核桃果實(shí)多酚活性及其分離純化研究進(jìn)展

鄭曉寧,李 俊,牟建樓,陳永浩,郝艷賓,齊建勛,董寧光,張赟齊

(1.北京市林業(yè)果樹(shù)科學(xué)研究院,北京 100093; 2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院,河北保定 071001; 3.北京市園林科學(xué)研究院綠化植物育種北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100102)

核桃(JuglansregiaL.)又名胡桃、羌桃,系胡桃科屬植物,是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)林樹(shù)種之一[1]。核桃果實(shí)由外層青果皮、內(nèi)層硬果殼、分心木、核桃仁以及核桃內(nèi)種皮5部分組成。核桃果實(shí)各部分含有大量多酚類(lèi)物質(zhì),有抗氧化、神經(jīng)保護(hù)、降脂、降糖、抗腫瘤及抑菌等多種生物活性[2],具有很高的潛在應(yīng)用價(jià)值。但由于核桃采后處理和深加工需要以及分離純化技術(shù)的限制,核桃多酚往往在處理過(guò)程中被廢棄,因此,核桃多酚產(chǎn)品目前尚不多見(jiàn)[3-5]。本文從核桃果實(shí)各部分的多酚組成、生物活性以及分離純化等方面進(jìn)行綜述,以期為核桃多酚的綜合利用和產(chǎn)業(yè)化制備提供理論依據(jù)。

表1 多酚類(lèi)化合物分類(lèi)及主要結(jié)構(gòu)特征Table 1 Classification and main structural characteristics of polyphenols

1 核桃果實(shí)多酚的含量和種類(lèi)分布

1.1 核桃果實(shí)多酚含量分布

核桃果實(shí)不同部位的多酚含量差別較大,多酚結(jié)果表示為毫克沒(méi)食子酸當(dāng)量/每克提取物(mg GAE/g)。有研究顯示，核桃內(nèi)種皮(490 mg/g)>核桃殼(68.34～200 mg/g)>核桃青皮(50.18～166.44 mg/g)[6]。另一項(xiàng)研究顯示核桃分心木和核桃內(nèi)種皮多酚含量明顯高于其他部位,結(jié)果表示為毫克沒(méi)食子酸當(dāng)量/每克樣品(mg/g),核桃分心木(53.89 mg/g)>核桃內(nèi)種皮(14.82 mg/g)>核桃青皮(4.05 mg/g)>核桃殼(0.84 mg/g)[7],兩者研究中多酚含量存在明顯差異,可能主要與核桃的品種有關(guān)。

1.2 核桃果實(shí)多酚種類(lèi)分布

依據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu),多酚包括黃酮類(lèi)化合物和非黃酮類(lèi)化合物兩大類(lèi),如表1所示[8-10]。核桃多酚中分離出20種多酚化合物,核桃中的酚類(lèi)物質(zhì)包括黃酮類(lèi)和非黃酮類(lèi)化合物,黃酮類(lèi)主要為黃酮醇和黃烷醇,非黃酮類(lèi)化合物主要包括水解單寧和酚酸。

1.2.1 核桃果實(shí)不同部位的單體酚種類(lèi) 核桃青皮中酚類(lèi)主要是黃酮類(lèi)化合物和胡桃醌[11-13]。胡桃醌是萘醌類(lèi)成分,結(jié)構(gòu)式如圖1所示。核桃殼約占核桃總重的67%,核桃殼中組分主要為黃酮類(lèi)成分,為蘆丁、槲皮苷、異槲皮苷[14]。核桃內(nèi)種皮多酚以酚酸類(lèi)為主,分別為沒(méi)食子酸、焦性沒(méi)食子酸、對(duì)羧基苯甲酸、咖啡酸和對(duì)羥基肉桂酸等。但核桃內(nèi)種皮游離酚酸所占比例不超過(guò)種皮質(zhì)量的3%,這和總酚含量占種皮質(zhì)量30%差別很大,表明酚酸大多以結(jié)合態(tài)存在,需要通過(guò)特殊處理將酚酸基團(tuán)游離出來(lái)再進(jìn)行測(cè)定[15]。核桃分心木中多酚含量豐富,Liu等[16]在分心木中鑒定出200多種化合物,包括可水解單寧、酚酸和黃酮類(lèi),對(duì)21種多酚定量分析,主要為鞣花酸、沒(méi)食子酸、原兒茶酸、兒茶素、槲皮苷、紫杉葉素、槲皮素等,其中鞣花酸含量最高。核桃仁中的多酚主要是酚酸類(lèi)及少量黃酮類(lèi)物質(zhì),其中鞣花酸含量較為豐富[17]。

