譚 婷,朱 斌,楊 倩,吳娟娟,史 娟(陜西理工大學化學與環(huán)境科學學院,陜西省催化重點實驗室,陜西漢中 723000)

抗生素類化合物可有效殺滅細菌、預防感染,在醫(yī)藥、畜牧業(yè)和水產養(yǎng)殖業(yè)中被大量使用。但因機體吸收不徹底,人或動物所服用的抗生素的30%～90%以代謝物或原態(tài)進入環(huán)境,導致抗生素污染較為嚴重[1-3]。近年來,“超級細菌”被頻頻報道,正是由于抗生素濫用產生的多重耐藥菌株所致,全球每年約有70萬人死于此類感染[3-6],目前出現(xiàn)的多重耐藥菌株主要有金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌等[7]。來源于植物的生物堿、黃酮、萜、單寧、植物精油、多糖等物質皆具抑菌功能,這些抑菌成分對環(huán)境友好、對非靶標生物安全、不易產生抗性;同時,還具有促進作物生長、提高抗病性等作用,且種類多、開發(fā)途徑廣[8]。葛根芩連湯為中醫(yī)經(jīng)典配方,出自于《傷寒論》。徐蓓蕾等[9]研究表明葛根芩連湯具有較強的抗菌作用,而葛根芩連湯中重要組分黃連主要有效物質為小檗堿,即考慮將葛根與紫葉小檗果配伍,研究配伍抑菌劑對金黃色葡萄球菌與大腸桿菌的抑制作用。

我國幅員遼闊,地理復雜多變,植物資源豐富,為植物源抑菌劑開發(fā)利用提供了得天獨厚的條件。小檗堿,又名黃連素,廣泛存在于小檗科植物中[10],對細菌、真菌和原蟲等病原微生物具有較強抑制作用,可用于多種疾病的治療[11-13]。研究發(fā)現(xiàn),小檗堿還具有消除細菌耐藥質粒,恢復細菌對其他抑菌藥物的敏感性的優(yōu)點,可作為抗生素的潛在替代物[14-15]。稀硫酸法、乙醇浸提法、水提法常被用于植物中小檗堿的提取,但溶劑耗量大、提取耗時長、且得率低。超聲波法和微波法具有省時、穿透力強、溶劑用量少的優(yōu)點,但易導致有效成分結構遭到破壞[16-17]。生物酶法通過酶的預處理,增加了植物細胞壁通透性,誘導傳質現(xiàn)象,有效促進生物活性化合物的釋放,具有省時、高效、低能耗的優(yōu)點[18];不足之處在于酶法受溫度限制較大,植物有效成分僅靠低溫酶浸提難以達到較佳的提取效果。

紫葉小檗(Berberisthunbergiivar.atropurpureaChenault)為小檗科(Berberis)落葉灌木,原產于東北南部至秦嶺一帶[19-20],在我國各大城市均有栽培,主要作為一種獨特的園林觀賞植物。目前對其藥用價值的研究,主要集中在該植物的根或莖皮部位。向前勝等[21]的研究發(fā)現(xiàn),紫葉小檗根莖部分小檗堿含量最高可達到3.49%。為進一步開發(fā)紫葉小檗植株的利用價值,提高經(jīng)濟效益,本實驗以紫葉小檗果為研究對象,纖維素酶預處理后,水浸法對紫葉小檗果小檗堿進行提取,單因素及正交設計法確定紫葉小檗果小檗堿的最佳提取工藝,柱色譜法對所得小檗堿進行分離純化。同時,研究小檗堿對六種植物病菌的抑菌作用;同時在《葛根芩連湯》的基礎上將紫葉小檗堿與葛根進行配伍,進一步探究配伍抑菌劑對于金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的抑制作用,為耐藥抗菌制劑的配制提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紫葉小檗果 沐陽縣康卓園林有限公司;葛根 漢中市藥材公司;馬鈴薯干腐病菌(Fusariumsolani,F.s.)、番茄灰霉病菌(Botrytiscinerea,B.c.)、尖孢鐮刀病菌(Fusariumoxysporum,F.o.)、蘋果炭疽病菌(Colletotrichumgloeosporioides,C.g.)、水稻稻瘟病菌(Magnaporthegrisea,M.g.)、蘋果腐爛病菌(Cytosporasp,C.s.) 陜西理工大學生物科學與工程學院微生物實驗室提供,在2～8 ℃冷藏保存,28 ℃條件下,在馬鈴薯培養(yǎng)基上培養(yǎng);金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、大腸桿菌(Escherichiacoli) 來自陜西理工大學生物科學與工程學院微生物實驗室,于2～8 ℃冷藏保存,37 ℃條件下,在LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)；鹽酸小檗堿標品 純度≥98%,西安開來生物工程有限公司;纖維素酶 5000 U/g,生物試劑,寧夏和氏璧生物技術有限公司;葡萄糖 分析純,上海埃彼化學試劑有限公司;瓊脂、酵母浸粉、胰蛋白胨 分析純,北京市奧博星生物技術有限責任公司;無水乙醇 分析純,天津市天利化學試劑有限公司;其他試劑 均為國產分析純;實驗用水 均為蒸餾水。

