檢測(cè)

將富集培養(yǎng)后的菌液稀釋至合適的濃度后在分離培養(yǎng)基中涂布，放置于30℃的生化培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)至長(zhǎng)出菌落后，用連續(xù)劃線法接種到分離培養(yǎng)基中，反復(fù)分離純化至同一平皿只出現(xiàn)同種形態(tài)的菌落。將篩選分離后的各菌株分別接種到含有氨氮含量為120 mg·L-1的液體篩選培養(yǎng)基(模擬高濃度氨氮水樣)，在溫度為30 ℃、轉(zhuǎn)速為120 r·min-1搖瓶培養(yǎng)24 h后取培養(yǎng)液放置于離心機(jī)中以3000 r·min-1離心10 min，取其上清液，采用納氏試劑分光光度法[6]測(cè)氨氮含量，計(jì)算出各個(gè)降解菌的氨氮降解率。選出一株降解能力最強(qiáng)的氨氮降解菌株作進(jìn)一步研究。

1.2.3 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)氨氮降解能力的影響

將篩選出的最優(yōu)菌種在轉(zhuǎn)速120 r·min-1，溫度30 ℃的搖床中培養(yǎng)24 h。每隔2～4 h對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行一次氨氮含量的檢測(cè)，研究降解氨氮的最佳培養(yǎng)時(shí)間。

單一語(yǔ)種詞典可以給學(xué)習(xí)者提供更為準(zhǔn)確的釋義，其中包括翻譯無(wú)法完美而徹底地傳達(dá)的含義，但是由于沒(méi)有學(xué)習(xí)者的母語(yǔ)，它不太適合初學(xué)者。雙語(yǔ)詞典可以給初學(xué)者提供一目了然的解釋，但是詞語(yǔ)的釋義囿于目的語(yǔ)的緣故，很多詞的文化內(nèi)涵不能完美闡釋。

1.2.4 培養(yǎng)條件對(duì)氨氮降解能力的影響

將最優(yōu)菌株接種到20 mL篩選培養(yǎng)基中，分別在不同溫度(26.0、28.0、30.0、33.0、35.0、37.0 ℃)，不同初始 pH值(5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0)，不同搖床轉(zhuǎn)速(90、120、150、180、200 r·min-1) 的條件下，培養(yǎng)1.2.3確定的時(shí)間后測(cè)定氨氮降解率，確定最佳氨氮降解條件。在最佳氨氮降解條件下測(cè)定其對(duì)模擬高濃度氨氮水樣和廈門華廈學(xué)院天鵝湖實(shí)際水樣的氨氮降解率。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2010和SPSS18.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析，均值差異性分析采用LSD法，顯著性水平為P< 0.05。

2 結(jié)果與討論

2.1 氨氮降解菌的分離與篩選結(jié)果

天鵝湖水底污泥經(jīng)富集、分離、純化，獲得7株氨氮降解菌，編號(hào)分別為TEH-03、TEH-04、TEH-05、TEH-06、TEH-08、TEH-12、TEH-13。這7株菌對(duì)氨氮的降解率如圖1所示，TEH-03菌株對(duì)氨氮的降解率顯著高于其它菌株(P<0.05)，因此對(duì)該菌株作進(jìn)一步研究。

圖1 7株氨氮降解菌的氨氮降解率

2.2 最優(yōu)菌TEH-03的氨氮降解能力的初步測(cè)定

通過(guò)圖2的TEH-03菌株對(duì)氨氮的降解率曲線，可以發(fā)現(xiàn)該菌從14h以前對(duì)氨氮的降解率快速升高，14 h以后對(duì)氨氮的降解率差異不顯著(P>0.05)，確定降解氨氮的最佳培養(yǎng)時(shí)間為14 h。

