補(bǔ)腎化痰法經(jīng)Sphk1通路調(diào)控肥胖PCOS雌鼠子宮內(nèi)膜容受性的研究*

陳美佳，徐曉娟，黃映紅，田雪梅，張 淼，熊 倩

(成都中醫(yī)藥大學(xué)，成都 610072)

多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)是以生殖內(nèi)分泌及代謝功能異常為特征的卵泡發(fā)育障礙性疾病[1]。目前，由于生活飲食習(xí)慣及環(huán)境的影響，臨床發(fā)病率日益增高，育齡期婦女的發(fā)病率為5%～12%[2]，是全球卵巢性不孕的最主要疾病之一，占不排卵性不孕的50%～70%[3-5]。PCOS的西醫(yī)治療主要包括降低雄激素、促排卵、調(diào)整月經(jīng)周期等方法，但療效欠佳，臨床妊娠率低于40%[6]，且早期流產(chǎn)率高達(dá)50%[7]。既往研究證實(shí)，PCOS高流產(chǎn)率與子宮內(nèi)膜容受性(endometrial receptivity，ER)下降有關(guān)[8]。ER是指在種植窗口期子宮內(nèi)膜允許胚胎植入的最佳容受狀態(tài)，具有時(shí)效性，僅在排卵后7～8 d內(nèi)局部?jī)?nèi)膜組織發(fā)生一系列改變以容受胚胎著床[9]。因此，改善PCOS不孕患者ER成為提高其妊娠率的關(guān)鍵問(wèn)題。對(duì)PCOS患者進(jìn)行中醫(yī)證候分析發(fā)現(xiàn)，約有40%～50%的患者被辨證為腎虛痰濕證[10]，肥胖是其典型臨床特征之一。本課題組認(rèn)為，腎虛痰濕是肥胖PCOS的關(guān)鍵病機(jī)，補(bǔ)腎化痰法是中醫(yī)治療本病的根本治法。本研究基于Sphk1通路探討補(bǔ)腎化痰法改善肥胖PCOS雌鼠ER的效應(yīng)及機(jī)制,為補(bǔ)腎化痰法的臨床運(yùn)用及選方用藥提供可靠的實(shí)驗(yàn)支持。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)SD雌鼠120只，由成都達(dá)碩生物科技有限公司提供，動(dòng)物許可證SCXK[川]2015-030,體質(zhì)量(180～200) g，7～8周齡適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后納入實(shí)驗(yàn)。室內(nèi)保持每日10 h/14 h光暗交替，標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，自由攝食飲水，室溫控制在22～25 ℃，相對(duì)濕度40%～70%，專(zhuān)人及時(shí)更換大鼠墊料。本實(shí)驗(yàn)已通過(guò)成都中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查。

1.2 藥物制備

補(bǔ)腎化痰法擬方藥物組成: 菟絲子30 g，覆盆子30 g，桑椹子30 g，補(bǔ)骨脂10 g，鹿角霜10 g，紫河車(chē)10 g，茯苓20 g，陳皮15 g，車(chē)前子15 g，肉蓯蓉15 g等，統(tǒng)一制備藥物濃度為含生藥濃度5 g/ml、10 g/ml、20 g/ml的低、中和高劑量?jī)?chǔ)存液，臨用時(shí)稀釋。二甲雙胍(中美上海施貴寶制藥有限公司,生產(chǎn)批號(hào)14030657)用法:將1片二甲雙胍溶于50 ml羧甲基纖維素中，制備二甲雙胍混懸液，劑量300 mg/(kg·d)。

1.3 主要試劑

雌二醇(Estradiol，E2，ELISA KIT，貨號(hào)ZC-36464)、孕激素(Progesterone，PROG，ELISA KIT，貨號(hào)ZC-37569)、睪酮(Testosterone，T，ELISA KIT，貨號(hào)ZC-36635)試劑盒購(gòu)自上海茁彩生物科技有限公司。孕激素受體(Progesterone receptor，PR)第一抗體(兔多克隆抗體，1∶150，bsm-33169 M)及雌二醇受體(Estradiol receptor，E2R)第一抗體(兔多克隆抗體，1∶300，bs-0116R)購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.4 肥胖PCOS動(dòng)物模型建立

