陳英之，李良波，甘鳳瓊，黃榮韶

（1. 廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院，廣西 南寧 530004 ；2. 廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，廣西 南寧 530200）

林藥種植是根據(jù)林下不同環(huán)境條件，將適宜林下生長(zhǎng)的藥用植物重新引種到林下進(jìn)行半野生化栽培[1]。五指毛桃為?？崎艑僦参锎秩~榕（Ficus hirtaVahl），入藥部分為其地下根莖，是地道的民族藥材，被《中華人民共和國(guó)藥典》1977 版收載[2]。補(bǔ)骨脂素為五指毛桃質(zhì)量評(píng)價(jià)的主要指標(biāo)成分[4-6]，佛手柑內(nèi)酯為次要指標(biāo)成分[8]。補(bǔ)骨脂素具有抗血凝、擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈、降壓、止咳、抑制腫瘤、防御紫外線損傷、免疫調(diào)節(jié)等作用[8-9]。五指毛桃具有健脾補(bǔ)肺、舒筋化濕之功效，對(duì)脾虛浮腫、盜汗、肺癆咳嗽、風(fēng)濕痹痛、肝硬化腹水、慢性支氣管炎和產(chǎn)后無(wú)乳等癥有特殊療效[2-3]。目前,五指毛桃人工種植比較少，藥材來(lái)源主要依靠野生資源。近年來(lái)，隨著五指毛桃需求量的增加，市場(chǎng)供不應(yīng)求，致使五指毛桃遭到掠奪式的采挖，野生資源日漸枯竭，給環(huán)境和資源造成巨大壓力。馬尾松（Pinus massoniana）是廣西分布面積最大的造林樹(shù)種，面積達(dá)231.6 萬(wàn)hm2。成齡的馬尾松樹(shù)林具有一定的蔭蔽度，適合耐陰植物生長(zhǎng)。五指毛桃為小喬木，多生于海拔500 ～1 000 m 的灌叢山谷、林緣、疏林或村寨附近濕潤(rùn)溫暖之地[10]。五指毛桃具有一定的耐陰性，從生態(tài)角度來(lái)看五指毛桃適合在成齡馬尾松林生長(zhǎng)。

林藥種植充分利用林地資源，多層次立體結(jié)構(gòu)能夠提高光能利用率和空間利用率，同時(shí)還能提高土壤肥力，改良土壤理化性質(zhì)，改善生態(tài)環(huán)境，達(dá)到良性循環(huán)[11-12]。倪樂(lè)[13]研究了不同樹(shù)種套種模式對(duì)雷公藤甲素含量動(dòng)態(tài)變化、林地土壤養(yǎng)分變化等，認(rèn)為厚樸林下套種雷公藤模式可以增加雷公藤根和葉中的雷公藤甲素含量，厚樸林下套種雷公藤可以提高林地土壤的全氮含量。李娟等[14]在橡膠林下間作五指毛桃，科學(xué)合理施肥，既有利于五指毛桃的生長(zhǎng)發(fā)育，又有利于橡膠樹(shù)膠乳產(chǎn)量的增加。目前，關(guān)于林下種植五指毛桃的研究比較少，馬尾松林下種植五指毛桃的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。筆者對(duì)馬尾松林下不同生長(zhǎng)年限五指毛桃的生長(zhǎng)表現(xiàn)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，并對(duì)不同年份的五指毛桃主要活性成分含量進(jìn)行分析，為馬尾松林下規(guī)?；N植五指毛桃的最佳采收時(shí)期提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)地安排在南寧市邕寧區(qū)那樓鎮(zhèn)廣澤健康產(chǎn)業(yè)種植基地，屬天然馬尾松林地，地處亞熱帶季風(fēng)區(qū)，東經(jīng)108°35'，北緯22°38'，海拔高度不足100 m，日照充足，雨量充沛，年平均氣溫21.8℃，年平均降水量1 472.1 mm，無(wú)霜期長(zhǎng)，雨季多集中于4—9 月。試驗(yàn)地屬于丘陵山地，山體坡度約為25°，土壤以紅壤為主，土層深厚，肥沃, 腐殖質(zhì)含量較豐富。

