林大成，張玲玲，張自然，譚柳思

1.北部灣大學 食品工程學院,廣西 欽州 535011 2.北部灣大學 廣西高校北部灣特色海產品資源開發(fā)與高值化利用重點實驗室,廣西 欽州 535011 3.北部灣大學 欽州市特色果蔬發(fā)酵重點實驗室,廣西 欽州 535011

隨著國民經濟和社會發(fā)展水平的提高，人們對食品的質量要求越來越高，食品防腐保鮮成為重要的研究課題之一。生物防腐劑取代化學防腐劑是目前與未來食品質量保鮮的發(fā)展趨勢。為了開發(fā)食品保鮮劑，近年來國內外不少研究者對微生物在食品保鮮領域的應用進行了研究，其中乳酸菌保鮮相對于傳統(tǒng)的化學保鮮、低溫保鮮、輻照保鮮和氣調保鮮，具有安全、高效和低成本等特點[1]。目前，乳酸菌主要應用于乳制品和蔬菜水果的保鮮，而很少應用于水產品的保鮮。此外，乳酸菌保鮮多采用其乙醇提取物部分[2-3]，對剩余醇沉成分的功效卻鮮有報道。研究發(fā)現，乳酸菌發(fā)酵過程中將糖轉化為有機酸、胞外多糖、醇類甚至乳鏈球菌素(Nisin)和過氧化氫等物質，這些物質可有效抑制有害菌的繁殖，從而提高食品的保藏性能[4-5]。水產品易腐敗最難保鮮，其中鮮蠔營養(yǎng)豐富，素有水產牛奶之稱，而廣西欽州盛產鮮蠔，故可作為水產品保鮮試驗的典型代表。

枸杞、紅景天及綠藻因含有豐富的營養(yǎng)物質如多糖、蛋白、多酚和黃酮類物質，已引起國內外學者的關注。枸杞具有提高免疫力、抗衰老、抗腫瘤等功能，其中的主要功效成分為枸杞多糖[6]。枸杞多糖多采用熱水浸提然后乙醇沉淀，或采用微生物發(fā)酵法提取[7]。紅景天具有抗氧化和抗疲勞等多種生理功能，其主要活性成分為紅景天苷與苷元酪醇[8-9]。綠藻主要活性成分為多糖與生物活性生長因子，具有抗氧化、增強人體免疫功能等功效[10]。由于目前生物保鮮劑的制備量偏少，效果不彰，應用不廣，因此，企待創(chuàng)新方法，提升產量，彰顯效果，以因應綠色食品的潮流趨勢。作者采用枸杞、紅景天和綠藻組成的中藥制劑促進乳酸菌發(fā)酵，以提升發(fā)酵液中醇沉組分(蛋白多糖)的提取量并強化其中活性成分的功能，以期為中藥優(yōu)化生物保鮮劑的制備與功能研究提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮蠔：欽州市海華蠔業(yè)科技開發(fā)有限公司；中藥制劑(枸杞、紅景天、綠藻)：臺灣中藥廠與食品公司；混合乳酸菌種(嗜酸乳桿菌、德氏乳桿菌保加利亞亞種、嗜熱鏈球菌)：杭州娃哈哈集團有限公司；MRS肉湯培養(yǎng)基、MRS瓊脂培養(yǎng)基：杭州百思生物技術有限公司。1，1-二苯基-2-苦肼基自由基(DPPH, Sigma)：西安熱默爾生物科技有限公司；95%乙醇、抗壞血酸、苯酚、葡萄糖、沒食子酸和Folin-Ciocalteau 試劑等均為分析純。

1.2 儀器與設備

Evolution 201 & 220紫外-可見光分光光度計：上海譜祥科學儀器有限公司；TG16 MW臺式高速離心機：湖南赫西儀器裝備有限公司；KTNK-80冷凍干燥機：上海喬楓實業(yè)有限公司。

1.3 試驗設計

以MRS培養(yǎng)基添加經蒸煮提煉的中藥濃縮液(1%，V山藥∶V枸杞∶V紅景天=1∶1∶1)培養(yǎng)混合乳酸菌(1%，V嗜酸乳桿菌∶V德氏乳桿菌保加利亞亞種∶V嗜熱鏈球菌=1∶1∶1)作為試驗組(EX)，以不添加中藥僅加乳酸菌發(fā)酵為控制組(CL)和單純鮮蠔汁為對照組(BK)進行抗氧化功能評估?？寡趸δ芤訢PPH自由基清除能力為指標，并測定總酚含量，以闡述抗氧化的機理。