圖1 胡桃醌的結(jié)構(gòu)Fig.1 Structure of juglone

表2 核桃果實(shí)各部分單體酚含量(mg/100 g)Table 2 Content of monophenols in different parts of walnut fruit(mg/100 g)

1.2.2 核桃不同部位的單體酚含量 核桃果實(shí)不同部位的單體酚不僅在種類(lèi)上有差異,其含量也有較大差別。核桃果實(shí)各部位分布的常見(jiàn)單體酚及其含量如表2所示。由表2可見(jiàn),沒(méi)食子酸普遍存在于核桃果實(shí)的各個(gè)部位,綠原酸、阿魏酸、咖啡酸和蘆丁等也是核桃果實(shí)各部位分布較多的單體酚類(lèi)。其中,核桃青皮中胡桃醌的含量最高,含量達(dá)291.70～345.54 mg/100 g,其次為蘆丁、沒(méi)食子酸和阿魏酸等。核桃硬殼中槲皮苷含量最高,其次為異槲皮苷、蘆丁和沒(méi)食子酸,但含量差異不大,在6～20 mg/100 g之間。核桃分心木中鞣花酸含量最高,但因測(cè)試品種不同,與槲皮苷、兒茶素、等單體酚一樣,含量變化范圍較大。核桃內(nèi)種皮中蘆丁含量最高,最高可達(dá)1292.91 mg/100 g,其次為丁香酸、沒(méi)食子酸和綠原酸。核桃仁中鞣花酸含量最高,最高可達(dá)70.47 mg/100 g,其次為丁香酸、沒(méi)食子酸和兒茶素。從單體酚總量來(lái)看,核桃內(nèi)種皮的單體酚總含量最高。

2 核桃果實(shí)多酚的生物活性

多酚作為一種重要的生物活性物質(zhì),在食品、制藥等領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用。核桃果實(shí)多酚具有抗氧化、抗癌、抑菌、增強(qiáng)記憶、提高免疫、減肥和抑制黑色素生成等活性,且其不同部位的多酚活性與多酚的含量密切相關(guān)。

2.1 抗氧化活性

2.1.1 體外抗氧化活性

2.1.1.1 化學(xué)方法評(píng)價(jià) 植物中總酚含量與抗氧化活性具有正相關(guān)性[23],核桃果實(shí)多酚抗氧化活性主要表現(xiàn)為清除體內(nèi)自由基[24]。周曄[15]利用DPPH、ABTS、鐵還原法研究核桃種皮多酚含量與活性之間的相關(guān)性,結(jié)果顯示抗氧化活性與總酚含量之間呈正相關(guān),相關(guān)系數(shù)分別為0.9092、0.9184、0.8973。劉麗金[25]對(duì)核桃果實(shí)不同部位總酚酸進(jìn)行含量測(cè)定及體內(nèi)外抗氧化活性研究,得出多酚含量由多到少順序?yàn)楹颂覂?nèi)種皮>核桃分心木>核桃青皮>核桃硬殼,核桃內(nèi)種皮多酚含量最高,其抗氧化效果也優(yōu)于其他部分。此外,核桃果實(shí)多酚的抗氧化作用可以延長(zhǎng)油脂的貯藏期,如山核桃果皮醇提物能夠有效延緩花生油和菜籽油過(guò)氧化值和酸價(jià)的上升,從而延長(zhǎng)油脂貨架期[26]。

