劉海霞，黃雪歡，鄔雨倩，王存敏，詹澤強(qiáng)，高鳳磊，廖 明，張建民

（1.廣東農(nóng)工商職業(yè)技術(shù)學(xué)院熱帶農(nóng)林學(xué)院，廣州510507；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院 人獸共患病防控制劑國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部人畜共患病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 廣東省動(dòng)物源性人獸共患病預(yù)防與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州510642）

沙門菌（Salmonella）是一種受到全世界廣泛關(guān)注的人獸共患病原菌，也是引起世界范圍內(nèi)細(xì)菌性食物中毒的重要致病菌，可以通過動(dòng)物、食物以及一些其他途徑傳遞，給人類健康及畜禽生產(chǎn)帶來極大的危害。全世界每年約有9380萬人感染沙門菌，造成約15.5萬人死亡[1-2]。在我國細(xì)菌性食物中毒中，70%～80%是由沙門菌造成的[3]。它廣泛分布于自然界，常污染豬肉、蛋類、雞肉等動(dòng)物性食品[4-5]。造成食品污染和人源感染的沙門菌優(yōu)勢血清型主要為鼠傷寒和腸炎沙門菌[6]。印第安納沙門菌在過去比較少見，1955年首次被分離于美國印第安納州一個(gè)臨床病例中[7]，隨后，在北美和歐洲，有幾起由印第安納沙門菌引起的嘔吐、腹瀉、發(fā)燒等臨床病例[7]。但近幾年逐漸成為重要的多重耐藥血清型之一。1984年，中國首次在一個(gè)外國游客體內(nèi)分離得到印第安納沙門菌，在隨后的24年（1984-2007年）共分離到13株菌。自2008年以來，由印第安納沙門菌感染引起的臨床報(bào)告數(shù)量急劇增加[7]。值得注意的是，印第安納沙門菌在動(dòng)物、食物和環(huán)境中的流行程度也逐漸提高，從而使印第安納沙門菌成為了中國沙門菌的主要血清型，取代了傳統(tǒng)上占主導(dǎo)地位的血清型[7]。在印第安納沙門菌流行的同時(shí)，還出現(xiàn)了多重耐藥印第安納沙門菌[7-8]，其迅速增長的耐藥性己嚴(yán)重削弱了傳統(tǒng)抗生素藥物的臨床作用，對于畜禽動(dòng)物性疾病防控以及人類的安全健康造成了巨大的威脅，因此亟需對印第安納沙門菌進(jìn)行深入的研究。

本研究檢測了沙門菌特定血清型印第安納沙門菌耐藥性及攜帶耐藥基因的情況，并基于PFGE技術(shù)進(jìn)行分型，探究采集于廣東省廣州市和佛山市禽樣品中的印第安納沙門菌分離株的耐藥性和耐藥基因分子特征，為了解印第安納沙門菌耐藥情況和保障食品安全提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 菌株來源36株印第安納沙門菌（SalmonellaIndiana）于2018年分離自廣東省廣州市（n=15）和佛山市（n=21）禽樣品；標(biāo)準(zhǔn)菌株SalmonellaBranderup H9812以及腸桿菌（Escherichia coli）ATCC 25922標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控菌株由本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.2 主要試劑和培養(yǎng)基抗生素購自廣州翔博生物科技有限公司；木糖賴氨酸脫氧膽鹽（XLD）、四硫磺酸鈉煌綠（TTB）增菌液、緩沖蛋白胨水（BPW）購自美國Becton公司；PFGE專用瓊脂糖（seaKem gold agarose）購自美國Bio-rad公司；沙門菌屬診斷血清購自S&A公司；沙門菌顯色培養(yǎng)基、MH瓊脂、LB瓊脂培養(yǎng)基和麥康凱培養(yǎng)基購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；限制性內(nèi)切酶XbaⅠ、細(xì)胞懸浮緩沖液（cell suspension buffer，CSB）、細(xì)胞裂解緩沖液（cell lysis buffer，CLB）購自寶生物（大連）有限公司。

1.3 血清型鑒定沙門菌診斷血清購自寧波天潤生物藥業(yè)有限公司。對沙門菌菌株做O多價(jià)血清凝集反應(yīng)及H抗原鑒定等，按GB4789.4-2010操作，依據(jù)White- Kauffmann-Le Minor抗原表對血清學(xué)分型鑒定的結(jié)果進(jìn)行血清型鑒定。

1.4 藥敏試驗(yàn)參照臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（CLSI，2010）推薦的瓊脂微量稀釋法[9]，對菌株進(jìn)行14種抗菌藥物的最小抑制濃度（the minimum inhibitory concentration，MIC）試驗(yàn)，根據(jù)CLSI提供的標(biāo)準(zhǔn)判讀藥敏結(jié)果（表1）。

