王之瑩,李婷婷,于文杰,喬 璐,陳愛亮

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所,北京 100081)

驢在農(nóng)村經(jīng)濟(jì)中占有重要的地位,驢奶也具有廣泛的應(yīng)用。長(zhǎng)期以來(lái),人們一直有飲用驢奶的習(xí)慣,不僅因?yàn)樗^高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值,還因?yàn)樗乃幱脙r(jià)值,能夠預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化、緩解牛奶蛋白過敏患者的過敏反應(yīng)[1-2]。在歐美,驢奶不但是生物制劑的加工原料,更是一種流行的保健飲品。在我國(guó),雖然有很多人飲用驢奶,但鑒于我國(guó)的產(chǎn)驢地區(qū)主要位于西北偏遠(yuǎn)地帶,而奶制品保質(zhì)期較短,運(yùn)輸困難,因此即使新疆每年可產(chǎn)驢奶4萬(wàn)噸,而實(shí)際用于加工的驢奶非常少,造成這一資源的巨大浪費(fèi)[3]。最重要的是,目前國(guó)內(nèi)尚缺乏規(guī)模完整的驢奶加工廠,市場(chǎng)上銷售的驢奶大多源于家庭作坊,加之,與其他高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的奶制品一樣,驢奶的價(jià)格(80～150 元/kg)[4]相對(duì)于牛奶(約10.60 元/kg)[5]較為昂貴,從而導(dǎo)致驢奶成為摻假的潛在目標(biāo)。出于安全考慮,飲用摻假的驢奶會(huì)危害到牛奶蛋白過敏患者的身體健康[6],因此,需要一種能夠快速、靈敏地檢測(cè)驢奶含量的方法,確定其是否摻假及摻假比例。

目前,物種鑒定技術(shù)主要是基于蛋白質(zhì)和基于核酸的方法。基于蛋白質(zhì)的檢測(cè)技術(shù)包括高效液相色譜[7]、光譜技術(shù)[8]以及酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定[9],這些技術(shù)雖然測(cè)得的結(jié)果準(zhǔn)確,但操作繁瑣且需要昂貴的儀器。此外,蛋白質(zhì)在加工過程中容易變性,因此在檢測(cè)加工乳制品時(shí),會(huì)降低其方法的靈敏度[10]。相比之下,DNA具有較高的穩(wěn)定性,使得核酸檢測(cè)技術(shù)成為物種鑒定中最常用的技術(shù),包括普通的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)[11]、熒光定量PCR[12]和等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)[13]。定性PCR比較常見,但它只能檢測(cè)物種的種類,而定量PCR可以判斷摻假的比例[14]。當(dāng)前已有許多關(guān)于定量PCR的研究,但這些研究主要集中在線粒體基因[15],而線粒體基因在不同的物種或者組織中具有高變異性和多拷貝數(shù),這一特點(diǎn)會(huì)導(dǎo)致定量分析存在測(cè)量誤差[16]。

表1 驢特異性引物和內(nèi)參引物的序列Table 1 Sequences of donkey-specific primers and reference primers

為了解決這一問題,本研究篩選了單拷貝核基因作為驢的特異性基因和通用性的內(nèi)參基因,該基因在不同的物種或者組織中具有穩(wěn)定且恒定表達(dá)的拷貝數(shù)(一個(gè)或者幾個(gè)拷貝)[17-18]。同時(shí),內(nèi)參基因在不同的生物體或者細(xì)胞中能夠穩(wěn)定表達(dá),從而避免物種間多樣性的干擾[19]。本文旨在開發(fā)一種標(biāo)準(zhǔn)化熒光定量PCR方法來(lái)定量待檢的滅菌乳樣品中驢奶的含量。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

驢奶 新疆烏魯木齊縣南山哈薩克牧場(chǎng);牛奶 呼倫貝爾陳巴爾虎旗陶海牧場(chǎng);山羊奶 廣東揭陽(yáng)市揭西縣億豐牧場(chǎng);牦牛奶 西藏羌塘牧場(chǎng);駱駝奶 哈薩克食品直供基地;Tris、十二烷基硫酸鈉(SDS) 德國(guó)Sigma-Aldrich公司;PBS緩沖液(10×) 北京索萊寶公司;蔗糖、NaCl、MgCl2、Na2HPO4、EDTA、NH4Cl、乙醇 北京國(guó)藥控股化學(xué)試劑有限公司;丙酮、鹽酸 北京化工廠有限責(zé)任公司;KAPA PROBE FAST qPCR Kit試劑盒 美國(guó)KAPA Biosystems公司;核酸吸附柱 北京天根生化科技有限公司。