AR 124CN型電子天平 奧豪斯儀器上海有限公司;RE-52A型旋轉蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;恒溫水浴鍋 上海騰方公司;LD4-2A(Ⅱ)離心機 北京京力公司;DGG-9140B型電熱恒溫鼓風干燥箱 上海森信實驗儀器有限公司;UV-2600型紫外分光光度計 日本津島公司;SW-CJ-IB型超凈工作臺 蘇州凈化設備有限公司;SHP-80型生化培養(yǎng)箱 上海森德實驗儀器有限公司;LDZX-30KBS立式壓力蒸汽滅菌箱 上海申安醫(yī)療器械廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基制備 馬鈴薯固體培養(yǎng)基:取200 g去皮土豆,切成小塊,加入1000 mL水,煮沸30 min,雙層紗布過濾取濾液。加入20 g瓊脂粉,20 g葡萄糖,并定容至1000 mL。加熱攪拌均勻,將濾液放入壓力蒸汽滅菌箱120 ℃高壓滅菌30 min。胰蛋白胨固體培養(yǎng)基:取1000 mL水,加入10 g胰蛋白胨、5 g酵母浸粉、10 g氯化鈉、20 g瓊脂粉,煮沸,放入壓力蒸汽滅菌箱120 ℃高壓滅菌30 min。

1.2.2 紫葉小檗果小檗堿的提取 紫葉小檗果洗凈,研碎,烘至恒重后,精密稱取4.00 g,加入1 μL,pH=1的稀硫酸溶液與20 mL水組成的混合溶液,加入一定量的纖維素酶,50 ℃恒溫酶解一定時間后,加入一定體積的水做提取溶劑,浸泡提取一定時間后,200目過濾,常溫3000 r/min離心10 min,棄去沉淀,收集上清液,得到紫葉小檗果小檗堿提取液。

1.2.3 單因素實驗 采用“1.2.2”實驗步驟,在固定其他工藝參數(shù)條件下,依次改變纖維素酶用量、酶解時間、料液比及浸提時間,分別考察四個因素的不同水平值對小檗堿得率的影響。每4 g紫葉小檗果纖維素酶用量考察水平分別為:20、40、80、120、160 mg,固定酶解時間120 min,料液比1∶10 g/mL,浸提時間60 min。酶解時間考察水平的工藝參數(shù):酶解時間60、90、120、150、180 min,纖維素酶用量120 mg,料液比1∶10 g/mL,浸提時間60 min。料液比考察水平為:料液比1∶8、1∶10、1∶12、1∶14、1∶16 g/mL,纖維素酶用量為120 mg,酶解時間為120 min,浸提時間60 min。浸提時間分別為:60、90、120、150、180 min,纖維素酶用量120 mg,酶解時間120 min,料液比固定1∶10 g/mL。各水平條件下分別計算小檗堿得率。

1.2.4 正交實驗 根據(jù)單因素實驗結果,選取纖維素酶用量(A)、酶解時間(B)、料液比(C)、水浸提時間(D)四因素,進行表1所示L9(34)正交實驗,考察各因素水平條件下小檗堿得率。