1.4 有效成分的提取與分析

將EX與CL兩組試驗的發(fā)酵液靜置于冰箱3 h后，離心(6 000g，15 min)，取沉淀物于烘箱中烘干(105 ℃，72 h)，恒質量后即得菌體質量。離心后的上清液經減壓濃縮至1/3體積后加入3倍等體積的乙醇(95%)，4 ℃靜置24 h，取沉淀物，冷凍干燥，即得粗醇沉組分(Ethanol precipitated component，EPC)，稱質量得EPC產量；EPC產率為EPC干質量與菌體干質量的比值。進一步將所得粗EPC經3次循環(huán)的分子質量(18～20 kD)透析純化，冷凍干燥得純EPC。并經巴氏滅菌法(65 ℃, 30 min)滅酶殺菌，再利用酸水解純EPC并分別測定水解前后蛋白質和多糖含量及純EPC質量，純EPC組成為背景組(BG)。同法進行純鮮蠔汁的測定作為對照組(BK)。蛋白質和多糖的總回收率：[(蛋白質+多糖)/純EPC]×100%。純EPC的回收率：(純EPC/粗EPC)×100%。蛋白質測定采用考馬斯亮藍法[11]，多糖測定采用總糖苯酚硫酸法[12]。

1.5 單因素試驗和正交試驗

單因素試驗主要考察中藥添加量(1%、2%、3%、4%、5%)、菌種添加量(6%、8%、10%、12%、14%) 及發(fā)酵時間(4、6、8、10、12 h)對EPC產量的影響。根據單因素試驗結果，以EPC產量為評價指標，進行三因素三水平L9(33)的正交優(yōu)化試驗。

1.6 抗氧化試驗

所有試驗所用EPC質量濃度均為10 mg/mL，對EPC抗氧化能力的評估主要是測定DPPH自由基清除能力與總酚含量。DPPH清除能力測定：參考文獻[13]的方法?？偡雍繙y定：采用Folin-Ciocalteu法，參考Gao等[14]的方法。

1.7 數據處理

每組試驗重復3次，所有數據采用Duncan法(P<0.05)進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 醇沉組分制備單因素試驗

2.1.1 中藥添加量對醇沉組分產量的影響

中藥添加量對EPC產量的影響如圖1(a)所示。隨著中藥添加量的增加，EPC的產量呈先上升后下降的趨勢。當中藥添加量為3%時，EPC的產量最高，為(986±13) mg/L，與其他添加量的產量相比具有顯著差異(P<0.05)，此時乳酸菌的生長最穩(wěn)定，發(fā)酵作用最旺盛，最適合EPC的生產。當中藥添加量高于3%時，底物抑制現象將不利于乳酸菌的生長繁殖，從而造成發(fā)酵液中EPC含量降低，故最適中藥添加量為3%左右。中藥的添加可影響乳酸菌的發(fā)酵作用，提供發(fā)酵生產EPC的刺激因子，強化乳酸菌的生長并激發(fā)酶類的生化反應[10]。林大成等[13]研究發(fā)現，中草藥(紅曲、山藥和蘆薈，1.0%)的添加對乳酸菌發(fā)酵產物中胞外多糖的產量和產率均有促進作用。

2.1.2 菌種添加量對醇沉組分產量的影響

菌種添加量對EPC產量的影響如圖1(b)所示。菌種添加量為6%～12%時,添加量與EPC產量呈正相關。開始階段，發(fā)酵液中營養(yǎng)物質豐富，接種量越大，代謝產物含量越高，越有利于中藥制劑的多糖等醇沉組分的溶出，即菌種添加量的增加有利于EPC的生產；但當菌種量超過12%時，則會出現微生物量過多而導致底物不足，一部分菌體在競爭中死亡，從而造成EPC產量降低，故最適菌種添加量為12%左右，此時產量最高，為(982±13) mg/L,與其他添加量的產量相比具有顯著差異(P<0.05)。鄭苗等[15]研究發(fā)現，添加懷山藥的乳酸菌發(fā)酵液中主要產物乳酸隨著接種量的增加呈現先上升而后平穩(wěn)的趨勢。因此，本研究中當菌種量超過12%時，隨著菌種競爭使代謝產酸能力下降，蛋白和多糖等醇沉組分的溶出也隨之減少；另外在底物不足時，中草藥中的一些刺激因子也隨之減少，降低乳酸菌多糖等醇沉組分的生成，從而導致最終EPC產量降低,此先上升后下降的變化趨勢與文獻[13]報道的一致。

