竇瑤 魏琳 宋伍 孫聰 王宏英 王衛(wèi)芳 郭艷霞 閻慧 郭寰宇 梁雪嬌 毛璐 周曉晶

(長春中醫(yī)藥大學(xué) 1臨床醫(yī)學(xué)院，吉林 長春 130117；2藥學(xué)院)

蛹蟲草又名北冬蟲夏草、北蟲草、蛹草。屬子囊菌門、肉座菌目、蟲草菌科、蟲草屬(Cordyceps)〔1〕，與冬蟲夏草為同屬異種。蛹蟲草與冬蟲夏草具有幾乎相同的藥用成分〔2〕，其中活性成分如蟲草素、蟲草酸、蟲草多糖、氨基酸、維生素、微量元素和超氧化物歧化酶等的含量比冬蟲夏草還要高，且蛹蟲草生長較快易于人工培養(yǎng)，作為蟲草屬的模式種，目前已廣泛被國內(nèi)外科研人員所認(rèn)知和接受并成為科學(xué)研究的熱點(diǎn)，蛹蟲草已逐漸成為冬蟲夏草的理想替代品。在《全國中草藥匯編》中已有記載：“蛹蟲草(北蟲草)的子實(shí)體及蟲體也可作為冬蟲夏草入藥。”我國的《中華人民共和國藥典》把蛹蟲草的藥理功效歸納為補(bǔ)肺益腎、止咳化痰。用于慢性支氣管炎癥屬肺腎氣虛、腎陽不足者；癥見咳嗽氣喘、咯痰、自汗、惡風(fēng)、易感、身寒肢冷、腰酸肢軟、乏力、頭昏耳鳴等。無論是古代藥書中對蟲草“止血化痰，治諸虛百損”的記載還是現(xiàn)代《藥典》中對蛹蟲草藥效的歸納，在蛹蟲草的多種藥理作用中，抗炎癥作用已成為目前國內(nèi)外的科研熱點(diǎn)。

炎癥是威脅人類健康的一種常見病和多發(fā)病。從一方面來說，炎癥是有利于機(jī)體的防御反應(yīng)。但炎癥反應(yīng)對人體也存在重大威脅，過度的炎癥反應(yīng)可能致傷致殘甚至危及生命。目前，每年全球約有8 500萬慢性炎癥患者和 193 萬急性炎癥患者都承受著病痛的困擾〔3〕。最新研究表明，炎癥已經(jīng)與腫瘤的發(fā)生聯(lián)系起來〔4〕。因此，炎癥是醫(yī)學(xué)研究中最原始、最復(fù)雜又最具挑戰(zhàn)的新課題。

蛹蟲草的活性成分蟲草素即3′-脫氧腺苷，是第一個從真菌中分離出來的核苷類抗菌素。蟲草素具有抗腫瘤、抗菌、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、清除自由基等多種藥理作用〔5〕。以蟲草素為主要成分的新藥已臨床上試用于白血病的治療，有良好的臨床應(yīng)用前景〔6〕。蟲草酸，即D-甘露醇，是蟲草的主要有效成分之一。蛹蟲草中的蟲草酸含量要高于天然的冬蟲夏草〔7〕。蟲草酸具有利尿脫水、提高血漿滲透壓、鎮(zhèn)喘祛痰等藥理作用。在臨床上可用于血管痙攣、腦血栓、抗氧化、利尿脫水、鎮(zhèn)咳、祛痰平喘、腎衰竭的治療〔8〕。然而蛹蟲草的這兩種活性成分在炎癥作用發(fā)揮的藥效機(jī)制尚不清楚。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可通過對多種復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)及多水平相互連接的分析闡述中藥多成分、多靶點(diǎn)的潛在作用及作用機(jī)制，可通過系統(tǒng)觀察藥物對生物網(wǎng)絡(luò)的干預(yù)與影響，揭示中藥整體調(diào)控的藥效機(jī)制〔9〕。

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的原理，構(gòu)建蛹蟲草活性成分蟲草素和蟲草酸抗炎癥作用蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)。并依據(jù)該網(wǎng)絡(luò)，以脂多糖誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞為模型，在確立蟲草素和蟲草酸合適的干預(yù)濃度和時間后，對在互作網(wǎng)絡(luò)中篩選到的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)蛋白質(zhì)的基因表達(dá)情況進(jìn)行分析。以期從多成分、多靶點(diǎn)整合作用的角度，揭示蛹蟲草的抗炎癥作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1化學(xué)結(jié)構(gòu)研究 通過PubChem數(shù)據(jù)庫分別檢索蛹蟲草的活性成分蟲草素和蟲草酸的2D、3D結(jié)構(gòu)，隨后下載并保存2D和3D結(jié)構(gòu)的SDF格式文件。