2.1.1.2 細(xì)胞學(xué)方法評(píng)價(jià) 核桃果實(shí)多酚較多采用化學(xué)分析法來(lái)分析抗氧化性,細(xì)胞水平和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中的相關(guān)研究較少。細(xì)胞分析法可以觀察抗氧化物質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的吸收和代謝情況,具有生物相關(guān)性。較大濃度的粗提物在小腦顆粒神經(jīng)元(CGNs)中顯示出細(xì)胞毒活性,核桃仁提取物和核桃殼提取物的半有效細(xì)胞毒性濃度(EC50)分別為4.6和1.8 mg/mL,殼提取物具有更大的細(xì)胞毒性作用。將CGNs與H2O2(0.35 μmol/L)孵育,會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞活力降低60%;隨著核桃仁提取物濃度增加(0.01～0.2 mg/mL),CGNs細(xì)胞生存率增加,核桃仁提取物濃度為0.2 mg/mL時(shí)可將GGNs細(xì)胞活力維持在93%±4%,表明核桃仁提取物(0.2 mg/mL)可以保護(hù)H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡[27]。

2.1.2 體內(nèi)抗氧化活性 生物體內(nèi)大分子的氧化反應(yīng)是一個(gè)錯(cuò)綜復(fù)雜的過(guò)程,由于體內(nèi)外環(huán)境存在較大差異,食物及藥物進(jìn)入到機(jī)體內(nèi)需經(jīng)過(guò)一系列復(fù)雜過(guò)程和反應(yīng)才能最終發(fā)揮作用。因此,進(jìn)行體內(nèi)抗氧化是必要的實(shí)驗(yàn),體內(nèi)抗氧化活性研究主要采用小鼠實(shí)驗(yàn),張澤生等[28]研究表明,核桃內(nèi)種皮多酚提取物可減輕D-半乳糖誘導(dǎo)的小鼠氧化損傷,提高小鼠血清、肝臟、腦組織中超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)活性,表現(xiàn)出良好的體內(nèi)抗氧化活性。

2.2 抗癌活性

植物多酚的抗癌活性主要表現(xiàn)在抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡及細(xì)胞因子的產(chǎn)生。植物多酚的抗癌活性與單體酚存在相關(guān)性,例如鞣花酸已被體外、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明具有對(duì)結(jié)腸直腸癌、肝癌、肺癌等的抗增殖作用[29]。核桃提取物中的抗癌活性與胡桃醌、槲皮苷有關(guān)。核桃青皮提取物中的胡桃醌對(duì)人早幼粒細(xì)胞白血病(HL-60)細(xì)胞可產(chǎn)生抗增殖作用,這與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的早期階段有關(guān),當(dāng)純胡桃醌和核桃青皮提取物濃度為1 μmol/L,HL-60細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制,對(duì)健康的成纖維細(xì)胞無(wú)毒性;而在較高濃度10 μmol/L下,HL-60細(xì)胞和健康細(xì)胞的存活率下降,說(shuō)明高濃度的提取物對(duì)細(xì)胞具有毒性,但胡桃醌對(duì)HL-60細(xì)胞凋亡的機(jī)理尚不清楚[30]。核桃分心木的乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物對(duì)癌細(xì)胞的抑制作用最強(qiáng),且凋亡率較高,表明體外抗腫瘤活性的機(jī)制可能是通過(guò)對(duì)細(xì)胞的抗增殖活性誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)的,此外,在核桃分心木的正丁醇部位分離出槲皮苷,該成分具有抗腫瘤活性,槲皮苷可通過(guò)抗癌細(xì)胞的抗增殖達(dá)到抗腫瘤效果[31-32]。

2.3 抑菌活性

核桃多酚對(duì)細(xì)菌和真菌抑制能力不同,可能與核桃品種和提取所用溶劑有關(guān)。核桃多酚的抑菌活性為其在食品保鮮中的應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