2.1.3 發(fā)酵時間對醇沉組分產量的影響

發(fā)酵液中EPC的產量隨著發(fā)酵時間延長呈先增加而后趨于穩(wěn)定的趨勢，如圖1(c)所示。4～10 h內發(fā)酵液的營養(yǎng)物質豐富，乳酸菌快速生長，產生大量的乳酸和酶類，乳酸促使中藥中的蛋白質、多糖以及多酚等活性成分不斷溶出，導致EPC產量快速增加；10 h后隨著發(fā)酵時間的延長，乳酸增加速度減慢，蛋白、多糖等成分的溶出也隨之減少；而乳酸菌數量的增加造成溶出的碳源和氮源被迅速分解，導致發(fā)酵液中EPC的產量趨于穩(wěn)定[16]。故從經濟性考慮，最適發(fā)酵時間為10 h左右，此時EPC產量最高，為(889±19) mg/L, 除12 h外與其他發(fā)酵時間的產量相比具有顯著差異(P<0.05)。研究發(fā)現添加枸杞、紅景天等中藥的乳酸菌發(fā)酵液中含有酶類(胞內酶和胞外酶)、粗多糖、蛋白質及總酚類成分[17-18]。

2.2 醇沉組分制備的正交試驗

正交試驗結果如表1所示。各因素對EPC產量影響的順序為A>C>B，即中藥添加量對EPC產量影響最大，發(fā)酵時間次之，菌種添加量的影響最小。復合乳酸菌發(fā)酵懷山藥工藝研究也證實發(fā)酵時間對代謝產物的影響大于接種量[15]。最優(yōu)組合為A2B3C3，即中藥添加量3%，菌種添加量14%，發(fā)酵時間12 h。適當的菌種添加量可稍微促進乳酸菌EPC的生產，充足的發(fā)酵時間比菌種添加量更能促進乳酸菌發(fā)酵產生EPC，適當的中藥添加量可強化促進乳酸菌生產EPC[19]，但過量的中藥則會抑制EPC的生產。

表1 正交試驗結果與分析Table 1 Results and analysis of orthogonal experiments

2.3 驗證試驗結果與分析

因正交試驗最優(yōu)組合不在正交試驗表中，故進行驗證和對比試驗，結果如表2所示。中藥制劑發(fā)酵液中EPC產量為(1 188±35) mg/L，與正交試驗第5組的結果大致符合，證明該正交試驗重現性良好。添加中藥的試驗組與不添加中藥的控制組、純新鮮蠔汁的對照組相比，具有顯著較高的EPC產量及產率(P<0.05)。EPC產量與產率的高低為試驗組>控制組>對照組，此現象顯示乳酸菌的生長量與EPC產量及產率呈正相關，可初步說明試驗所用中藥制劑對EPC產量有促進作用。本試驗結果與文獻報道一致[6, 8, 20]。研究發(fā)現，紅景天和輪葉黨參混合提取物可促進乳酸菌的生長，并提高發(fā)酵液蛋白質、多糖和多酚的含量[8]。枸杞提取物也可促進微生物發(fā)酵液中胞外多糖的產量[20]。

表2 驗證與對比試驗結果Table 2 Verification and comparison test results

2.4 醇沉組分中主要活性成分分析

目前利用微生物發(fā)酵制得的綠色生物產品，已有作為抗氧化保健食品與蔬菜抗病毒預防的應用報道，研究其活性成分為蛋白多糖[21-22]。將本研究的粗EPC再進一步透析純化，所得約90.5%純EPC并分析其主要組成，如表3所示，純蛋白多糖中蛋白質和多糖總和的回收率90.2%～92.5%；而蛋白質與多糖分別占純蛋白多糖的比例為11.4%～12.2%與78.6%～79.3%，其中蛋白質含量與王賀等[12]的研究結果類似。王賀等以Sevag法除去蛋白質和本研究經巴氏滅菌法滅酶鈍化處理，二者成分皆無活性功能,因此，推斷EPC中蛋白質可能為非主要活性成分[12]。