ABI 7500熒光定量PCR儀 美國(guó)Applied Biosystems公司;DK-S24恒溫水浴鍋 上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;Nanodrop 2000分光光度計(jì)、Heraeus Multifuge X3離心機(jī) 賽默飛世爾科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品制備 實(shí)驗(yàn)所需奶制品均為滅菌乳,分別從不同牧場(chǎng)購(gòu)買和收集,包括牛奶、山羊奶、牦牛奶、駱駝奶和驢奶。另外,將牛奶和驢奶混合,制備5%、10%、30%、50%和80%的驢奶混合物作為標(biāo)準(zhǔn)樣品,以建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。同時(shí)制備20%、50%、80%的驢奶混合物作為模擬摻假樣品。每個(gè)濃度的混合樣品進(jìn)行三次重復(fù)。

1.2.2 DNA提取 對(duì)于市場(chǎng)上銷售的合格的滅菌乳,其體細(xì)胞數(shù)相對(duì)穩(wěn)定,且乳制品的核酸大多存在于體細(xì)胞中,因此采用Pokorska法[20]從體細(xì)胞中提取DNA。取10 mL滅菌乳,4 ℃ 8500×g 離心15 min,去除乳脂和上清液。然后用2 mL緩沖液A(15 mmol/L Tris-HCl(pH7.4～7.6)、25 mmol/L NaCl、5 mmol/L MgCl2、15 mmol/L Na2HPO4、2.5 mmol/L EDTA和1%蔗糖)洗滌含有奶制品體細(xì)胞的沉淀兩次。加入2 mL裂解液B(pH8.8;6% SDS、3 mmol/L MgCl2、15 mmol/L Tris-HCl、0.5% DMSO和6%丙酮),65 ℃孵育約2 h。隨后,加入450 μL的蛋白質(zhì)沉淀緩沖液(2.35 mol/L NH4Cl,1.15 mol/L NaCl和38%乙醇),混合后,10 ℃ 16000×g離心8 min。將上層清液轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的離心管,加入1000 μL 100%異丙醇,然后將混合物添加到核酸吸附柱中,13400×g離心1 min,使DNA吸附到硅膠膜上,再用70%的乙醇洗滌兩次,室溫干燥。最后,將純化的DNA用80 μL TE緩沖液溶解,并用Nanodrop 2000分光光度計(jì)檢測(cè)提取到的DNA的濃度,DNA的濃度為5～10 ng/μL,OD260 nm/OD280 nm值為1.8～2.1。

1.2.3 單拷貝核基因設(shè)計(jì)引物 以驢生長(zhǎng)激素受體(the growth hormone receptor)為特異基因[16],以肌肉生長(zhǎng)抑制基因(the muscle growth-inhibiting genes)為內(nèi)參基因[21],設(shè)計(jì)特異性引物和內(nèi)參引物。引物和探針的序列如表1所示,由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。

1.2.4 熒光定量PCR反應(yīng) 20 μL熒光定量PCR反應(yīng)混合液包括:10 μL預(yù)混液(2×),0.4 μL正向引物,0.4 μL反向引物,0.4 μL探針,0.4 μL ROX(50×),2 μL DNA提取液和6.4 μL蒸餾水(ddH2O)。反應(yīng)在ABI 7500儀器中進(jìn)行,擴(kuò)增步驟如下:95 ℃預(yù)變性2 min;95 ℃變性30 s,60 ℃退火32 s,反應(yīng)進(jìn)行50個(gè)循環(huán);72 ℃延伸2 min。每個(gè)DNA模板重復(fù)PCR反應(yīng)三次,ddH2O作為模板進(jìn)行空白對(duì)照(NTC),監(jiān)測(cè)污染。Ct值代表各反應(yīng)中熒光強(qiáng)度達(dá)到特定閾值的循環(huán)數(shù)[22]。