2.3.1 對(duì)細(xì)菌的抑制作用 多酚的抑菌能力與黃酮化合物有關(guān),黃酮分子中C4=O和C5-OH、C7-OH是抗菌活性的首要基團(tuán),C3-OH基團(tuán)也具有一定抗菌活性[33]。核桃青皮提取物對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌抑菌效果更好,Oliveira等[34]對(duì)葡萄牙種植的核桃青皮水提物多酚的抗菌活性進(jìn)行研究,表明金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度為0.1 mg/mL,抑菌能力為金黃色葡萄球菌>蠟樣芽孢桿菌>枯草芽孢桿菌,而在濃度100 mg/mL時(shí),對(duì)大腸桿菌、肺炎克雷伯桿菌等革蘭氏陰性菌和白色念珠菌、新生隱球菌等真菌均無(wú)抑制活性。唐春麗等[35]將核桃青皮乙醇提取物和胡桃醌(0.3 mg/mL)進(jìn)行微生物生長(zhǎng)抑制測(cè)定,兩者對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌抑菌圈和銅綠假單胞菌均有抑制作用,且核桃青皮提取物的抑制效果優(yōu)于胡桃醌。

2.3.2 對(duì)真菌抑制作用 核桃多酚的抗菌活性主要來(lái)源于胡桃醌[36]。核桃青皮提取物表現(xiàn)一定的抗真菌能力,如王剛霞[37]研究了核桃青皮中胡桃醌的提取,將提取物制成不同濃度的溶液,隨著濃度增加,對(duì)真菌的抑制作用增強(qiáng),抑菌效果與胡桃醌含量呈正相關(guān),當(dāng)核桃青皮提取物濃度為20 mg/mL時(shí),匍枝根霉、青霉菌、灰葡萄孢、鐮刀菌、交鏈孢屬菌絲生長(zhǎng)抑制率可分別達(dá)到88.14%、92.07%、90.61%、91.99% 和91.71%,本文未對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品胡桃醌對(duì)5種真菌的抑制率進(jìn)行測(cè)定,且抗菌性可能為核桃青皮提取物其他成分的協(xié)同作用。許紫峻等[38]研究核桃青皮提取物對(duì)霉菌的作用,結(jié)果顯示70%乙醇提取物抑菌效果最強(qiáng),將此取物配成1%提取液時(shí),抑菌圈直徑可達(dá)(23.6±0.3)mm;當(dāng)核桃青皮提取物濃度為1%～10%時(shí),抑菌率可達(dá)29%～62.4%。

2.4 增強(qiáng)記憶

核桃仁富含不飽和脂肪酸、蛋白質(zhì)、多酚和礦物質(zhì),因此被認(rèn)為是一種營(yíng)養(yǎng)豐富的“健腦食品”[39]。核桃仁種皮多酚可能在核桃仁增強(qiáng)記憶和認(rèn)知功能方面發(fā)揮重要作用。史丹丹[40]研究了核桃仁種皮多酚對(duì)高膽固醇血癥小鼠記憶功能的影響,發(fā)現(xiàn)與高脂膳食組相比,多酚組的小鼠在迷宮實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出更好的記憶能力,且小鼠的血清內(nèi)脂質(zhì)水平降低、大腦中氧化應(yīng)激反應(yīng)減少,這可能是因?yàn)楹颂覂?nèi)種皮多酚通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)的抗氧化水平來(lái)改善小鼠的記憶能力。

2.5 提高免疫

植物多酚可以增強(qiáng)免疫力。Liu等[41]研究了核桃多酚提取物(WPE)對(duì)體外殺螟硫磷(FNT)誘導(dǎo)的脾淋巴細(xì)胞免疫毒性的影響,表明WPE通過(guò)抑制氧化應(yīng)激來(lái)保護(hù)脾淋巴細(xì)胞免受FNT誘導(dǎo)的免疫毒性并改善免疫功能。核桃仁提取物可緩解4-戊基苯酚(PP)和3-甲基-4-硝基苯配(PNMC)誘導(dǎo)的脾淋巴細(xì)胞的免疫毒性,其機(jī)制是通過(guò)抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng),減少ROS(活性氧)的產(chǎn)生,提高抗氧化酶的活性,恢復(fù)細(xì)胞內(nèi)的抗氧化水平,減弱PP和PNMC引起的脾淋巴細(xì)胞的氧化損傷[42]。核桃內(nèi)種皮多酚可提高小鼠機(jī)體的免疫活性,表現(xiàn)為增加臟器指數(shù)、增強(qiáng)淋巴細(xì)胞的增殖率、維持免疫抑制小鼠的血液平衡、增加免疫抑制小鼠的免疫球蛋白含量、增強(qiáng)乳酸脫氫酶(LDH)和酸性磷酸酶(ACP)的活力[43]。

