楊鑫 田字彬 張翠萍 張茜 趙文君 楊林

[摘要] 目的 研究高脂飲食性肥胖對豬螺桿菌感染后小鼠胃相關淋巴趨化因子表達與黏膜相關淋巴組織（MALT）形成影響及其機制。方法 將40只雌性C57BL/6小鼠隨機分為正常對照組（NC組）、豬螺桿菌感染組（HS組）、高脂飲食組（HFD組）、豬螺桿菌感染+高脂飲食組（HS+HFD組），每組10只。用普通飲食喂養(yǎng)NC組與HS組小鼠，而其余兩組小鼠普通飲食喂養(yǎng)3周后給予高脂飲食。按上述飲食喂養(yǎng)24周后，取小鼠胃組織，行蘇木精-伊紅染色分別檢測各組小鼠胃黏膜淋巴濾泡的數量與大小;行實時定量PCR，分別檢測各組小鼠胃黏膜相關淋巴趨化因子CXCL13、CCL19、CCL21和核轉錄因子-κB（NF-κB）信號通路的上游因子腫瘤壞死因子α（TNF-α）、淋巴毒素α（LTα）、淋巴毒素β（LTβ）的mRNA表達水平。結果 豬螺桿菌感染可誘導小鼠胃黏膜濾泡的形成，且HS+HFD組小鼠胃黏膜淋巴濾泡的數量與大小較HS組明顯增加（t=3.05、4.01，P<0.05）。HS+HFD組小鼠胃黏膜中TNF-α、LTα與LTβ的mRNA表達水平與HS組相比較明顯增加（F=117.261～306.855，P<0.05）。HS+HFD組小鼠胃黏膜相關淋巴趨化因子CXCL13、CCL19、CCL21的mRNA表達水平明顯高于HS組，差異具有統(tǒng)計學意義（F=68.461～252.398，P<0.05）。結論 高脂飲食誘導的肥胖可能通過激活NF-κB信號通路以及誘導上調胃內淋巴趨化因子表達，進一步促進豬螺桿菌感染后胃MALT的形成。

[關鍵詞] 小鼠，肥胖;膳食，高脂;海爾曼螺桿菌屬;黏膜相關淋巴組織;趨化因子類;NF-κB

[中圖分類號] R573.6 ?[文獻標志碼] A ?[文章編號] 2096-5532（2020）06-0631-05

doi：10.11712/jms.2096-5532.2020.56.148 [開放科學（資源服務）標識碼（OSID）]

[網絡出版] https：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20200714.1202.001.html;

2020-07-16 09：01

[ABSTRACT] Objective To investigate the effect of high-fat diet-induced obesity on the expression of gastric lymphocyte chemokines and the formation of mucosa-associated lymphoid tissue （MALT） after Helicobacter suis （H. suis） infection and its possible mechanism. ?Methods A total of 40 female C57BL/6 mice were randomly divided into normal control group （NC group）， H. suis infection group （HS group）， high-fat diet group （HFD group）， and H. suis infection+high-fat diet group （HS+HFD group）， with 10 mice in each group. The mice in the NC group and the HS group were given a normal diet， and those in the other two groups were given high-fat diet after 3 weeks of normal diet. After the mice were given the above diet for 24 weeks， gastric tissue was collected and HE staining was used to measure the number and size of gastric mucosal lymphoid follicles; quantitative real-time PCR was used to measure the mRNA expression levels of gastric mucosa-associated lymphocyte chemokines （CXCL13， CCL19， and CCL21） and upstream factors of the nuclear factor-kappa B （NF-κB） signaling pathway （tumor necrosis factor-α （TNF-α）， lymphotoxin α （LTα）， and lymphotoxin β （LTβ））. Results H. suis infection induced the formation of gastric mucosal follicles in mice， and the HS+HFD group had significantly greater number and size of gastric mucosal lymphoid follicles than the HS group （t=3.05，4.01;P<0.05）. Compared with the HS group， the HS+HFD group had significant increases in the mRNA expression levels of TNF-α， LTα， and LTβ in the gastric mucosa （F=117.261-306.855，P<0.05）， as well as significantly higher mRNA expression levels of the gastric mucosa-associated lymphocyte chemokines CXCL13， CCL19， and CCL21 （F=68.461-252.398，P<0.05）. Conclusion High-fat diet-induced obesity may further promote the formation of gastric MALT after H. suis infection by activating the NF-κB signaling pathway and inducing upregulation of the expression of gastric lymphocyte chemokines.