1.2 試驗(yàn)材料

1.2.1 供試種苗供試種苗購(gòu)置于廣西靈山縣伯勞鎮(zhèn)遠(yuǎn)豐苗木基地，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)黃榮韶教授鑒定，確認(rèn)為五指毛桃（Ficus hirtaVahl）。

1.2.2 儀器及設(shè)備e2695 高效液相色譜（waters）、KQ-500DE 超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）、色 譜 柱（waters Symmetry C18，4.6×250 mm，5 μm）、Milli-Q 超純水制備儀（美國(guó)Millipore 公司）、SHZ-D Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵（上海力辰邦西儀器科技有限公司）、Basis Hei-VAP HL 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（Heidolph）、游標(biāo)卡尺（上海精美量具廠）、 BSA224SCW 分析天平（德國(guó)Sartorius）、DHG-9240A 烘箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）、卷尺等。

1.2.3 試 劑標(biāo)準(zhǔn)品補(bǔ)骨脂素（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)110739-201918，純度為99.60%），標(biāo)準(zhǔn)品佛手柑內(nèi)酯（中國(guó)科學(xué)院成都生物研究所/成都曼斯特生物科技有限公司，批號(hào)19063003，純度為99.37%），水為超純水，其他試劑均為分析純 。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

五指毛桃于2016—2019 年每年3 月在基地內(nèi)劃區(qū)種植，離松樹(shù)2 m，種植密度為60 cm×60 cm，深15 cm×寬25 cm 開(kāi)穴，以充分腐熟的廄肥2 kg 作基肥，與細(xì)土混勻施入穴內(nèi)。種植區(qū)域生態(tài)環(huán)境基本一致，移栽時(shí)種苗大小一致，管理方法一致，2020 年2月測(cè)量生長(zhǎng)狀況及補(bǔ)骨脂素和佛手柑內(nèi)酯含量（移栽時(shí)的小苗作為CK）。

1.4 考察指標(biāo)及方法

1.4.1 植物學(xué)性狀測(cè)定主要測(cè)定馬尾松樹(shù)林下種植1～4 a 的五指毛桃的株高、基徑、側(cè)根數(shù)、根長(zhǎng)、最大根徑、地上部鮮（干）重，地下部鮮（干）重等指標(biāo)。其中，地上部干重和地下部干重的測(cè)定：將鮮樣置于105℃烘箱里殺青30 min 后，轉(zhuǎn)到55℃下烘至恒重后稱量。每個(gè)生長(zhǎng)年限選10 株大小均勻，根、莖、葉齊備的五指毛桃進(jìn)行測(cè)量，取平均值。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 和SPSS 軟件進(jìn)行分析。