2.6 減肥

核桃青皮和內(nèi)種皮中的多酚具有一定的減肥作用。胰脂肪酶是一個(gè)重要的脂肪酶,可將50%～70%的食物脂肪水解為甘油二酯、單甘油酯、甘油和脂肪酸被人體吸收[44],因此抑制胰脂肪酶活性是預(yù)防肥胖的有效途徑之一。史丹丹[40]對(duì)肥胖小鼠灌胃核桃內(nèi)種皮多酚,發(fā)現(xiàn)核桃內(nèi)種皮多酚可以使小鼠體重、肝臟指數(shù)、脂質(zhì)水平降低,且隨著多酚濃度(50～350)μg/mL的增加,胰脂肪酶活性抑制率增加,當(dāng)多酚濃度為300 μg/mL時(shí),胰脂肪酶活性抑制率達(dá)到75.36%,為核桃多酚治療肥胖提供參考。肥胖與腸道菌群密切相關(guān)[45],研究發(fā)現(xiàn)高脂肪膳食組增加了厚壁菌門(mén)相對(duì)豐度,減少了擬捍門(mén)菌相對(duì)豐度,而核桃青皮提取物組卻相反。另外,高脂肪膳食組改變了腸道菌群結(jié)構(gòu),降低了細(xì)菌多樣性,而青皮提取物組可通過(guò)調(diào)節(jié)腸道菌群來(lái)降低小鼠的體重增加和脂肪堆積[46]。

2.7 抑制黑色素生成

在黑色素細(xì)胞內(nèi),酪氨酸在酪氨酸酶作用下逐漸被氧化為多巴和多巴醌,經(jīng)重排與一系列代謝過(guò)程聚合為5,6-二羥基吲哚、吲哚醌,最終形成黑色素。多酚可作為酪氨酸酶的底物類(lèi)似物,可與游離酶結(jié)合,抑制黑色素生成。B16黑色素瘤細(xì)胞是一種篩選黑色素合成的腫瘤細(xì)胞,結(jié)構(gòu)與人體黑色素的結(jié)構(gòu)相似[47]。朱亞新[48]以沒(méi)食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品,制備的核桃內(nèi)種皮多酚為43.2%,對(duì)酪氨酸酶的半抑制濃度(IC50)為3.74 mg/mL,核桃內(nèi)種皮提物濃度為20 mg/mL,基本完全抑制酪氨酸酶的活性,這可能與多酚的純度有關(guān)[49-50]。此外,以B16黑色素瘤細(xì)胞為受試細(xì)胞,研究核桃提取物對(duì)黑色素形成的影響,結(jié)果表明核桃青皮、核桃殼與核桃種皮多酚提取物對(duì)黑色素合成均有一定抑制效果,其中核桃種皮提取物對(duì)黑色素合成的抑制效果最強(qiáng),這主要通過(guò)抑制酪氨酸酶活性降低黑色素的合成量。