表1 正交實驗因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.2.5 紫葉小檗果小檗堿的測定

1.2.5.1 標準品工作曲線的測定 參考文獻方法[22-23],準確稱取鹽酸小檗堿標準品0.0052 g,使用無水乙醇將其溶解后,于100 mL容量瓶內定容,得到濃度為50 μg/mL的標準品儲備液。準確吸取該儲備液2、4、6、8、10 mL分別置于50 mL容量瓶中,以無水乙醇為溶劑定容,制得等濃度梯度的鹽酸小檗堿溶液組。以無水乙醇為空白對照,在345 nm處測其吸光度。再以鹽酸小檗堿濃度為橫坐標,吸光度為縱坐標,得標準品工作曲線方程:A=49.479C+0.0048(R2=0.9998)。式中A為吸光度;C為鹽酸小檗堿濃度,μg/mL。

1.2.5.2 小檗果小檗堿得率計算 吸取1 mL提取液,在345 nm波長下測定吸光值,每個樣品平行做3組,取平均值代入工作曲線方程計算得到紫葉小檗果提取液中小檗堿的濃度,采用式(1)計算紫葉小檗果小檗堿的得率。

Y(%)=(C測×V/m)×n×10-6

式(1)

式中：Y為小檗堿得率,%;C測為工作曲線方程計算所得到小檗堿的濃度,μg/mL;V為定容體積,mL;m為稱樣量,g;n為稀釋倍數(shù)。

1.2.6 色譜柱法純化工藝 將最優(yōu)條件下得到的紫葉小檗果水提取物在旋轉蒸發(fā)儀中65 ℃減壓旋轉蒸發(fā)濃縮為棕褐色粘稠狀后,加入少量中性氧化鋁粉末拌均勻[21-22]。選用20 mm×700 mm色譜柱,在色譜柱下端塞入適量棉花并干法裝柱。上樣,室溫進行中性氧化鋁柱層析。以氯仿-甲醇梯度洗脫,調整流速為3 mL/min,每25 mL收集一份并依次編號。以“1.2.5.1”鹽酸小檗堿貯備液做對照品,氯仿∶甲醇∶氨體積比15∶4∶1為層析液,進行薄層色譜分析[24-26],在紫外分析儀下進行洗脫液物質鑒定。合并與鹽酸小檗堿貯備液組成相同的流分,旋轉蒸干溶液得到紫葉小檗果實有效成分小檗堿的純品。

1.2.7 抑菌實驗 進行小檗堿對馬鈴薯干腐病菌(F.s.)、番茄灰霉病菌(B.c.)、尖孢鐮刀病菌(F.o.)、蘋果炭疽病菌(C.g.)、水稻稻瘟病菌(M.g.)和蘋果腐爛病菌(C.s.)六種植物病菌抑菌活性測定以及配伍抑菌劑對兩種細菌的抑菌活性測定。

1.2.7.1 小檗堿對植物病菌抑菌活性測定 將“1.2.6”所得小檗堿配制為0.25、0.50、1.00、2.00、4.00 mg/mL的梯度帶小檗堿的馬鈴薯固體培養(yǎng)基,并設置小檗堿濃度為0 mg/mL的空白對照組。取活化后的F.s、B.c.、F.o.、C.g.、M.g.和C.s.六種植物病菌,使用打孔器制得直徑為7 mm的病菌菌餅,將菌餅的菌絲面向下呈“品”字形放置于凝固的抑菌培養(yǎng)基中,以菌餅互不干擾生長為準。恒溫28 ℃培養(yǎng)72 h,以十字交叉法測定抑菌圈直徑大小,每組實驗重復三次,并由如下公式計算得到抑菌率。

抑菌率計算公式為:

抑菌率(%)=(空白組平板菌落直徑-樣品組平板菌落直徑)/(空白組平板菌落直徑-7 nm)×100

1.2.7.2 小檗果及與葛根配伍組分對細菌抑菌活性測定 抑菌劑的制備:參照文獻[27]進行實驗方案設計,設置葛根與紫葉小檗質量比分別為0∶50、6∶44、12.5∶37.5、25∶25、50∶0。按質量比各準確稱取小檗果與葛根生藥每份50 g,共五份,分別加入20倍量水,浸泡30 min,水煎煮2次,每次120 min,第二次煎煮加入10倍水,合并2次濾液,旋蒸至棕褐色糊狀濃稠液,然后裝進密封袋,放入冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