將120只雌鼠隨機(jī)選取20只作為空白對(duì)照組(以下簡(jiǎn)稱(chēng)空白組)，其余100只雌鼠給予0.5 mg /(kg·d)濃度的來(lái)曲唑及高脂乳劑 (豬油+膽固醇，其質(zhì)量比為10∶3)，灌胃體積為15 mL/(kg·d)，每日上午9點(diǎn)進(jìn)行灌胃，連續(xù)造模28 d。造模第18天開(kāi)始行陰道脫落細(xì)胞涂片觀察，大鼠動(dòng)情周期為5 d，鏡下連續(xù)觀察2個(gè)周期動(dòng)情周期的陰道涂片變化，動(dòng)情周期紊亂者提示造模成功，將造模成功的雌鼠納入后續(xù)實(shí)驗(yàn)共計(jì)100只。

1.5 動(dòng)物分組及給藥

將造模成功的PCOS雌鼠100只按隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、中藥低、中、高劑量組(分別以16.65 g/kg，41.63 g/kg，83.25 g/kg中藥干預(yù)，相當(dāng)于70 kg成人用藥等效劑量、等效劑量的2.5倍、等效劑量的5倍，以下簡(jiǎn)稱(chēng)低劑量組、中劑量組、高劑量組)、陽(yáng)性對(duì)照組(二甲雙胍300 mg/kg干預(yù),相當(dāng)于70 kg成人用藥等效劑量的2.5倍)5組各20只?？瞻捉M和模型組給予等體積蒸餾水灌胃，中藥各劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組給予相應(yīng)藥物灌胃，各組給藥體積均為1 ml/100 g，連續(xù)治療21 d后停藥。

1.6 標(biāo)本采集及指標(biāo)檢測(cè)

1.6.1 動(dòng)情周期檢測(cè) 自造模處理第18天起，各組大鼠每日進(jìn)行陰道涂片檢測(cè)，巴氏法染色，連續(xù)觀察10 d。

1.6.2 體質(zhì)量檢測(cè) 雌鼠在適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后稱(chēng)重為初始體質(zhì)量，然后每3 d稱(chēng)重并記錄，直到處死前稱(chēng)取最后1次體質(zhì)量。

1.6.3 ELISA法檢測(cè)血清E2、PROG及T濃度 停藥后12 h各組大鼠均以10%水合氯醛按0.3 ml/100 g體積注射麻醉處死，心尖采血，4 ℃冰上靜置20 min，以3500 r/min離心15 min取血清，-20 ℃保存?zhèn)溆?。采用ELISA法檢測(cè)血清E2、PROG及T濃度。

1.6.4 子宮組織病理切片染色 每組隨機(jī)選擇10只大鼠，取左側(cè)子宮組織常規(guī)脫水、修剪、包埋、切片5 μm、HE染色、封片，使用BA200Digital 數(shù)碼三目攝像顯微攝像系統(tǒng)(麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)公司生產(chǎn))觀察，分別在×40、×100、×400下觀察并采集所需圖片，分析子宮組織的病理形態(tài)改變并計(jì)數(shù)腺體個(gè)數(shù)。

1.6.5 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)子宮內(nèi)膜E2R、PR表達(dá) 每組選擇6只大鼠，將蠟塊切片、脫蠟，3%甲醇雙氧水室溫10 min，PBS洗3次，浸入0.01 M檸檬酸鹽緩沖液(pH 6.0)，微波爐中高火加熱至沸騰后斷電，PBS洗2次，滴加山羊血清封閉液，室溫20 min，滴加一抗，4 ℃過(guò)夜，滴加生物素化二抗，37℃30 min，PBS洗3次，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水、透明、中性樹(shù)膠封片光鏡下觀察，以細(xì)胞質(zhì)顯示棕黃色均染或顆粒為陽(yáng)性表達(dá)。采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)測(cè)定陽(yáng)性染色的光密度(integrated optical density，IOD)和面積(Area)，計(jì)算平均光密度值(Mean density，MD)，使用3張圖像的MD計(jì)算平均數(shù)，得出E2R、PR的平均光密度值。