表3 蛋白多糖中的主要活性成分Table 3 Main active components in proteoglycan

由表3可知，試驗組(EX)的蛋白質、多糖含量、純蛋白多糖及總酚含量都顯著高于控制組(CL)和對照組(BK)(P<0.05)。可知試驗組的中藥乳酸菌配方組合較能提高EPC的產量，效果優(yōu)于未添加中藥乳酸菌的控制組。比較背景組(BG)與試驗組酸水解EPC前后的組成,顯示純EPC質量與總酚含量二者并無顯著差異(P>0.05)，可知醇沉組分EPC由蛋白質與多糖共價構成的蛋白多糖(proteoglycan, PG)或多糖蛋白(Glycoprotein, GP)[12,16]。圖2為蛋白多糖質量濃度對總酚含量和DPPH自由基清除率的影響，表3與圖2顯示總酚含量與蛋白多糖質量濃度呈正相關，且DPPH自由基清除能力也隨蛋白多糖質量濃度增加而增強;而純EPC中蛋白活性已經巴氏殺菌法滅酶鈍化[12,19]，故可初步推斷EPC是以蛋白修飾多糖為主體的蛋白多糖，而非以多糖修飾蛋白為主體的多糖蛋白。

圖2 蛋白多糖質量濃度對總酚含量和DPPH自由基清除率的影響Fig.2 Effect of proteoglycan mass concentration on TPC and DPPH scavenging capacity

2.5 中藥優(yōu)化蛋白多糖的活性分析

由圖2可知，多酚含量與DPPH自由基清除能力隨蛋白多糖質量濃度增加而增強；且總酚含量與抗氧化活性呈正相關，此與朱秀靈等[23]的研究結果符合。另外王麗霞等[24]以Sevag法除去山藥蛋白多糖體的游離蛋白質，得到結合蛋白質含量為13.98%，與本研究的蛋白多糖含量相當；而其體外抗氧化能力與蛋白多糖質量濃度呈正相關性，也與本研究結果相符。綜合文獻結果，前人研究胞外多糖中蛋白質與多糖比例分別為2.2%～10.71%與68.1%～78.56%[25-26]。本研究的純蛋白多糖中二者比例分別為11.4%～12.2%與78.6%～79.3%，皆高于前人的研究；而前人研究胞外多糖質量濃度在5～40 mg/mL時對DPPH自由基清除率為6.50%～75.0%，此時總酚含量為0.52～18.96 mg/g[27-28]。本研究純蛋白多糖質量濃度在2～10 mg/mL時對DPPH自由基清除率為27%～83%，此時總酚含量為3.5～26.7 mg/g，也皆優(yōu)于前人的研究結果。因此推論中藥特殊成分可激活乳酸菌發(fā)酵生化反應中的酶系統(tǒng),使原共價結合酚釋出可溶性結合酚而增加總酚含量[29-30]，因而表現出較高的DPPH自由基清除率。故說明本研究以中藥優(yōu)化生物保鮮劑的活性成分具有顯著效果。

3 結論

本研究利用中藥促進乳酸菌發(fā)酵生產EPC，以優(yōu)化生物保鮮劑的制備工藝并分析其活性成分，顯示最佳的EPC發(fā)酵工藝制備條件為中藥添加量3%、菌種添加量14%、發(fā)酵時間12 h，此時EPC產量和產率最高，分別為(1 188±35)mg/L與(46.6±1.3)%。當EPC質量濃度為10 mg/mL時，其多酚含量為(26.2±0.6) mg/g, 對DPPH自由基清除率可達(83.0±3.0)%。由于EPC主要活性成分為含多酚的蛋白多糖,且DPPH自由基清除能力隨其質量濃度增加而增強，因此，初步推論EPC為含蛋白修飾的蛋白多糖。本研究的中藥制劑可優(yōu)化制備工藝，促進乳酸菌產生新穎優(yōu)異的蛋白多糖，具有應用于水產食品保鮮的潛力。