表1 抗生素及稀釋濃度范圍Table 1 Antibiotics and dilution concentration range

1.5 印第安納沙門菌耐藥基因的PCR檢測提取菌株的DNA模板進(jìn)行沙門菌相關(guān)基因的檢測及序列測定，鑒定引物參考文獻(xiàn)[10]，引物由廣州艾基生物技術(shù)有限公司合成。PCR鑒定結(jié)果為陽性的產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）有限公司進(jìn)行測序。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性7 min；94℃變性1 min，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，34個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物通過1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。1.6 沙門菌的PFGE分型 方法參考美國CDC提供的標(biāo)準(zhǔn)方案進(jìn)行[11]，先用瓊脂糖包埋印第安納沙門菌和標(biāo)準(zhǔn)菌株沙門菌H9812后，加入50 UXbaⅠ酶，在37℃的水浴中消化1.5～2 h。使用Chef Mapper電泳系統(tǒng)（Bio-Rad），在14℃條件下電泳分離基因組18 h。使用BioNumerics 6.5版軟件（Applied Maths）分析PFGE結(jié)果。

2 結(jié)果與討論

2.1 藥敏試驗(yàn)結(jié)果36株印第安納沙門菌藥敏結(jié)果顯示：菌株對四環(huán)素的耐藥率最高，達(dá)100%，其次為磺胺異惡唑（97.2%）、氧氟沙星（97.2%）、氟苯尼考（75%）、氯霉素（75%）、萘啶酸（72.2%）、慶大霉素（63.9%）、環(huán)丙沙星（55.6%）、阿米卡星（30.6%）、頭孢噻肟（30.6%）、氨 西林（22.2%），對頭孢吡肟、多粘菌素B和亞胺培南完全敏感（表2）。97.2%（35/36）印第安納沙門菌呈現(xiàn)多重耐藥性（耐3種及3種以上的抗生素），1株（2.8%）耐1種抗生素，23株（63.9%）可耐8～10種抗生素。通過對耐藥分析可知，菌株對磺胺異惡唑、氧氟沙星、萘啶酸藥物以及酰胺醇類藥物耐藥嚴(yán)重，這與國內(nèi)和國外相關(guān)研究報(bào)道基本一致[7,12-14]，可能由于在食品動(dòng)物生產(chǎn)和臨床環(huán)境中使用不同種類和劑量的抗菌劑，也可能與這些傳統(tǒng)的抗菌藥物在畜禽養(yǎng)殖中已被長時(shí)間廣泛使用和濫用、給藥劑量次數(shù)不規(guī)則等給藥方法密切相關(guān)。特別值得注意的是，菌株對四環(huán)素的耐藥率達(dá)100%，這可能是由于四環(huán)素類藥物是高效的廣譜性抗菌藥，在臨床上應(yīng)用廣泛，因不合理的應(yīng)用，導(dǎo)致近年來細(xì)菌對四環(huán)素類藥物出現(xiàn)高水平耐藥[15-16]。喹諾酮類和頭孢類藥物是目前臨床上治療沙門菌感染并具有良好治療作用的重要抗生素[15-16]，但是本次研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，禽樣品中分離到的印第安納沙門菌對喹諾酮類和頭孢類藥物出現(xiàn)耐藥，對氧氟沙星、萘啶酸、環(huán)丙沙星、頭孢噻肟的耐藥率達(dá)30%以上。值得注意的是，臨床上治療細(xì)菌感染性疾病的“最后一線”藥物粘菌素類和碳青霉烯類抗生素均不耐藥，如多粘菌素B和亞胺培南，這與之前的研究結(jié)果[8,17]一致。本研究中，高達(dá)97.2%的菌株表現(xiàn)出多重耐藥性，耐藥譜多樣，表明廣東省部分地區(qū)禽產(chǎn)品中印第安納沙門菌的耐藥性嚴(yán)重，警醒我們在畜禽生產(chǎn)中要科學(xué)應(yīng)用、避免濫用抗菌藥物，以減少耐藥性的產(chǎn)生。