[KEY WORDS] mice，obese; diet，high-fat; Helicobacter heilmannii; mucosa associated lymphoid tissue; chemotactic factors; NF-κB

豬螺桿菌（Helicobacter suis，H. suis）是除幽門螺桿菌（Hp）外最常見的定植于人類胃黏膜的螺旋桿菌，其感染與萎縮性胃炎、胃潰瘍、胃黏膜相關淋巴樣組織（MALT）淋巴瘤甚至胃癌等發(fā)生存在相關性[1-5]，值得臨床重視。近年來，關于豬螺桿菌相關性胃MALT淋巴瘤的報道逐漸增多[6]。有研究結果表明，豬螺桿菌可定植于C57BL/6小鼠胃內，其機制主要是通過激活B細胞與輔助性T細胞（CD4+ T細胞），引起獲得性免疫反應，進而誘導胃MALT形成，且CCL19、CXCL13等是豬螺桿菌感染后胃MALT形成的關鍵趨化因子[7-11]。肥胖是由不同炎癥因子誘導產生的一種全身慢性低度炎癥狀態(tài)，能增加許多惡性腫瘤（包括胃MALT淋巴瘤）發(fā)生的風險[12]，另外還有MALT淋巴瘤病人減體質量術后淋巴瘤完全消退的報道[13]，說明肥胖可影響MALT淋巴瘤的發(fā)生發(fā)展。另有研究結果顯示，高脂飲食誘導的肥胖可增加小鼠淋巴結中CCL19、CCL21和脂肪組織中CXCL13的表達水平[14-15]。因此，我們推測肥胖可能會通過某種信號通路影響豬螺桿菌感染后MALT淋巴瘤的形成。本研究旨在初步探討高脂飲食誘導的肥胖對豬螺桿菌感染后小鼠胃MALT形成的影響及其可能的機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級8周齡雌性C57BL/6野生型小鼠（體質量18～20 g）40只購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司，飼養(yǎng)于青島大學附屬醫(yī)院動物實驗室（SPF級）。小鼠飼料、飲用水經高溫高壓滅菌。動物實驗得到了青島大學實驗動物管理和使用委員會的批準。

1.2 動物分組及處理

將40只小鼠隨機分為正常對照組（NC組，A組）、豬螺桿菌感染組（HS組，B組）、高脂飲食組（HFD組，C組）以及豬螺桿菌感染+高脂飲食組（HS+HFD組，D組），每組10只。取本實驗室已感染豬螺桿菌的供體小鼠（已證實其胃內只有豬螺桿菌，沒有其他螺桿菌的定植[5]）的胃黏膜勻漿，按每只0.2 mL給B組和D組小鼠灌胃，致其感染;A組和C組則給予同等量的非感染野生型小鼠胃黏膜勻漿灌胃。A組和B組小鼠給予普通飲食，C組和D組小鼠普通飲食喂養(yǎng)3周后給予高脂飲食（高脂飼料購自Research Diets，Inc;其中脂肪占總熱量的45%）。各組小鼠每周測定體質量1次。

1.3 標本采集

喂養(yǎng)24周后，將各組小鼠麻醉后行頸椎脫臼處死，取全胃，沿胃大彎剪開，用無菌PBS溶液沖洗干凈。部分胃組織用于石蠟包埋，部分提取RNA。

1.4 組織學檢測

取1/2的小鼠胃組織，經石蠟包埋后10 μm連續(xù)切片，行蘇木精-伊紅（HE）染色，檢測并比較不同組小鼠胃黏膜是否有淋巴濾泡生成及生成淋巴濾泡的數量和大小。

1.5 淋巴趨化因子和核轉錄因子-κB（NF-κB）信號通路上游因子mRNA表達的檢測

用實時定量PCR法。以Trizol試劑（TaKaRa）勻漿，從胃組織中提取總RNA，測定其純度和濃度后取1 μg的RNA進行逆轉錄反應得到cDNA，使用SYBR Green試劑盒（TaKaRa）進行實時熒光定量PCR（real-time PCR）。利用比較CT（△△CT）的方法確定各樣本中H. suis 16S rRNA、CCL19、CCL21、CXCL13、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、淋巴毒素α（LTα）、淋巴毒素β（LTβ）等mRNA的相對表達水平。各基因引物序列見表1。