1.6.6 RT-PCR法檢測(cè)子宮Sphk1、S1Pr1、Akt、CyclinD1的mRNA表達(dá) 表1示，每組取6只雌鼠的右側(cè)子宮組織進(jìn)行檢測(cè)。TRIZOL提取子宮組織中總RNA，依次進(jìn)行RNA質(zhì)量檢測(cè)、電泳、消化、反轉(zhuǎn)錄；依次用SYBR Primix Ex TaqⅡ(2×)、PCR Forward Primer(0.4 μmol/L)、PCR Reverse Primer(0.4 μmol/L)、cDNA、ddH2O試劑進(jìn)行擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)，在60 ℃～95 ℃進(jìn)行溶解曲線(xiàn)分析。使用Thermo Scientific PikoReal軟件(Thermo公司)分析PCR過(guò)程各檢測(cè)樣本的CT值。β-actin作為內(nèi)參，通過(guò)2-△△CT計(jì)算子宮組織鞘氨醇激酶1(sphingosine kinase 1，Sphk1)、1型1-磷酸鞘氨醇受體(sphingosine 1-phosphate receptor 1，S1Pr1)、蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)、細(xì)胞周期蛋白1(cyclin dependent 1，CyclinD1)mRNA相對(duì)表達(dá)水平。

表1 RT-PCR檢測(cè)所用引物及堿基序列

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 動(dòng)情周期檢測(cè)結(jié)果

圖1示，陰道涂片行巴氏染色于顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，模型組一直處于動(dòng)情間期，動(dòng)情周期失去規(guī)律性變化，而空白組處于動(dòng)情期，并保持規(guī)律的動(dòng)情周期。

圖1 雌鼠陰道脫落細(xì)胞涂片比較(×100)

2.2 體質(zhì)量與腺體數(shù)量

表2示，與空白組比較，模型組肥胖PCOS雌鼠體質(zhì)量顯著上升(P<0.01)，腺體個(gè)數(shù)顯著下降(P<0.01)；與模型組比較，中藥各組體質(zhì)量顯著下降(P<0.01)，腺體個(gè)數(shù)顯著上升(P<0.01)。

表2 各組大鼠體質(zhì)量及腺體個(gè)數(shù)比較

2.3 補(bǔ)腎化痰法對(duì)肥胖PCOS雌鼠血清性激素的影響

表3示，與空白組比較，模型組雌鼠血清PROG、E2濃度降低(P<0.01或P<0.05)，T濃度升高(P<0.01)；與模型組比較，高劑量組雌鼠血清PROG、E2濃度升高(P<0.05)，T濃度降低(P<0.05)。

表3 各組雌鼠血清E2、PROG、T濃度比較

2.4 子宮內(nèi)膜病理形態(tài)變化

圖2示，與空白組比較，模型組子宮處于發(fā)情前期, 子宮內(nèi)膜較多腺上皮細(xì)胞發(fā)生空泡變性、點(diǎn)狀壞死、細(xì)胞核固縮甚至溶解消失，且固有層見(jiàn)大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，肌層的肌纖維水腫、變性，提示模型組子宮發(fā)育滯后且子宮內(nèi)膜受損；與模型組比較，中藥組子宮可能處于發(fā)情期，子宮內(nèi)膜明顯增生，內(nèi)膜變厚，固有層組織疏松水腫且見(jiàn)大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)；肌層肌纖維平行排列整齊、致密，提示中藥組與空白組子宮內(nèi)膜發(fā)育同步，說(shuō)明補(bǔ)腎化痰法能改善子宮內(nèi)膜受損。

圖2 雌鼠子宮形態(tài)HE染色比較(×400)

2.5 補(bǔ)腎化痰法對(duì)肥胖PCOS雌鼠子宮E2R、PR的影響

圖3、4表4示，PR陽(yáng)性產(chǎn)物主要分布在細(xì)胞漿，E2R陽(yáng)性產(chǎn)物主要分布在細(xì)胞核和細(xì)胞漿。與空白組比較,模型組雌鼠子宮組織PR、E2R平均光密度值升高(P<0.01或P<0.05)；與模型組比較，高劑量組雌鼠子宮組織PR、E2R平均光密度值降低(P<0.05或P<0.01)。