1.4.2 化學(xué)成分含量測(cè)定將五指毛桃根系樣品烘干后粉粹過(guò)40 mm 篩，用高效液相色譜法檢測(cè)不同生長(zhǎng)年限樣品補(bǔ)骨脂素和佛手柑內(nèi)酯的含量。（1）標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備。精密稱取補(bǔ)骨脂素標(biāo)準(zhǔn)品17.75 mg，佛手柑內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)品3.7 mg，加甲醇超聲使其溶解，分別制成1.775 mg/mL 的補(bǔ)骨脂素和0.37 mg/mL 的佛手柑內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)品溶液，0.45 μm 濾膜過(guò)濾。（2）樣品溶液的制備。取五指毛桃粉末0.5 g，精密稱定，置于50 mL 具塞錐形瓶中，精密量取10 mL 甲醇，超聲波提取30 min，定容至10 mL，0.45 μm 濾膜過(guò)濾。（3）檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇。取補(bǔ)骨脂素和佛手柑內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)品溶液通過(guò)紫外全波長(zhǎng)掃描，根據(jù)最大吸收峰確定適宜的檢測(cè)波長(zhǎng)。（4）其他色譜條件。色譜柱為waters Symmetry C18( 4.6 mm ×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相為甲醇-水（60 ∶40）；流速1.0 mL/min，柱溫35℃，進(jìn)樣量10 μL。（5）標(biāo)準(zhǔn)曲線制備。精密稱取補(bǔ)骨脂素標(biāo)準(zhǔn)品和佛手柑內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)品溶液，用流動(dòng)相溶液進(jìn)行稀釋，分別制備濃度梯度為1.775、3.55、7.1、14.2、28.4、56.8 mg/L 的補(bǔ)骨脂素標(biāo)準(zhǔn)品溶液和濃度梯度為0.37、0.74、1.48、2.96、5.92、11.84 mg/L 的佛手柑內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)品溶液，在試驗(yàn)確定的色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)液濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。（6）樣品的穩(wěn)定性。樣品制備后，分別于0、1、2、4、8、12 h 取樣測(cè)定，考察樣品的穩(wěn)定性。（7）檢測(cè)方法驗(yàn)證。精密吸取標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按照試驗(yàn)確定的方法進(jìn)行檢測(cè)，取相同濃度標(biāo)準(zhǔn)品重復(fù)測(cè)定5 次，以驗(yàn)證方法的精密度；精密稱取同批次五指毛桃樣品5 份，制備待測(cè)樣品溶液，分別測(cè)定補(bǔ)骨脂素和佛手柑內(nèi)酯的含量，以驗(yàn)證方法的重復(fù)性；精密稱取同批次五指毛桃樣品5 份，精密加入補(bǔ)骨脂素（0.887 5 mg/mL）和佛手柑內(nèi)酯（0.187 5 mg/mL）標(biāo)準(zhǔn)品1 mL，按樣品制備方法制備樣品溶液，分別測(cè)定補(bǔ)骨脂素和佛手柑內(nèi)酯的含量，計(jì)算樣品的加標(biāo)回收率。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品中補(bǔ)骨脂素和佛手柑內(nèi)酯的檢測(cè)方法確定

試驗(yàn)結(jié)果顯示，補(bǔ)骨脂素在245 和222 nm 處吸收比較強(qiáng)，佛手柑內(nèi)酯在222 nm 處吸收較強(qiáng)，故選擇222 nm 作為補(bǔ)骨脂素和佛手柑內(nèi)酯2 種物質(zhì)的共同檢測(cè)波長(zhǎng)。在該波長(zhǎng)處，補(bǔ)骨脂素和佛手柑內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間分別為16.705 和25.556 min，五指毛桃樣品中補(bǔ)骨脂素和佛手柑內(nèi)酯的保留時(shí)間分別為16.566 和25.353 min（圖1），分離度良好。研究采用外標(biāo)法計(jì)算樣品中的補(bǔ)骨脂素和佛手柑內(nèi)酯含量，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制，獲得補(bǔ)骨脂素和佛手柑內(nèi)酯的回歸方程分別為Y=44 939.02X+0.308，r=0.999 99 和Y=60 244.50X-0.251，r=0.999 97。研究驗(yàn)證了樣品的穩(wěn)定性，結(jié)果顯示制備0～12 h 的樣品中補(bǔ)骨脂素和佛手柑內(nèi)酯峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為0.85%、0.96%，表明供試樣品溶液在12 h 內(nèi)穩(wěn)定。研究還驗(yàn)證了檢測(cè)方法的精密度和重復(fù)性，結(jié)果顯示在該檢測(cè)條件下，補(bǔ)骨脂素和佛手柑內(nèi)酯峰面積的RSD 均低于1.5%，表明檢測(cè)方法的精密度、重復(fù)性良好。加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果顯示，補(bǔ)骨脂素和佛手柑內(nèi)酯平均加樣回收率分別為99.7%（RSD=1.85%）和99.4%（RSD=1.97%），表明該檢測(cè)方法準(zhǔn)確可靠。

圖1 五指毛桃中補(bǔ)骨脂素和佛手柑內(nèi)酯的高效液相色譜結(jié)果

2.2 馬尾松林下不同生長(zhǎng)年限五指毛桃植物學(xué)性狀比較

由表1 可知，在相同生態(tài)環(huán)境條件下，五指毛桃株高隨著生長(zhǎng)年限的增加而增加，不同生長(zhǎng)年限的五指毛桃株高差異顯著。一年生至四年生的五指毛桃株高逐年增長(zhǎng)量分別為64.80、159.21、97.01、11.87 cm。四年生的株高最高，平均達(dá)341.35 cm，四年生的株高較三年生增加3.60%，三年生的較二年生增加41.73%，二年生的較一年生增加217.32%?？梢钥闯?，移栽后1～2 a 五指毛桃株高增加最快，是五指毛桃速生期，其次是第3 年，第4 年的株高增長(zhǎng)緩慢。