1.2蟲草素和蟲草酸作用靶點(diǎn)和炎癥作用靶點(diǎn)研究 將獲得的蛹蟲草活性成分蟲草素和蟲草酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)(2D結(jié)構(gòu)和3D結(jié)構(gòu))的SDF格式文件導(dǎo)入pharmmapper數(shù)據(jù)庫，預(yù)測蟲草素和蟲草酸的作用靶點(diǎn)。隨后通過Uiprot、Pubme等數(shù)據(jù)庫對獲取的化合物作用靶點(diǎn)名稱進(jìn)行矯正。

Genecards是一個以基因?yàn)橹行牡臄?shù)據(jù)庫，每個人類基因都有一個網(wǎng)頁。 以炎癥“inflammation”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索并下載有關(guān)的全部基因。使用“Venny”將化合物作用靶點(diǎn)與炎癥作用靶點(diǎn)取交集得到化合物抗炎靶點(diǎn)，用于后續(xù)研究。

1.3活性化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)和靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 通過Cytoscape3.2.1軟件將蟲草素和蟲草酸靶點(diǎn)和抗炎癥作用靶點(diǎn)，構(gòu)建蟲草素和蟲草酸抗炎癥靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，初步探究蟲草素和蟲草酸對抗炎的藥理作用和機(jī)制。

1.4蛋白互作(PPI)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 為了研究靶點(diǎn)蛋白在系統(tǒng)水平上的相互作用，確定化合物作用靶點(diǎn)群，將化合物治病靶點(diǎn)基因上傳至在線STRING10.5軟件，構(gòu)建由導(dǎo)入基因表達(dá)產(chǎn)物組成的PPI網(wǎng)絡(luò)，并且利用Origin9.1軟件對PPI網(wǎng)絡(luò)中的蛋白繪制條形圖。

1.5基因本體論(GO)功能富集和京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析 本研究采用David v 6.8 數(shù)據(jù)庫對1.4的靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。從通路分析來闡釋藥對生物學(xué)角度的科學(xué)內(nèi)涵。

1.6互作網(wǎng)絡(luò)中篩選到的8個關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)蛋白質(zhì)的基因表達(dá)情況分析 首先以1 μg/ml脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞24 h構(gòu)建炎癥反應(yīng)模型，然后設(shè)置濃度梯度確立蟲草素和蟲草酸對細(xì)胞合適的干預(yù)濃度，設(shè)定的蟲草素和蟲草酸干預(yù)濃度為12.5 μmol/L、25.0 μmol/L、50.0 μmol/L，并設(shè)置干預(yù)時間分別為24 h、48 h。同時以賴氨匹林(100 mg/kg)干預(yù)LPS誘導(dǎo)后RAW264.7細(xì)胞24 h和48 h作為陽性對照。提取上述處理細(xì)胞的總RNA，并在此基礎(chǔ)上利用qRT-PCR方法對在互作網(wǎng)絡(luò)中篩選到的8個信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)蛋白質(zhì)的基因表達(dá)情況進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