1.2.5 特異性引物和通用性引物的驗(yàn)證 分別使用特異性引物和內(nèi)參引物在1.2.4中熒光定量PCR反應(yīng)條件下同時(shí)擴(kuò)增5個(gè)不同物種的乳制品的DNA樣本(牛奶、山羊奶、牦牛奶、駱駝奶和驢奶),對(duì)特異性引物和通用性引物進(jìn)行驗(yàn)證。NTC(No template control)為空白對(duì)照。

1.2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 將驢奶和牛奶進(jìn)行混合,制備5%、10%、30%、50%和80%的驢奶摻假標(biāo)準(zhǔn)樣品,并按上述方法提取DNA進(jìn)行擴(kuò)增。并根據(jù)以下公式建立標(biāo)準(zhǔn)曲線:

Y=Ctspecific/Ctreference

Y=a X+b

其中:Ctspecific和Ctreference分別為驢的特異性引物和內(nèi)參引物的Ct值,表示驢奶和總奶的DNA拷貝數(shù)[23],然后通過繪制Y與驢奶的含量(X=驢奶/總奶)之間的關(guān)系,創(chuàng)建校準(zhǔn)曲線。

1.2.7 模擬摻假樣品分析 為了驗(yàn)證該方法的實(shí)用性,分別以20%、50%和80%的比例將驢奶與牛奶混合,進(jìn)行模擬摻假實(shí)驗(yàn)。每個(gè)濃度在取樣時(shí)都做了三個(gè)平行。用得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算驢奶在混合奶中的比例,與實(shí)際摻假比例進(jìn)行對(duì)比,通過回收率、標(biāo)準(zhǔn)差(SD)和變異系數(shù)(CV)來(lái)驗(yàn)證該方法的準(zhǔn)確性。

1.2.8 市售驢奶樣品分析 由于目前市場(chǎng)上的驢奶產(chǎn)品以純驢奶為主,因此購(gòu)買來(lái)自不同產(chǎn)地的驢奶,檢測(cè)其是否摻假及摻假比例,包括山東濟(jì)南、寧夏吳忠、河南駐馬店、新疆烏魯木齊。每個(gè)產(chǎn)地在取樣時(shí)做了三個(gè)平行,然后提取DNA,用特異性引物和通用引物以同一個(gè)DNA模板在不同反應(yīng)體系中進(jìn)行擴(kuò)增,將得到的Ct值用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算驢奶的含量,從而判定其是否摻假。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用Office軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和圖表的制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)參引物的驗(yàn)證

為了驗(yàn)證內(nèi)參引物的通用性,用內(nèi)參引物對(duì)不同物種的乳制品DNA進(jìn)行了擴(kuò)增(牛、山羊、牦牛、駱駝、驢),NTC作為空白對(duì)照。圖1顯示,所有物種的DNA均得到擴(kuò)增,且Ct值分別為26.0367、30.5951、25.4488、28.9239和35.2356,而NTC在50個(gè)循環(huán)內(nèi)沒有產(chǎn)生任何熒光信號(hào),說明了內(nèi)參引物的通用性。同時(shí),也證明了所有這些物種的乳制品都可以提取DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

圖1 內(nèi)參引物的熒光擴(kuò)增曲線Fig.1 Fluorescent amplification curves of reference primer

圖2 驢特異性引物的熒光擴(kuò)增曲線Fig.2 Fluorescent amplification curvesof donkey-specific primers

2.2 特異性引物的驗(yàn)證

利用牛奶、山羊奶、牦牛奶、駱駝奶和驢奶的DNA進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng),判斷基因的特異性。如圖2所示,僅驢奶的DNA得到了擴(kuò)增,Ct值為35.1474,而其他無(wú)關(guān)物種的DNA在50個(gè)循環(huán)內(nèi)沒有出現(xiàn)熒光信號(hào)。因此,該引物對(duì)目標(biāo)物種具有較高的特異性。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