3 核桃果實(shí)多酚的分離與純化

核桃多酚的提取主要是有機(jī)溶劑提取法,可結(jié)合超聲輔助提取或微波輔助提取,純化多采用大孔吸附樹(shù)脂法。

表3 核桃多酚提取方法對(duì)比Table 3 Comparison of extraction methods of walnut polyphenols

3.1 核桃果實(shí)多酚的提取分離

3.1.1 前處理方式對(duì)核桃果實(shí)多酚提取率的影響 核桃青皮、殼、分心木等原料的獲取方式一般不會(huì)對(duì)多酚的分離提取帶來(lái)影響,但核桃內(nèi)種皮由于加工、收集方式的不同,對(duì)多酚的分離提取影響較大。濕法去種皮包括水浸洗法、鹽液浸漬法、堿液浸泡等方法,多酚損失較為明顯。如趙聰[51]將鹽液浸漬法和堿液法獲得的種皮進(jìn)行多酚提取,總多酚得率分別僅為1.532%和0.426%。另外,周曄[15]比較了水泡法和液氮法獲得的核桃內(nèi)種皮,兩者多酚得率分別為17%和28%。烘烤法去除核桃內(nèi)種皮,容易造成多酚結(jié)構(gòu)破壞,康瑋麗等[52]采用熱風(fēng)烘烤-微波聯(lián)用,核桃仁脫皮率達(dá)到98.01%,未對(duì)多酚含量進(jìn)行測(cè)定,但是130 ℃的烘烤溫度容易使得多酚損失[53]。凍融法需要較長(zhǎng)時(shí)間凍結(jié),融化時(shí)部分難去除的種皮仍需反復(fù)凍結(jié)。魯墨森等[54]采用低溫冷凍,升溫融化的方法去除核桃內(nèi)種皮,當(dāng)冰柜溫度為-10 ℃,冰衣形成需要12 h,此種方法的工藝參數(shù)及對(duì)種皮多酚的影響還需探討。結(jié)合核桃加工技術(shù),在高效獲取核桃內(nèi)種皮的同時(shí)減少多酚的損失和破壞,成為亟待解決的問(wèn)題。

3.1.2 核桃果實(shí)多酚提取方法

3.1.2.1 傳統(tǒng)溶劑提取法 溶劑浸提法一般以一定濃度的乙醇為提取劑,采用水浴或索氏抽提對(duì)多酚進(jìn)行提取,影響因素一般是溫度、時(shí)間、料液比、溶劑濃度等。該方法提取核桃果實(shí)多酚可操作性強(qiáng),但提取率偏低。張春梅等[55]提取核桃內(nèi)種皮多酚,在乙醇體積分?jǐn)?shù)45%、液固比60∶1 (mL∶g)、提取溫度70 ℃、提取時(shí)間60 min,多酚得率為25.05%。趙國(guó)建等[56]對(duì)核桃青皮多酚提取進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)添加EDTA有助于多酚的溶解,在液料比17∶1,EDTA添加量0.3%,在45 ℃水浴條件下提取90 min,核桃青皮多酚提取率最高,以沒(méi)食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品,多酚含量達(dá)到26.09 mg/g。

3.1.2.2 超聲輔助溶劑浸提法 相對(duì)于常規(guī)的溶劑浸提法,超聲輔助提取是在有機(jī)溶劑提取的基礎(chǔ)上增加了超聲波處理,以提高多酚得率。張旭等[57]采用超聲輔助法提取核桃青皮渣中的多酚,多酚得率為5.52%。周曄[15]優(yōu)化出核桃內(nèi)種皮中酚類(lèi)物質(zhì)的超聲波輔助提取(固定功率100 W)的最佳工藝條件:提取溫度53 ℃,提取時(shí)間55 min,液固比58∶1 (mL∶g),所得多酚提取率為30.79%。采用超聲輔助對(duì)核桃分心木多酚提取,1 g分心木中可得到多酚物質(zhì)為56.46 mg GAE(沒(méi)食子酸當(dāng)量)[58]。超聲的振化和空化作用可以使細(xì)胞破裂,進(jìn)而加速溶劑進(jìn)入細(xì)胞,使多酚在溶劑中的溶解度增加,有效成份的純度得以提高。