2.1收集蛹蟲草活性成分蟲草素和蟲草酸的相關(guān)靶點(diǎn) 通過將蟲草素和蟲草酸的2D和3D化學(xué)結(jié)構(gòu)導(dǎo)入pharmmapper數(shù)據(jù)庫和ChEMBL數(shù)據(jù)庫預(yù)測蟲草素和蟲草酸作用靶點(diǎn)。收集到蟲草素的靶點(diǎn)蛋白質(zhì)共有91個：PRIM1、GPI、CRKL、MAGI1、MSH2、NUB1、ERBB2、TTR、SLC30A9、RNF8、PCNA、CPA1、CSNK1G1、RBKS、HHEX、ALDH3A1、RRM1、RAN、NLGN1、SMURF2、MDH2、EXTL2、NR1I3、VEGFA、MTA3、NUDT4、SSB、CPB2、PATJ、CD3E、GSS、PUS10、PLK4、SULTA4A1、SRP19、MICA、STAT5A、P4HB、SMG7、ACTR3、DPP4、CA14、PROC、FLNB、OLA1、SEPSECS、SACS、EWSR1、PTPRD、LPA、BPHL、ZCWPW1、RAB26、PA2G4、F2、POU1F1、ARF6、SKP1、UBTF、SWAP70、NCR1、ACAD11、TOM1、EIF5A、ACTA1、SEC13、B2M、ARSA、RAP1GAP、CDKN1B、SORCS2、POU2F1、DNAJC16、APR6、ALB、RNASE1、BBX、THOC1、UBE3A、PCYT2、GSTM1、GARS、DHPS、TLR4、ERK1、PTGS2/COX2、MAPKP38、NOS、IL6、NFKB1、TNF；蟲草酸靶點(diǎn)蛋白質(zhì)共82個：ACTR3、PRIM1、TNFRSF1A、ZKSCAN5、QPRT、CPB2、CRDL、HTATIP2、PATJ、MAGI2、NCAM1、SEC13、RINS2、NUB1、TTR、CYP2C8、PPAT、GSTM4、RRM1、SRR、CNTN2、GDI1、SLC30A9、NCR1、MSH2、LOX、PRDM4、MUS81、SH3BGRL、FLNB、CYB5A、PAX5、IGFBP1、EIF5A、RPL9、CDKN1B、COTL1、SDK2、SAP18、DAPK2、ACTA1、CPM、ATP6V1A、TRAF4、OGG1、GALK1、GPI、NR1I3、ARHGAP21、PLK4、EXTL2、MDH2、MDH1、POU2F1、CNN2、WNK1、CNKSR1、ELOF1、EPS8L2、TXNL4B、VRK2、COL20A1、PPP1CB、HNF1B、DLD、CD3E、SKPQ、ESRRB、DAAM1、GAD2、GDA、TP63、TOM1、RBKS、TLR4、ERK1、PTGS2/COX2、MAPKP38、NOS、IL6、NFKB1、TNF。

2.2挖掘到抗炎癥作用相關(guān)靶點(diǎn)的蛋白質(zhì) 以“inflammation”為關(guān)鍵詞在 Genecards數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索并下載有關(guān)的全部基因，共獲得9 000多相關(guān)基因。使用“Venny”將化合物作用靶點(diǎn)與炎癥作用靶點(diǎn)取交集得到蟲草素和蟲草酸的抗炎靶點(diǎn)86個，用于后續(xù)研究。

2.3構(gòu)建蛹蟲草活性成分蟲草素和蟲草酸的抗炎癥作用靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò) 依據(jù)String數(shù)據(jù)庫中檢索到的蟲草素/蟲草酸抗炎癥作用靶點(diǎn)的PPI數(shù)據(jù)信息，導(dǎo)入PPI網(wǎng)絡(luò)可視化軟件Cytoscape3.6.0，對每個靶點(diǎn)的PPI數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算，去掉數(shù)據(jù)重復(fù)信息，構(gòu)建復(fù)雜的蛹蟲草活性成分蟲草素和蟲草酸的“藥物活性成分-靶點(diǎn)-疾病蛋白網(wǎng)絡(luò)”即與抗炎癥作用-網(wǎng)絡(luò)。見圖1。

2.4蟲草素/蟲草酸抗炎癥作用靶點(diǎn)的通路富集分析 對蟲草素/蟲草酸抗炎癥作用靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)，這些靶點(diǎn)分布在35條通路當(dāng)中，根據(jù)P>0.01篩選出26條(見表1)，其中KEGG通路通過查看基因在通路中的分布情況，可以了解該基因在代謝、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等通路中的作用。

圖1 蟲草素和蟲草酸抗炎癥作用靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)

表1 蟲草素和蟲草酸抗炎癥作用靶點(diǎn)的通路富集分析

2.5選取蛹蟲草活性成分蟲草素和蟲草酸的抗炎癥作用靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵節(jié)點(diǎn) 依據(jù)蛹蟲草活性成分蟲草素和蟲草酸的抗炎癥作用的PPI網(wǎng)絡(luò)及網(wǎng)絡(luò)中的GO和KEGG分析數(shù)據(jù)，結(jié)合抗炎癥作用關(guān)鍵的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，選擇蛹蟲草活性成分蟲草素和蟲草酸在炎癥作用中的關(guān)鍵作用蛋白質(zhì)8個：TLR4、ERK1、COX-2、P38、iNOS、IL-6、NF-κB、TNF-α。