1.6 統(tǒng)計學分析

應用SPSS 24.0軟件進行統(tǒng)計學處理。經檢驗各組計量數據均服從正態(tài)分布，組間方差齊，故數據以±s表示，采用二因素析因設計方差分析檢驗高脂飲食與豬螺桿菌的主效應和交互作用。

2 結 ?果

2.1 各組小鼠體質量的變化比較

高脂飲食主效應具有統(tǒng)計學意義（F=353.365， P<0.01），豬螺桿菌感染主效應無統(tǒng)計學意義（F=0.158，P>0.05），高脂飲食與豬螺桿菌感染不存在交互作用（F=0.037，P>0.05）。說明高脂飲食是影響小鼠體質量的主要因素，而豬螺桿菌感染并不會顯著影響小鼠的體質量，且兩者之間無交互作用。在造模前，各組小鼠體質量差異無統(tǒng)計學意義（F=1.425，P>0.05）;喂養(yǎng)24周后，高脂飲食小鼠（C、D組）體質量與非高脂飲食小鼠（A、B組）相比，差異有統(tǒng)計學意義（F=117.902，P<0.01）。見表2。

2.2 肥胖對豬螺桿菌感染后胃淋巴濾泡形成和細菌負荷的影響

喂養(yǎng)24周后，豬螺桿菌感染小鼠（B、D組）胃黏膜中均觀察到淋巴濾泡的形成，而非感染小鼠（A、C組）未見胃淋巴濾泡形成（圖1）。B組和D組小鼠胃組織中均檢測到H.suis 16S rRNA的表達，兩組之間比較差異無顯著性（t=1.35，P>0.05）;而與B組比較，D組小鼠單位長度胃黏膜淋巴濾泡的數量明顯增加，且淋巴濾泡明顯增大，差異具有統(tǒng)計學意義（t=3.05、4.01，P<0.05）。見表3。

2.3 肥胖對豬螺桿菌感染后小鼠胃組織NF-κB信號通路上游因子表達的影響

喂養(yǎng)24周后，小鼠胃組織內NF-κB信號通路的上游因子TNF-α、LTα、LTβ的mRNA表達水平，均在D組最高，B、C組次之，A組最低。析因設計的方差分析顯示，高脂飲食主效應有統(tǒng)計學意義（F=8.001～55.725，P<0.01），豬螺桿菌感染主效應亦有統(tǒng)計學意義（F=10.607～56.735，P<0.01），且二者存在交互作用（F=117.261～306.855，P<0.01）。提示高脂飲食和豬螺桿菌感染均對各因子表達有影響，二者存在交互作用，且由每組的最大合計數可知，該交互作用為正向協同作用。說明在豬螺桿菌感染的小鼠胃組織中，NF-κB信號通路被激活，高脂飲食誘導的肥胖進一步增強了NF-κB信號通路的活化。見表4。

2.4 肥胖對豬螺桿菌感染后小鼠胃黏膜相關淋巴趨化因子表達水平的影響

喂養(yǎng)24周后，小鼠胃黏膜相關淋巴趨化因子的表達水平，均在D組最高，B、C組次之，A組最低。析因設計方差分析結果顯示，高脂飲食主效應有統(tǒng)計學意義（F=6.620～13.737，P<0.01），豬螺桿菌感染主效應亦有顯著性（F=9.915～18.200，P<0.01），且二者存在交互作用（F=68.461～252.398，P<0.01）。提示高脂飲食和豬螺桿菌感染均對各因子表達有影響，二者存在交互作用，且由每組的最大合計數可知，該交互作用為正向協同作用。說明高脂飲食誘導的肥胖明顯促進了豬螺桿菌感染所致胃黏膜相關淋巴趨化因子的表達上調。見表5。