不同生長(zhǎng)年限的五指毛桃基徑差異顯著，生長(zhǎng)年限越長(zhǎng)，主莖越粗。二年生至四年生的五指毛桃基徑分別為2.27、3.09、3.35 cm；三年生的基徑比二年生平均增粗36.12%，四年生的基徑比三年生平均增粗8.41%，四年生的基徑年增粗率比三年生降低。二年生、三年生的五指毛桃基徑增粗顯著，四年生的差異減小，基徑增粗速度減慢。

五指毛桃側(cè)根數(shù)隨著生長(zhǎng)年限的增加呈先快后慢的增長(zhǎng)趨勢(shì)。一年生和二年生的側(cè)根數(shù)增加明顯，說(shuō)明五指毛桃側(cè)根的數(shù)量增加主要在一年生和二年生階段，四年生與三年生的側(cè)根數(shù)差異不顯著。

不同生長(zhǎng)年限五指毛桃根長(zhǎng)差異顯著。四年生的根長(zhǎng)最長(zhǎng)，平均達(dá)131.72 cm，四年生的五指毛桃根長(zhǎng)較三年生增加7.67%，三年生的較二年生增加11.36%，二年生的較一年生增加229.42%。可以看出，二年生的五指毛桃側(cè)根長(zhǎng)得最快，其次分別是三年生和四年生。這與株高生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)有些相似，說(shuō)明移栽后1～2 a 五指毛桃株高和根長(zhǎng)進(jìn)入速生期。

表1 不同生長(zhǎng)年限的五指毛桃主要生長(zhǎng)性狀

表2 不同生長(zhǎng)年限五指毛桃生物量變化動(dòng)態(tài) （g/株）

不同年限五指毛桃最大根徑差異顯著，生長(zhǎng)年限越長(zhǎng)，最大根莖越粗。二年生至四年生的五指毛桃最大根徑分別為1.40、2.12、2.63 cm，三年生的最大根徑與二年生的相比，增粗51.75%，四年生的比三年生增粗24.06%，二年生和三年生的根徑增粗率大，四年生的增粗率相對(duì)較小。

2.3 不同生長(zhǎng)年限五指毛桃生物量變化動(dòng)態(tài)

由表2 看出，不同生長(zhǎng)年限鮮重和干重都差異顯著，與生長(zhǎng)年限呈正相關(guān)關(guān)系。一年生至四年生的五指毛桃平均每株鮮生物量（地上部鮮重+地下部鮮重）分別為780.33、2 850.55、3 567.91、3 990.18 g，平均每株干生物總量（地上部干重+地下部干重）分別為246.00、1 047.38、1 565.78、2 021.85 g，二年生至四年生的鮮生物量分別較上一年增加2.65、0.25、0.12倍，干生物總量分別較上一年增加3.26、0.49、0.29 倍。五指毛桃生物量隨著生長(zhǎng)年限的增加而增加，二年生的五指毛桃增長(zhǎng)率最大，四年生的較三年生的增長(zhǎng)速率有所降低。

五指毛桃以根部入藥，地下部是收獲目標(biāo)，也是光合產(chǎn)物積累和儲(chǔ)藏的重要器官，五指毛桃根部生物量大小決定著產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)效益。從表2 可以看出，一年生的五指毛桃幼苗移栽后，由于前期幼苗植株小，地上部生物量少，光合產(chǎn)物積累能力弱，限制了五指毛桃的生長(zhǎng)速率，植株生長(zhǎng)緩慢，到二年生后，進(jìn)入旺盛生長(zhǎng)期、大量積累光合產(chǎn)物，生物量迅速積累，總生物量迅速上升，增長(zhǎng)量最大，之后隨著生長(zhǎng)年限的增加，增長(zhǎng)量呈現(xiàn)遞減趨勢(shì)。