3.1.2.3 微波輔助溶劑浸提法 同溶劑浸提法相比,微波輔助提取是在有機(jī)溶劑提取的基礎(chǔ)上增加了微波處理以提高多酚得率。微波穿透力強(qiáng)、能耗低、設(shè)備簡(jiǎn)單,但微波提取時(shí)原料溫度內(nèi)外不均勻,易造成多酚損失。高磊[59]采用微波輔助提取核桃青皮中多酚,確定最佳工藝為:微波功率200 W,料液比1∶20,乙醇體積分?jǐn)?shù)65%,微波時(shí)間70 min,提取溫度60 ℃,多酚提取量為6.32 mg/g。此方法低于超聲輔助提取法和EDTA助劑提取法,但比溶劑浸提法獲得的多酚含量高,表明微波法雖然提高了多酚得率,但也造成了部分多酚的損失。螯合劑的添加會(huì)使得多酚得率提高,如張春媛[60]運(yùn)用螯合劑與微波雙輔助法提取核桃青皮中多酚,通過(guò)螯合劑螯合提取液中與多酚結(jié)合的金屬離子,從而使多酚溶解在提取液中來(lái)增加多酚提取率,在微波功率830 W,時(shí)間7.4 min,六偏磷酸鈉0.22%時(shí),提取率為4.12%,相比只采用微波法提取率有所提高。

3.1.2.4 酶法復(fù)合超聲輔助法 酶法復(fù)合超聲輔助法可使多酚得率明顯提高,但酶的成本和反應(yīng)條件限制了該法的廣泛使用,因此仍處在實(shí)驗(yàn)室階段。伏慧慧等[61]采用酶法-超聲輔助連續(xù)工藝提取核桃青皮中的多酚,先進(jìn)行酶解處理,然后采用超聲輔助提取,多酚提取率可達(dá)61.36%。

3.1.2.5 亞臨界提取法 亞臨界水提取更適用于核桃殼中有用成分的提取。張曉倩[62]對(duì)核桃殼中多酚的提取開(kāi)展了研究,亞臨界水提取物中多酚得率在120、140、160 ℃時(shí)低于有機(jī)溶劑法,但在180、200、220 ℃時(shí)多酚得率高于有機(jī)溶劑提取物,220 ℃總酚得率最高,為0.14 mg/g,有機(jī)溶劑法總酚得率為0.09 mg/g。此外,亞臨界提取物中的總糖、蛋白質(zhì)和干物質(zhì)得率在每個(gè)溫度下均高于有機(jī)溶劑法。

3.2 核桃果實(shí)多酚的純化

3.2.1 大孔樹(shù)脂純化 大孔樹(shù)脂具有選擇性吸附、吸附容量大、吸附速度快、解吸附率高及分離效果好等優(yōu)點(diǎn),適合用于工業(yè)化生產(chǎn),也是近年來(lái)使用較為廣泛的純化方法,在蘋(píng)果多酚、獼猴桃皮渣多酚、草莓多酚的純化中均有應(yīng)用[63-65]。

核桃內(nèi)種皮和核桃青皮中多酚的純化應(yīng)用了樹(shù)脂吸附。影響大孔樹(shù)脂吸附和洗脫的因素主要有樹(shù)脂的特性、被分離化合物的特性、上樣條件、洗脫條件。不同植物多酚在進(jìn)行純化時(shí)選擇的樹(shù)脂種類(lèi)不同,在核桃多酚的純化中采用X-5、AB-8樹(shù)脂較多。張春梅等[66]通過(guò)靜態(tài)吸附-洗脫試驗(yàn)篩選X-5型樹(shù)脂,研究了上樣液質(zhì)量濃度、上樣量、吸附流速、洗脫液濃度和用量對(duì)核桃內(nèi)種皮多酚純度的影響,多酚純度從64.52% 提高至79.64%,純度僅提高了15%,表明X-5適用于多酚的初步純化。Zhu等[67]對(duì)去除核桃內(nèi)種皮的廢水中黃酮類(lèi)物質(zhì)富集純化,選用AB-8樹(shù)脂進(jìn)行試驗(yàn),對(duì)動(dòng)態(tài)吸附試驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化,發(fā)現(xiàn)黃酮類(lèi)化合物的回收率和純度分別為81.73%和61.35%,表明AB-8樹(shù)脂具有很好的從核仁膜廢水中富集黃酮類(lèi)化合物的能力。張旭等[68]對(duì)核桃青皮中多酚的純化工藝進(jìn)行優(yōu)化,選取AB-8型樹(shù)脂,從動(dòng)態(tài)吸附-解吸角度考察多酚質(zhì)量濃度、體積流速、洗脫液體積分?jǐn)?shù)等對(duì)多酚純化工藝的影響,多酚純度由9.26%提高到52.59%。