根據(jù)驢奶含量(驢奶/總奶)與Ct值(特異/內(nèi)參基因)的線性關(guān)系,建立了一種標(biāo)準(zhǔn)化分析方法。由于內(nèi)參基因可以在驢、牛等哺乳動(dòng)物中恒定表達(dá),無(wú)論采用何種DNA提取方法,由提取方法造成的DNA濃度的差異都能隨著內(nèi)參基因的表達(dá)顯示不同的Ct值。而且,一般情況下,特異性基因和內(nèi)參基因的PCR擴(kuò)增效率會(huì)稍有差異,但通過以內(nèi)參基因?yàn)閷?duì)照的標(biāo)準(zhǔn)曲線可以消除不同的DNA提取方法、以及特異性基因和內(nèi)參基因的PCR擴(kuò)增效率產(chǎn)生的誤差。即以內(nèi)參基因作為對(duì)照,根據(jù)不同百分比含量的驢奶所建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線,能夠計(jì)算待檢樣品中驢奶的百分比含量,而非計(jì)算所含驢奶的具體毫升數(shù)。如圖3所示,當(dāng)驢奶含量在5%～100%的范圍內(nèi),決定系數(shù)(R2)達(dá)到0.9650,標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=-0.0023x+1.2288,表明了驢奶含量與Ct值之間具有良好的線性關(guān)系。該標(biāo)準(zhǔn)曲線不僅顯示了該方法的準(zhǔn)確度較高,同時(shí)表明了在可疑樣品中可以檢測(cè)出5%～100%的驢奶含量。

表2 模擬摻假樣品的計(jì)算Table 2 Calculation of the simulated adulterated milk mixtures

圖3 驢奶含量定量的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Normalized calibration curve forthe quantitation of the donkey milk content

2.4 模擬摻假樣品分析

對(duì)含有20%、50%和80%的驢奶的模擬摻假樣品進(jìn)行分析,通過提取DNA進(jìn)行擴(kuò)增,對(duì)得到的Ct值采用建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行計(jì)算,將計(jì)算的驢奶含量與實(shí)際的驢奶含量進(jìn)行對(duì)比。表2的結(jié)果顯示,模擬樣品的回收率為95%～120%,CV<10%,平均回收率為109.16%,平均CV值為4.68%,所有偏差結(jié)果均在10%的可接受范圍內(nèi)[24],證實(shí)了該方法的準(zhǔn)確性。

2.5 市售驢奶樣品分析

對(duì)購(gòu)買的來(lái)自山東濟(jì)南、寧夏吳忠、河南駐馬店、新疆烏魯木齊的驢奶樣品進(jìn)行分析。

表3 市售驢奶樣品的計(jì)算Table 3 Calculation of donkey milk samples for market

表3結(jié)果顯示,這些樣品中驢奶含量的計(jì)算結(jié)果均接近100%,表明目前市場(chǎng)上純驢奶的銷售具有一定的真實(shí)性。但鑒于這些驢奶的價(jià)格相對(duì)較高(約30～40元/250 mL),因此驢奶的品質(zhì)也會(huì)相對(duì)有保證。

3 結(jié)論

驢奶業(yè)屬于“朝陽(yáng)產(chǎn)業(yè)”,隨著其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值的逐漸開發(fā),驢奶有望得到更廣泛的應(yīng)用[25]。然而,目前市場(chǎng)上銷售的驢奶大多源于家庭作坊,且由于驢奶價(jià)格較為昂貴,存在一些不法商家為了牟取暴利而用價(jià)格較為低廉的牛奶對(duì)驢奶進(jìn)行摻假的可能性。在>5%的摻假含量才能獲得經(jīng)濟(jì)利益[17]的基礎(chǔ)上,需要建立一種能夠快速、靈敏地檢測(cè)驢奶含量的定量方法以確定其是否摻假及摻假比例。

本研究開發(fā)了一種標(biāo)準(zhǔn)化熒光定量PCR方法來(lái)定量檢測(cè)驢奶的含量。基于單拷貝核基因設(shè)計(jì)PCR引物,能夠控制因不同細(xì)胞中線粒體基因拷貝數(shù)不同帶來(lái)的誤差。同時(shí),以內(nèi)參基因?yàn)閷?duì)照,基于驢奶含量與Ct值的標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立能夠消除DNA提取率、PCR擴(kuò)增效率導(dǎo)致的誤差。通過該標(biāo)準(zhǔn)曲線(R2=0.9650),能夠在5%～100%范圍內(nèi)推斷驢奶的含量。最后,為了驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確性,對(duì)含20%、50%和80%的驢奶的模擬摻假樣品進(jìn)行分析,結(jié)果為平均回收率為109.16%,平均CV值為4.68%。綜上所述,這種熒光定量PCR方法能夠快速、靈敏地檢測(cè)混合奶制品中驢奶的含量,確定其是否摻假及摻假比例,為驢奶的市場(chǎng)監(jiān)督提供了技術(shù)支持。