2.4 不同生長(zhǎng)年限對(duì)五指毛桃的補(bǔ)骨脂素和佛手柑內(nèi)酯含量的影響

不同生長(zhǎng)年限五指毛桃塊根的補(bǔ)骨脂素和佛手柑內(nèi)酯含量有差異，說(shuō)明生長(zhǎng)年限對(duì)其質(zhì)量有影響。由表3 看出，同一生長(zhǎng)年限五指毛桃塊根的補(bǔ)骨脂素含量高于佛手柑內(nèi)酯含量。三年生的五指毛桃塊根中的補(bǔ)骨脂素和佛手柑內(nèi)酯含量較二年生和四年生的含量高。補(bǔ)骨脂素含量的高低順序均為：一年生＞三年生＞四年生＞二年生，佛手柑內(nèi)酯含量的高低順序均為：一年生＞三年生＞二年生＞四年生。

表3 不同生長(zhǎng)年限五指毛桃補(bǔ)骨脂素和佛手柑內(nèi)酯含量比較

3 結(jié)論與討論

五指毛桃主根垂直向下生長(zhǎng)，當(dāng)長(zhǎng)到一定程度時(shí)，生長(zhǎng)緩慢，從根頸長(zhǎng)出一定數(shù)量的側(cè)根。側(cè)根斜向下或者橫著生長(zhǎng)，側(cè)根數(shù)量多且生長(zhǎng)快。側(cè)根數(shù)、側(cè)根長(zhǎng)和側(cè)根直徑?jīng)Q定五指毛桃的產(chǎn)量，因此以側(cè)根作為地下部生長(zhǎng)性狀的測(cè)定對(duì)象，發(fā)現(xiàn)馬尾松林下二年生的五指毛桃株高、基徑、根長(zhǎng)、最大根徑和生物量進(jìn)入速生期，地上部鮮重平均值為1 860.38 g，地下部鮮重平均值為720.17 g，三年生增長(zhǎng)量次之，說(shuō)明五指毛桃可以在馬尾松林下進(jìn)行林藥種植。

一年生五指毛桃塊根的補(bǔ)骨脂素和佛手柑內(nèi)酯含量較高，可能是一年生的五指毛桃根較細(xì)小，以根皮為主，根莖量少。鐘鏡金等[15]研究發(fā)現(xiàn)五指毛桃根皮的補(bǔ)骨脂素和佛手柑內(nèi)酯含量明顯高于根莖的含量?！吨袊?guó)藥典》尚未收錄五指毛桃質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，沒(méi)有參考補(bǔ)骨脂素和佛手柑內(nèi)酯含量標(biāo)準(zhǔn)。馬雅婧等[16]建議參照藥典高效液相色譜法（附錄Ⅵ D）測(cè)定五指毛桃補(bǔ)骨脂素和佛手柑內(nèi)酯含量，補(bǔ)骨脂素含量不低于0.05%。

林藥種植塊根類中藥材，需考慮中藥材的產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)效益。林下粗放式種植中藥材，沒(méi)有施用農(nóng)藥和化肥，屬于仿野生種植，一般的野生藥材，由于生長(zhǎng)年份不詳，采收時(shí)大多為不同年限的藥材混合品，藥材質(zhì)量差異大，林下種植可以避免這種缺陷，選擇在藥材最佳采收年限進(jìn)行采收，達(dá)到質(zhì)量均一、提高藥用效果的目的。補(bǔ)骨脂素和佛手柑內(nèi)酯作為評(píng)價(jià)五指毛桃質(zhì)量的重要依據(jù)，過(guò)早采收使得產(chǎn)量過(guò)低、藥用活性成分相對(duì)積累較少；采收過(guò)遲往往導(dǎo)致過(guò)于老化、品相差等。而補(bǔ)骨脂素和佛手柑內(nèi)酯在一年生含量最高，之后含量下降，三年生又比二年生的含量高，表明五指毛桃活性物質(zhì)含量不是生長(zhǎng)年限越長(zhǎng)越高，而是生長(zhǎng)到一定年限后不再增加，反而降低。因此，選擇適宜的采收時(shí)期有利于品質(zhì)的保證，三年生的五指毛桃補(bǔ)骨脂素和佛手柑內(nèi)酯含量較高，兼顧地下部分干物質(zhì)積累量，建議宜采收三年生的五指毛桃入藥。