圖2 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)最優(yōu)菌TEH-03氨氮降解能力的影響

2.3 溫度對(duì)氨氮降解能力的影響

從圖3可知氨氮降解能力隨溫度變化出現(xiàn)先緩慢升高后快速降低的趨勢(shì)，這可能是菌株TEH-03會(huì)產(chǎn)生大量的活性酶，溫度升高有利于提高微生物酶活性，但過(guò)高的溫度會(huì)使酶活性降低甚至失活。在溫度為30 ℃時(shí)對(duì)氨氮的降解率最高，但是26、28和30 ℃條件下對(duì)氨氮的降解率差異不顯著(P>0.05)，考慮到節(jié)約能源，將最適培養(yǎng)溫度確定為26 ℃。

圖3 溫度對(duì)氨氮降解能力的影響

2.4 初始pH 值對(duì)氨氮降解能力的影響

從圖4可知菌株對(duì)氨氮的降解率隨pH值變化出現(xiàn)快速升高后又快速降低的趨勢(shì)，當(dāng)外界環(huán)境中的氫離子濃度高于或低于微生物酶的適應(yīng)范圍，不僅會(huì)抑制酶的活性還會(huì)降低酶促反應(yīng)效率，并且微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收也會(huì)變?nèi)?，代謝功能也會(huì)受到影響。當(dāng)pH值為7.0時(shí)菌株TEH-03對(duì)氨氮的降解率顯著高于其它pH條件(P<0.05)，因此初始pH值應(yīng)控制在7.0最佳。

圖4 初始pH值對(duì)氨氮降解能力的影響

2.5 轉(zhuǎn)速對(duì)氨氮降解能力的影響

由圖5可以看出隨著轉(zhuǎn)速的增加，菌株對(duì)氨氮的降解率出現(xiàn)快速升高后又快速降低的趨勢(shì)，過(guò)高或者過(guò)低的氧氣量都不利于菌株TEH-03降解氨氮。當(dāng)轉(zhuǎn)速達(dá)到120 r·min-1時(shí)對(duì)氨氮的降解效率顯著高于其它轉(zhuǎn)速 (P<0.05)，因此最佳轉(zhuǎn)速為120 r·min-1。

圖5 轉(zhuǎn)速對(duì)氨氮降解能力的影響

2.6 最適培養(yǎng)條件下對(duì)模擬水樣和實(shí)際水樣的氨氮降解率

將TEH-03菌株在最適培養(yǎng)條件即溫度為26 ℃、pH為7.0、轉(zhuǎn)速為120 r·min-1下培養(yǎng)14小時(shí)后測(cè)定其對(duì)模擬高濃度氨氮水樣的降解率為86.83%，但是對(duì)廈門華廈學(xué)院天鵝養(yǎng)殖處天鵝湖實(shí)際水樣的氨氮降解率僅為77.78%，其原因可能是由于模擬水樣中的氨氮含量較高，菌株可以高效的發(fā)揮其降解效果，而天鵝湖水樣中可能含有其它有毒物質(zhì)對(duì)菌株產(chǎn)生抑制作用，從而降低菌株在實(shí)際水樣中的適應(yīng)性，使得對(duì)氨氮降解效果不如模擬水樣。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)廈門華廈學(xué)院天鵝湖中的污泥微生物分離純化，以硫酸銨為唯一氮源篩選得到1株對(duì)氨氮具有較好降解作用的菌株TEH-03。研究結(jié)果表明TEH-03菌株的最適降解條件為溫度26 ℃，初始pH值為7.0，轉(zhuǎn)速為120 r·min-1，該菌在14 h 就可達(dá)到最佳的對(duì)氨氮降解率達(dá)到86.83%。以天鵝湖的污水作為實(shí)際水樣，菌株TEH-03對(duì)實(shí)際水樣中氨氮降解率為77.78%，該菌株是對(duì)自然水體的治理有一定效果的，但如果用于改善城市、工業(yè)污水還得進(jìn)一步優(yōu)化條件提高該菌株對(duì)氨氮降解的效率。