3 討 ?論

研究表明，C57BL/6J小鼠長期感染豬螺桿菌后幾乎100%可以引起胃MALT淋巴瘤樣病變[6]，且該菌與其他螺桿菌相比，與胃MALT淋巴瘤的發(fā)生關系更密切。因此，豬螺桿菌感染的小鼠是研究胃MALT形成機制以及胃MALT淋巴瘤發(fā)病機制的理想模型[9]。正常情況下胃黏膜不含有MALT，胃MALT作為異位淋巴組織，其形成是胃MALT淋巴瘤發(fā)生的組織學背景。螺桿菌感染的直接抗原刺激導致淋巴細胞的增殖與淋巴濾泡的形成，最終誘導MALT淋巴瘤的形成[16]。CXCL13及其受體CXCR5在Hp感染小鼠胃黏膜炎癥以及MALT形成中的作用已被證實，且這些因子表達上調主要是由非經典的NF-κB通路誘導活化的[17-18]。相關文獻報道，通過LTα1β2-LTβR-NIK-IKKα信號途徑激活NF-κB是MALT形成的關鍵步驟[19]。另一方面，腫瘤壞死因子受體（TNFR）傳遞信號誘導磷酸化和NF-κB抑制劑（IκB）下調，并觸發(fā)RelA-P50復合物從細胞質移位到細胞核（經典途徑），引起廣泛的炎癥基因的表達。且淋巴毒素β受體（LTβR）觸發(fā)磷酸化并處理p100（NF-κB2基因產物）依次生成p52，并最終激活RelB-p52復合體（非經典途徑）[20]，調節(jié)CXCL13、CCL19、CCL21和CXCL12等基因表達[21-22]。近年來，某些關鍵因子如腫瘤壞死因子和淋巴毒素α1β2（LTα1β2）在異位淋巴組織生成過程中的作用已被證實[23]。LTα1β2和TNF-α分別與各自的受體LTβR和TNFR1相結合，可激活NF-κB信號通路，誘導一系列趨化因子（CCL19、CCL21、CXCL12與CXCL13）表達增加，進而調節(jié)淋巴細胞歸巢，參與異位淋巴組織的形成[24-25]。本文研究結果表明，豬螺桿菌感染小鼠NF-κB信號通路上游因子和相關淋巴趨化因子mRNA表達水平明顯高于NC組。說明豬螺桿菌感染可能通過激活NF-κB信號通路以及上調胃內淋巴趨化因子表達影響胃MALT的發(fā)生發(fā)展。

目前肥胖致瘤機制的相關研究主要集中在脂肪因子的直接作用上，而肥胖對組織中趨化因子表達以及慢性感染引起的獲得性MALT形成的影響仍知之甚少。肥胖作為一種慢性低度炎癥狀態(tài)，主要表現為異常的細胞因子產生、免疫激活以及炎癥信號通路蛋白表達的增加[26]。在肥胖相關的慢性炎癥狀態(tài)下，脂肪細胞可表達多種主要由NF-κB調節(jié)的趨化因子如CCL19、CXCL12等[15，27]。此外，肥胖可以影響某些器官中免疫細胞對趨化因子的反應。例如，肥胖可以增加肝臟中淋巴細胞對趨化因子的反應，增加CD4+T細胞和B細胞對趨化因子CXCL12和CXCL13的趨化性[28-29]。本研究結果表明，豬螺桿菌感染可誘導胃黏膜淋巴濾泡形成，激活胃組織中NF-κB經典/非經典信號通路，并上調相關淋巴趨化因子的表達，而這種影響在不影響胃內豬螺桿菌菌量的前提下可被高脂飲食誘導的肥胖進一步加強，說明肥胖可能通過促進豬螺桿菌感染后NF-κB信號通路的激活，并上調淋巴趨化因子，進一步促進了胃MALT的發(fā)生發(fā)展。本文結果初步揭示了肥胖對胃MALT淋巴瘤發(fā)生的影響及其可能的機制。

綜上所述，高脂飲食誘導的肥胖狀態(tài)，促進了豬螺桿菌感染后胃MALT的發(fā)生發(fā)展，這可能與NF-κB信號通路的激活以及胃內淋巴趨化因子的表達上調有關。肥胖與腫瘤之間的關系涉及諸如炎癥變化、脂肪細胞因子譜改變、胰島素抵抗和脂肪組織低氧等多種機制，因此，肥胖相關性胃疾病確切的發(fā)病機制還需進一步研究探討。

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（本文編輯 馬偉平）