注：A.空白組；B.模型組；C.陽(yáng)性對(duì)照組；D.高劑量組；E.中劑量組；F.低劑量組圖3 子宮組織E2R蛋白的免疫組化染色比較(×400)

表4 各組雌鼠子宮E2R、PR蛋白含量比較

2.6 補(bǔ)腎化痰法對(duì)肥胖PCOS雌鼠子宮Sphk1通路的影響

表5示，與空白組比較，模型組雌鼠子宮內(nèi)膜組織中Sphk1、S1Pr1、Akt、CyclinD1mRNA表達(dá)明顯降低(P<0.01)；與模型組比較，高劑量組大鼠子宮中Sphk1、S1Pr1、Akt、CyclinD1mRNA表達(dá)升高(P<0.01或P<0.05)。

表5 各組雌鼠子宮Sphk1、S1Pr1、Akt、CyclinD1mRNA表達(dá)

3 討論

本課題基于補(bǔ)腎化痰法的補(bǔ)腎化痰擬方乃五子衍宗丸與蒼附導(dǎo)痰湯化裁。五子衍宗丸是補(bǔ)腎方，能提高黃體功能，改善激素水平和子宮內(nèi)膜容受性，從而提高妊娠率[11]；蒼附導(dǎo)痰湯是治痰方，研究顯示蒼附導(dǎo)痰丸治療肥胖型PCOS療效顯著[12]。補(bǔ)腎化痰擬方中菟絲子、桑椹子、覆盆子、肉蓯蓉、鹿角霜、補(bǔ)骨脂等補(bǔ)腎中之陰陽(yáng)，紫河車(chē)補(bǔ)腎精而益沖任，車(chē)前子補(bǔ)中有瀉以防滋膩，陳皮、茯苓燥濕化痰，諸藥合用補(bǔ)瀉兼施、標(biāo)本同治，可有效調(diào)經(jīng)助孕。本課題組前期重點(diǎn)研究了卵巢顆粒細(xì)胞的增殖、凋亡與生殖性激素及糖脂代謝改變的相關(guān)性，而未涉及影響妊娠結(jié)局的重要靶器官子宮內(nèi)膜。因此，本課題深入研究補(bǔ)腎化痰法調(diào)控肥胖PCOS子宮內(nèi)膜容受性的作用機(jī)制。

肥胖可通過(guò)高雄激素、胰島素抵抗(Insulin resistance，IR)等多種途徑影響肥胖PCOS患者的生育能力，但肥胖對(duì)于PCOS子宮內(nèi)膜容受性的影響機(jī)制卻常常被忽視。肥胖使血糖升高產(chǎn)生大量胰島素，發(fā)展成為高胰島素血癥、IR，卵巢局部的IR導(dǎo)致T升高。T可加速內(nèi)臟脂肪分解產(chǎn)生更多游離脂肪酸，刺激胰腺β細(xì)胞產(chǎn)生更多的胰島素，加重IR[13]形成惡性循環(huán)。高雄激素水平可促進(jìn)內(nèi)臟沉積脂肪，脂肪細(xì)胞也能儲(chǔ)存雄激素樣類(lèi)固醇，造成脂肪組織中類(lèi)固醇濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于血漿，故肥胖者的類(lèi)固醇池更大[14]，說(shuō)明肥胖會(huì)加重生殖內(nèi)分泌紊亂。子宮內(nèi)膜是性激素作用的直接靶器官，雌孕激素可以維持內(nèi)膜的容受性[15]。E2、PROG的生理效應(yīng)依賴(lài)E2R及PR的介導(dǎo)。有臨床研究顯示[16]，肥胖PCOS患者子宮內(nèi)膜增殖期E2R、PR增多，PCOS患者長(zhǎng)期存在無(wú)成熟卵子排出的現(xiàn)象，使體內(nèi)E2水平變化不大，且由于缺乏PROG的拮抗作用，E2R、PR持續(xù)高表達(dá)，使子宮內(nèi)膜長(zhǎng)期在低E2作用下增生。子宮內(nèi)膜是胰島素的靶器官之一，研究顯示[17]，PCOS患者子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞胰島素受體明顯升高，提示PCOS患者子宮內(nèi)膜存在局部IR。正常的葡萄糖代謝促進(jìn)子宮內(nèi)膜細(xì)胞的分化和成熟，載體葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-4(glucose transporterfactor-4，GLUT4)以胰島素為介導(dǎo)轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖，在子宮內(nèi)膜腺體組織的成熟過(guò)程中起重要作用。本課題組前期課題研究[18]發(fā)現(xiàn)，肥胖PCOS大鼠體內(nèi)GLUT4表達(dá)降低，說(shuō)明其對(duì)葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)能力下降，子宮內(nèi)膜細(xì)胞對(duì)葡萄糖的利用差，直接影響內(nèi)膜糖代謝水平。