2.6通過細(xì)胞水平的實(shí)驗(yàn)探究蛹蟲草介導(dǎo)多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的抗炎癥作用藥效機(jī)制 蟲草素和蟲草酸干預(yù)24 h后與陽性對照(抗炎癥藥物賴氨匹林100 mg/kg)相比，8個關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白均明顯下調(diào)。其中，COX-2、ERK1、iNOS、TNF-α 4個靶點(diǎn)蛋白蟲草酸干預(yù)24 h后比蟲草素干預(yù)24 h后下調(diào)更明顯；IL-6、TLR4 2個靶點(diǎn)蛋白蟲草酸干預(yù)24 h后與蟲草素干預(yù)24 h后無明顯區(qū)別；P38蟲草素干預(yù)24 h后比蟲草酸干預(yù)24 h后下調(diào)更為明顯；NF-κB雖然在蟲草素和蟲草酸干預(yù)24 h后也表達(dá)下調(diào)，但NF-κB表現(xiàn)為對蟲草素和蟲草酸濃度更加敏感，低濃度蟲草素/蟲草酸和中濃度的蟲草酸干預(yù)24 h后NF-κB表達(dá)下調(diào)更加明顯，中、高濃度蟲草素和高濃度蟲草酸干預(yù)24 h后反而表達(dá)上調(diào)。蟲草素和蟲草酸干預(yù)48 h后與陽性對照(抗炎癥藥物賴氨匹林100 mg/kg)相比，明顯表達(dá)下調(diào)的靶點(diǎn)蛋白包括：ERK1、iNOS、P38、TLR4、TNF-α、NF-κB；明顯表達(dá)上調(diào)的靶點(diǎn)蛋白包括：COX2、IL6。蟲草素和蟲草酸干預(yù)24 h后的靶點(diǎn)蛋白表達(dá)情況更有分析意義。見圖2。

3 討 論

盡管抗炎癥作用的機(jī)制還有待探討，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選出蛹蟲草活性成分蟲草素和蟲草酸抗炎癥作用的86個靶點(diǎn)蛋白。通過活性成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)特征分析，構(gòu)建了靶點(diǎn)蛋白的互作網(wǎng)絡(luò)，并將靶點(diǎn)蛋白富集在26條信號通路中，如NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，NF-κB是前炎癥因子基因表達(dá)調(diào)節(jié)的關(guān)鍵成分之一，誘導(dǎo)前炎癥細(xì)胞因子、趨化因子、黏附分子等表達(dá)〔10〕。NF-κB在多種炎癥性疾病的炎癥部位高度活化，如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、炎癥性腹瀉、多發(fā)性硬化癥、哮喘等〔11〕。受體蛋白TLR是動物體與生俱來的一類免疫蛋白，在非特異性免疫過程中起到至關(guān)重要的作用〔12〕，其受體蛋白為TLRs。TLRs完成了非特異性免疫的最初識別步驟的同時也可介導(dǎo)LPS誘發(fā)的多種細(xì)胞反應(yīng)的中間受體，其活性與表達(dá)程度直接決定了巨噬細(xì)胞的激活程度〔13，14〕。TLR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路富集到的4個靶點(diǎn)蛋白在腸炎信號通路、肺結(jié)核信號通路、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎信號通路，這3條炎癥相關(guān)信號通路中同樣被富集，說明這些靶點(diǎn)蛋白為多種炎癥疾病的共同調(diào)控因子。TNF信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中富集了3個關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白(IL6、TNF-α、NFKB)，其中TNF-α是一種參與免疫應(yīng)答的細(xì)胞因子，還是一種重要的炎癥介質(zhì)，TNF-α還對腫瘤細(xì)胞有細(xì)胞毒性、細(xì)胞溶解、抑制增殖等作用〔15〕。說明炎癥與腫瘤之間存在密切聯(lián)系。

綜上，蛹蟲草的有效成分通過上述靶點(diǎn)相互作用，實(shí)現(xiàn)其抗炎等作用。本研究結(jié)果為進(jìn)一步闡釋蛹蟲草抗炎癥作用的藥效機(jī)制奠定了理論基礎(chǔ)，也為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究提供了科學(xué)依據(jù)。