參照文獻[27-28]方法,使用打孔器制得直徑6 mm圓形濾紙,高壓滅菌后,向各濾紙片中滴加20 μL小檗果與葛根配伍所制得的抑菌劑藥液,室溫晾干。分別將107CFU/mL金黃色葡萄球菌或大腸桿菌懸液均勻平鋪于各胰蛋白胨固體培養(yǎng)基中,吸出多余菌液重復利用。將含同種藥液濾紙片呈“品”字形放置三片于含菌培養(yǎng)基中,恒溫37 ℃培養(yǎng)24 h測定抑菌圈直徑。每個菌種重復實驗三次,以無藥液圓形濾紙片為對照組,所得抑菌圈直徑均為三次實驗平均值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 纖維素酶用量對小檗堿得率的影響 由圖1可知,紫葉小檗果小檗堿得率隨纖維素酶用量增加,呈升高趨勢。在纖維素酶用量為20～40 mg時,小檗堿得率迅速升高;在40～80 mg時小檗堿得率增幅減緩;超過80 mg繼續(xù)增加纖維素酶用量對小檗堿得率影響較小。這是因為實驗限定的紫葉小檗果投量有限,在纖維素酶用量為80 mg時,大部分小檗堿已成功析出,故而繼續(xù)增加纖維素酶用量對得率影響較小,綜合得率與成本,確定纖維素酶用量以80 mg為宜。

圖1 纖維素酶用量對小檗堿得率的影響Fig.1 The effect of cellulose on berberine extraction rate

2.1.2 酶解時間對小檗堿得率的影響 由圖2可知,小檗堿得率在酶解時間為60～150 min時呈明顯上升趨勢,而在150～180 min范圍內呈下降趨勢,出現(xiàn)此趨勢的原因可能為:增加酶解時間有利于纖維素酶分解紫葉小檗果實,隨著時間的增長,果實細胞壁逐漸疏松,小檗堿更易從細胞內部進入溶液,從而提高了小檗堿得率使小檗堿得率(達到0.19%)。而酶解時間過長導致小檗堿得率由0.19%下降至0.18%,可能是因為細胞壁過于疏松,從而更多雜質進入提取液中影響小檗堿的檢測[29],故選擇150 min作為最佳酶解時間。

圖2 酶解時間對小檗堿得率的影響Fig.2 The effect of enzymatic hydrolysis time on berberine extraction rate

2.1.3 料液比對小檗堿得率的影響 由圖3可知,料液比在1∶8～1∶12 g/mL時,得率隨著料液比的降低而逐漸升高,說明增加提取溶劑用量,有利于小檗堿的溶出,故而得率升高。在料液比為1∶12 g/mL時達到峰值。當料液比小于1∶12 g/mL之后,小檗堿得率增加較為緩慢。但繼續(xù)增加溶劑用量,小檗堿得率出現(xiàn)小幅降低。這可能是因為,底物有限,料液比過小導致水溶性雜質增多,干擾了小檗堿的測定。故選擇最佳提取料液比為1∶12 g/mL。

圖3 料液比對小檗堿得率的影響Fig.3 The effect of material to liquid ratio on berberine extraction rate

2.1.4 浸提時間對小檗堿得率的影響 由圖4可知,在60～150 min提取時間范圍內,隨著時間的增長,小檗堿得率增加。在60～90 min范圍內小檗堿得率增加較快;當時間范圍為90～150 min時小檗堿得率緩慢增加?？赡茉驗?紫葉小檗果中小檗堿按一定速率擴散進入溶液中,在60～90 min時間段內,細胞內外小檗堿滲透壓較大導致小檗堿在此段時間中快速滲透至溶液中使小檗堿得率在此階段迅速上升,在浸提時間為90 min時小檗堿得率達到0.186%;之后因小檗堿已基本擴散完全,導致90～150 min時小檗堿得率增加緩慢。同時,過長的浸提時間可能會造成小檗堿結構發(fā)生改變,使得在150～180 min階段小檗堿得率由0.187%下降至0.180%[29-30]。選擇最佳浸提時間為150 min。

圖4 浸提時間對小檗堿得率的影響Fig.4 The effect of extraction time on berberine extraction rate

2.2 正交實驗

2.2.1 正交實驗 由表2可知,四個因素對小檗堿得率的影響大小為:D>A>B>C,即浸提時間>纖維素酶用量>酶解時間>料液比。根據(jù)正交實驗結果進行直觀分析和考慮綜合因素,紫葉小檗果小檗堿的最佳的提取條件是A3B1C2D2,即纖維素酶用量120 mg,酶解時間120 min,料液比1∶12 g/mL,水浸提時間150 min。