肥胖PCOS患者生殖性激素及代謝內(nèi)分泌紊亂，子宮內(nèi)膜無(wú)法向分泌期轉(zhuǎn)化，其血管生成及螺旋化受阻，必然導(dǎo)致子宮內(nèi)膜容受性下降，妊娠結(jié)局不良。內(nèi)膜的發(fā)育少不了血管的參與，Sphk1作為一種蛋白激酶，主要存在于血管內(nèi)皮細(xì)胞中，其作用是調(diào)節(jié)細(xì)胞生命活動(dòng)，其周期性表達(dá)受E2R,、PR等調(diào)節(jié)。當(dāng)Sphk1受到刺激后生成S1P促進(jìn)血管愈合與胚胎發(fā)育，S1P與其受體S1Pr1結(jié)合活化磷脂酰肌醇3-激酶(Phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)/Akt通路，激活下游Cyclin D1，CyclinD1是細(xì)胞周期素家族中與細(xì)胞增殖周期關(guān)系較為密切的分子，在細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)中起重要作用[19]。在生理?xiàng)l件下[20-21]，作為細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子，CyclinD1可以激活啟動(dòng)細(xì)胞周期然后聯(lián)系細(xì)胞外信號(hào)環(huán)境，激活因子生長(zhǎng)因子受體并激活多條信號(hào)通路，控制G0期過(guò)渡G1再轉(zhuǎn)變S期，促進(jìn)細(xì)胞增殖和子宮內(nèi)膜血管生成。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組雌鼠動(dòng)情周期失去規(guī)律，體質(zhì)量明顯增加，血清性激素紊亂，子宮發(fā)育滯后且子宮內(nèi)膜形態(tài)受損，提示肥胖PCOS模型建立成功。模型組血清中T持續(xù)高表達(dá)，然后向E2轉(zhuǎn)化被抑制，故E2含量降低。由于排卵障礙，血內(nèi)PROG含量降低，說(shuō)明肥胖加重生殖內(nèi)分泌紊亂；模

型組PR、E2R蛋白含量明顯升高，說(shuō)明肥胖加重PCOS并導(dǎo)致子宮內(nèi)膜容受性下降；Sphk1、S1Pr1、Akt、CyclinD1 mRNA表達(dá)明顯降低，故推測(cè)肥胖PCOS可能上調(diào)E2R、PR表達(dá)，影響Sphk1的激活，阻礙Sphk1通路，進(jìn)而影響細(xì)胞增殖、子宮內(nèi)膜血管生成。經(jīng)補(bǔ)腎化痰法干預(yù)后，中藥治療組體質(zhì)量增長(zhǎng)得到有效控制，說(shuō)明補(bǔ)腎化痰法能改善肥胖PCOS雌鼠肥胖狀態(tài)。中藥高劑量組雌鼠T下降，PORG、E2上升，說(shuō)明該法能調(diào)節(jié)肥胖PCOS雌鼠生殖內(nèi)分泌紊亂，維持E2、PROG平衡，糾正PCOS高雄狀態(tài)，使子宮處于良好的內(nèi)環(huán)境中。中藥高劑量組子宮組織PR、E2R蛋白含量下降，Sphk1、S1Pr1、Akt、CyclinD1 mRNA表達(dá)上升，故推測(cè)補(bǔ)腎化痰法通過(guò)調(diào)控E2R、PR表達(dá)，增加Sphk1表達(dá)，激活PI3K/Akt信號(hào)傳導(dǎo)通路，上調(diào)CyclinD1表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞增殖和子宮內(nèi)膜血管生成，改善子宮內(nèi)膜形態(tài)，發(fā)揮其改善子宮內(nèi)膜容受性的作用。