3.2.2 高效液相色譜純化 高效液相色譜法制備的多酚純度高,有人采用高速逆流色譜法與制備型高效液相色譜聯(lián)用,從獼猴桃中分離出純度90%以上的多酚單體[69]。此純化方法可以得到高純度的多酚,但成本高,不適合工業(yè)化生產(chǎn),主要用于多酚的定性、定量分析,在核桃分心木、內(nèi)種皮、核桃仁中也有應(yīng)用。Wang等[70]采用高速逆流色譜法與高效液相色譜法從核桃分心木中分離出14種化合物,為沒(méi)食子酸、原兒茶酸、香草酸和二氫槲皮素等7種酚類(lèi)化合物,其中去氫催吐羅芙木醇、(6R,9R)-9-hydroxymegastigman-4-en-3-one、(6R,9S)-9-hydroxymegastigman-4-en-3-one是首次從胡桃屬中分離的,blumenol B、槲皮苷、(4S)-4-羥基-1四氫萘酮是首次從核桃分心木中分離得到。核桃仁中也分離出20種化合物,其中為鞣花單寧、沒(méi)食子酸和兒茶素等13種多酚化合物[71]。王克建等[72]對(duì)紅色核桃內(nèi)種皮中提取物進(jìn)行了分析,其中含有鞣花酸、鞣花?；咸烟?、沒(méi)食子?；?鞣花?；咸烟?、二鞣花?；咸烟?、二沒(méi)食子酰基-鞣花?；咸烟呛枉坊；?橡椀?；咸烟堑洒坊▎螌?。Yang等[73]采用柱層析與高效液相色譜法在核桃青皮中分離出5種未知二芳基庚烷化合物的成分和12種已知的二芳基庚烷,采用核磁共振和HR-ESI-MS對(duì)5種未知成份結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定。

4 核桃果實(shí)多酚研究存在的問(wèn)題與展望

核桃果實(shí)中存在大量具有良好生物活性的多酚類(lèi)物質(zhì),但在核桃加工過(guò)程中,核桃青皮、核桃分心木、核桃內(nèi)種皮等成為廢棄物,多酚也隨之損失。盡管核桃果實(shí)多酚的生物活性高,原料來(lái)源成本低,但核桃多酚產(chǎn)品尚不多見(jiàn)。這主要與核桃加工方式不利于核桃多酚的保留和分離、核桃多酚分離純化方法不夠成熟等因素有關(guān)。近年來(lái),我國(guó)核桃產(chǎn)量迅速增加,為核桃果實(shí)多酚的制備和產(chǎn)品開(kāi)發(fā)提供了充足的原料來(lái)源和市場(chǎng)條件。因此,將核桃果實(shí)多酚應(yīng)用在保健食品、日化產(chǎn)品及藥品中開(kāi)發(fā)具有高功能活性的核桃果實(shí)多酚產(chǎn)品,具有一定的市場(chǎng)前景。

核桃果實(shí)多酚的研究熱點(diǎn)將主要集中在:生物活性研究方面。進(jìn)一步探討單體酚和多酚混合物生物活性差異,通過(guò)體外試驗(yàn)、動(dòng)物細(xì)胞試驗(yàn)和臨床試驗(yàn)明確來(lái)自核桃果實(shí)不同部位多酚的生物活性,為開(kāi)發(fā)相應(yīng)的功能產(chǎn)品提供理論基礎(chǔ)，分離純化技術(shù)方面,一方面,通過(guò)結(jié)合核桃加工方式的改進(jìn),從核桃果實(shí)多酚原料收集入手,通過(guò)探索常溫、干法加工技術(shù),避免核桃果實(shí)多酚在原料來(lái)源階段受到損失和結(jié)構(gòu)破壞，另一方面,通過(guò)分離、純化新技術(shù)的引進(jìn),探索提高核桃果實(shí)多酚得率和純度,綠色、安全,適宜產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的新技術(shù)、新工藝,將成為重要的研究方向。