表2 正交實驗及極差分析Table 2 Orthogonal experiment and rang analysis

2.2.2 驗證性實驗 為進一步考察上述優(yōu)選工藝的穩(wěn)定性,按正交實驗最佳條件:纖維素酶用量120 mg、酶解時間120 min、料液比1∶12 g/mL、提取時間150 min,進行三次平行實驗。計算小檗堿得率,得到平均得率為0.198%±0.0066%。

2.3 抑菌實驗結果

2.3.1 小檗堿對植物病菌抑菌活性 由表3可知:紫葉小檗果所含小檗堿對測試六種植物病菌均表現(xiàn)出抑菌作用,且抑菌活性與抑菌劑濃度呈現(xiàn)正的量效關系;在小檗堿濃度為4 mg/mL時,小檗堿對六種植物病菌的抑菌效果排序如下:尖孢鐮刀病菌(F.o.)>蘋果腐爛病菌(C.s.)>番茄灰霉病菌(B.c.)>水稻稻瘟病菌(M.g.)>馬鈴薯干腐病菌(F.s.)>蘋果炭疽病菌(C.g.);小檗堿對尖孢鐮刀病菌(F.o.)抑制作用最為顯著,當小檗堿濃度達到4 mg/mL時對于尖孢鐮刀病菌的抑菌率達到89.28%。在小檗堿梯度濃度下各組抑菌率差異顯著。

表3 小檗堿對植物病菌的抑菌活性實驗結果Table 3 Experimental results of berberine’s antibacterial activity against plant pathogens

2.3.2 葛根與小檗果配伍組分對細菌抑菌活性測定 由表4可知:小檗果、葛根與小檗果配伍組分對金黃色葡萄球菌的抑制作用均強于大腸桿菌;在實驗范圍內對于金黃色葡萄球菌的抑制作用隨著紫葉小檗果比重增加而增強,葛根:小檗果質量比0∶50時抑菌圈直徑最大達到20.42 mm;隨著葛根比重的增加,配伍抑菌劑對金黃色葡萄球菌的抑制作用逐漸減弱,并且各組抑菌圈直徑均大于葛根:小檗果質量比為50∶0組,但此組抑菌圈直徑大于濾紙片直徑,說明葛根對金黃色葡萄球菌有弱的抑菌活性;葛根與小檗果配伍對大腸桿菌的抑制作用在質量比為6∶44時出現(xiàn)最大值,抑菌圈直徑達到12.12 mm,顯著高于其他各組(P<0.05),繼續(xù)增大小檗果用量,直徑反而減小,因此,在一定質量比范圍內葛根與小檗果配伍對大腸桿菌的抑制具有輔助增強作用,其最佳配伍比例為6∶44。

表4 小檗果及與葛根配伍組分對細菌抑菌活性實驗結果Table 4 Experimental results on bacteriostatic activity of fruit of Berberis thunbergii var atropurpureaand components compatible with pueraria

3 結論

本研究以紫葉小檗果為原料,將小檗堿得率作為考察指標,通過單因素和正交實驗得到了紫葉小檗果中小檗堿的最佳提取工藝條件,小檗堿得率達到0.198%,柱色譜法進一步為所提取小檗堿進行了分離提純。體外抑菌實驗表明紫葉小檗果所含小檗堿對測試病菌中的尖孢鐮刀病菌,具有明顯的抑制作用,當小檗堿濃度達到4 mg/mL時對于尖孢鐮刀病菌的抑菌率達到89.28%。細菌抑制實驗證實小檗果對金黃色葡萄球菌的抑制作用高于大腸桿菌;當葛根與其配伍時對于大腸桿菌的抑制具有輔助增強的作用,最佳配伍為葛根:紫葉小檗質量比6∶44,這為研制針對耐藥菌株的中藥制劑提供了有效依據(jù)。本研究工作有望應用于紫葉小檗果中小檗堿的提取及抑菌劑開發(fā)中,為進一步提高紫葉小檗植株的利用價值起到一定的促進作用。