2.2 印第安納沙門菌相關(guān)耐藥基因檢測結(jié)果β-內(nèi)酰胺酶類耐藥基因是介導(dǎo)頭孢菌素耐藥的主要機(jī)制之一[13,16]，本研究對36株印第安納沙門菌頭孢類常見耐藥基因（blaOXA、blaTEM、blaCTX-M、blaCMY和blashv）進(jìn)行PCR檢測及測序。結(jié)果顯示，共有17株菌株攜帶有β-內(nèi)酰胺酶基因。其中，有17株（47.2%）攜帶blaOXA-1基因，5株（13.9%）含有blaTEM（blaTEM-1和blaTEM-135）以及1株（2.8%）含有blaCTX-M-55基因。沒有菌株檢測到blaCMY和blashv基因，這與以前的報(bào)道類似[7,16]，可以被用來解釋本次研究中菌株對頭孢噻肟耐藥的可能原因。喹諾酮類耐藥決定區(qū)基因parC和gyrA突變率分別為86.1%（31株）和61.1%（22株）。在gyrA基因中，最為常見的突變是位于83位點(diǎn)處的絲氨酸突變成苯丙氨酸，所占的比例為58.3%（21株）。除此之外，gyrA基因還存在87位點(diǎn)的天冬氨酸突變?yōu)楦拾彼峄蛱於０罚嫉谋壤謩e為59.4%（19株）、8.3%（3株）。在parC基因中，83.3%（30株）菌株突變發(fā)生在62位點(diǎn)蘇氨酸突變?yōu)榻z氨酸（Thr62→Ser）、52.8%（19株）菌株在85位點(diǎn)絲氨酸突變?yōu)榫彼幔⊿er85→Arg）、44.4%（16株）在140位點(diǎn)谷氨酸突變?yōu)樘於彼幔℅lu140→Asp）；94.4%（34株）菌株攜帶至少1個(gè)parC或gyrA突變，66.7%（24株）菌株攜帶至少2個(gè)QRDRs突變（表3）。PMQR基因檢測中檢出aac(6')-Ib-cr最多（21株，58.3%），其次是qnrS（13株，36.1%），檢出qnrB最少（4株，11.1%）。本研究并未檢出qnrA、qnrC、qnrD和qepA。36株印第安納沙門菌中共有33株攜帶至少1種喹諾酮類耐藥基因（plasmid-mediated quinolone resistance，PMQR），陽性率為91.7%。共有5株攜帶至少2種PMQR基因，陽性率為13.9%（表4）。喹諾酮類耐藥決定區(qū)（quinolone resistance determining region，QRDR）基因突變和質(zhì)粒介導(dǎo)的PMQR基因是沙門菌對喹諾酮類藥物產(chǎn)生耐藥性的主要原因[16]。在本研究中，94.4%菌株至少發(fā)生1個(gè)parC或gyrA突變。有研究表明，QRDR的點(diǎn)突變可以降低對喹諾酮類藥物的敏感性[18-19]，QRDR突變結(jié)果與菌株對氧氟沙星和萘啶酸的高耐藥率結(jié)果具有一致性。質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮類耐藥基因可通過外排泵等機(jī)制增強(qiáng)細(xì)菌對喹諾酮類藥物的耐藥性[20]，研究結(jié)果顯示，高達(dá)91.7%的菌株攜帶PMQR耐藥基因，且檢測出有PMQR基因的菌株對氧氟沙星都耐藥。表明高攜帶率的PMQR基因和QRDR位點(diǎn)高突變率與印第安納沙門菌對喹諾酮表現(xiàn)出的高耐藥存在一定的關(guān)系。

表2 36株印第安納沙門菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Drug susceptibility test results of 36 strains of Salmonella Indiana

表3 36株印第安納沙門菌QRDR突變的檢出結(jié)果Table 3 Detection results of QRDR mutations in 36 strains of Salmonella Indiana

2.3 PFGE分型結(jié)果目前國內(nèi)外研究者常用PFGE技術(shù)進(jìn)行病原菌的分子分型及溯源研究[11]，廣東省廣州市和佛山市禽樣品中分離出的36株印第安納沙門菌的PFGE分型結(jié)果顯示，共有32種PFGE基因指紋圖譜產(chǎn)生，根據(jù)菌株間相似度80%來劃分PFGE簇，將36株印第安納沙門菌分為8個(gè)PFGE型簇和2個(gè)單獨(dú)條帶，8個(gè)基因簇分別是A簇、B簇、C簇、D簇、E簇、F簇，G簇和H簇，包含的菌株數(shù)分別為4株、4株、7株、3株、2株、2株、2株和8株。所含的基因型數(shù)分別為：4個(gè)、4個(gè)、4個(gè)、3個(gè)、2個(gè)、2個(gè)、2個(gè)、7個(gè)。其中H簇最大，由22.2%（8/36）的菌株組成（圖1）。結(jié)果表明：廣州市和佛山市流行的印第安納沙門菌基因型種類較復(fù)雜，且基因型差異性較大，呈現(xiàn)遺傳多樣性。H簇是一個(gè)優(yōu)勢簇，其中包含不同采樣點(diǎn)，不同樣品來源的菌株，有不同源菌株帶型相似度達(dá)到了100%，這提示禽產(chǎn)品間可能存在交叉污染或者共同來源。

表4 印第安納沙門菌PMQR的檢出率Table 4 Detection rates of Salmonella Indiana PMQR

本研究結(jié)果顯示，廣東省部分地區(qū)禽源樣品中印第安納沙門菌多重耐藥性嚴(yán)重，喹諾酮類耐藥決定區(qū)gyrA和parC基因突變和質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮類耐藥基因（PMQR）在菌株中普遍存在，而PFGE分子分型顯示其遺傳是多樣性的。同源菌株的存在表明存在交叉污染或共同來源。為減少印第安納沙門菌引起的公共衛(wèi)生健康威脅，應(yīng)加強(qiáng)食品安全監(jiān)督并規(guī)范抗菌藥物的使用。

圖1 印第安納沙門菌PFGE圖譜Fig.1 PFGE map of Salmonella Indiana