譚靚，李泰明

腺相關(guān)病毒載體在基因治療領(lǐng)域中的應(yīng)用和挑戰(zhàn)

譚靚，李泰明

（中國藥科大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 南京 210009）

腺相關(guān)病毒載體是基因治療領(lǐng)域中最有前景的基因遞送平臺之一，它具有免疫原性較低、安全性高、制備簡單、可大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)勢，尤其在安全性方面遠(yuǎn)超其他病毒載體。近幾年，在難治性疾病的臨床治療中，腺相關(guān)病毒基因載體發(fā)揮著越來越重要的作用，但由于仍存在一些待解決的問題，尚未在臨床中大規(guī)模應(yīng)用。綜述了目前腺相關(guān)病毒基因載體在基因治療領(lǐng)域中的應(yīng)用趨勢和所面對的挑戰(zhàn)，并進(jìn)行了展望。

基因治療；腺相關(guān)病毒載體；基因遞送；表達(dá)效率

1 前言

腺相關(guān)病毒（Adeno-associated viruse，AAV）載體是以AAV基因組為骨架改造而來的基因遞送工具。腺相關(guān)病毒屬于細(xì)小病毒科的低致病性病毒，它的基因組為線性單鏈DNA，大小約4.7 kB，在基因組兩端分別有一條反向末端重復(fù)序列（Inverted terminal repeat，ITR），其中的D序列與病毒基因組高效釋放、選擇性復(fù)制和包裝密切相關(guān)，基因組編碼區(qū)有2個開放閱讀框，分別編碼4種Rep蛋白和3種Cap蛋白，它們分別在基因組復(fù)制、病毒裝配以及包裝中發(fā)揮著作用[1]。在設(shè)計AAV載體基因組時，需要將編碼區(qū)基因序列替換為目的基因和相關(guān)功能片段，僅保留兩端反向末端重復(fù)序列。在其生產(chǎn)時采用三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染法，即將帶有AAV載體基因組的質(zhì)粒、腺病毒輔助基因質(zhì)粒、表達(dá)cap和rep蛋白的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞。

AAV按血清試驗結(jié)果可以分為不同種，目前已有13種AAV血清型（AAV1～AAV13），分別靶向不同的受體和組織。在制備腺相關(guān)病毒載體時，通常根據(jù)疾病部位和靶向組織的不同，選擇不同的血清型。具體受體及靶向目標(biāo)如表1所示[2]。

與慢病毒載體、腺病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體等其他常用病毒載體相比，AAV載體在沒有輔助病毒的情況下并不發(fā)生產(chǎn)毒性感染，具有高安全性、低免疫原性、宿主細(xì)胞范圍廣（感染分裂和非分裂細(xì)胞）、易生產(chǎn)、高穿透性、長時表達(dá)、定點整合等優(yōu)點，在基因治療領(lǐng)域具有極大的應(yīng)用前景[3]。

2 腺相關(guān)病毒基因載體在基因治療中的應(yīng)用

2.1 使用腺相關(guān)病毒基因載體介導(dǎo)基因置換

基因置換指通過使用特定方法，將治療性基因遞送入指定細(xì)胞，利用染色體同源重組原理置換掉功能失常的基因。此技術(shù)適用于治療隱性單基因遺傳病，并在臨床上取得了最大的成功，例如Luxturna，它是以AAV2為載體的基因治療藥物，通過眼部注射，遞送RPE65基因表達(dá)框治療由雙等位基因突變引起的視網(wǎng)膜營養(yǎng)不良[4]。在2000年早期，從靈長類動物中發(fā)現(xiàn)的一個新的AAV血清型及突變體，使AAV載體藥物在血管注射后的轉(zhuǎn)基因傳遞更為廣泛[5]。并且，一些AAV基因置換臨床試驗通過替換此衣殼取得了較好的治療效果，例如治療A/B型血友病、治療杜氏肌營養(yǎng)不良癥等。

表1 不同血清型AAV的受體及靶向目標(biāo)

AAV靶向受體靶向目標(biāo) AAV1唾液酸肌肉、腦、眼、胰腺 AAV2硫酸乙酰肝素蛋白聚糖，層黏連蛋白受體腎 AAV3硫酸乙酰肝素蛋白聚糖，層黏連蛋白受體肝腫瘤 AAV4唾液酸肺、腎、腦、眼 AAV5唾液酸肺、腦、眼 AAV6唾液酸硫酸，乙酰肝素蛋白聚糖心臟、肌肉、肺 AAV7未知肌肉、眼 AAV8層黏連蛋白受體肌肉、腦、眼、胰腺、肝 AAV9半乳糖，層黏連蛋白受體肌肉、腦、眼、胰腺、腎、心臟、肺 AAV10未知腦、新生組織、小腸、結(jié)腸 AAV11未知未知 AAV12未知鼻腔 AAV13硫酸乙酰肝素蛋白聚糖未知

2.2 使用腺相關(guān)病毒基因載體介導(dǎo)基因編輯

利用基因編輯技術(shù)可以直接修復(fù)人體內(nèi)潛在的疾病基因，它通常包括兩個步驟：引起基因組靶向DNA斷裂；進(jìn)行DNA修復(fù)實現(xiàn)基因組改變。CRISPR-Cas9是十分重要的基因編輯技術(shù)，能夠通過向?qū)NA的設(shè)計，實現(xiàn)靶向基因組DNA位點的精確定位，并且設(shè)計簡單，易操作，成為目前科學(xué)研究和臨床應(yīng)用的熱點。與腺病毒、慢病毒等相比，AAV作為一種免疫原性較低的病毒載體，十分適用于CRISPR-Cas9系統(tǒng)的遞送，并且由于其宿主基因組整合率較低，不會引起CRISPR-Cas9在體內(nèi)的長期表達(dá)，降低了基因編輯脫靶突變概率和致癌風(fēng)險。除此之外，AAV載體也可以參與DNA修復(fù)過程，遞送具有靶序列同源重組臂和治療基因序列的基因組[6]，最終通過與Cas9蛋白編碼基因同時遞送，實現(xiàn)基因治療。

2.3 使用腺相關(guān)病毒基因載體介導(dǎo)基因沉默

基因沉默技術(shù)主要用于治療由獲得毒性突變引起的單基因疾病。其中，由AAV載體介導(dǎo)的CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)單獨使用也可以從mRNA水平實現(xiàn)高特異性的基因沉默[7]。然而，RNA干擾（RNA interference，RNAi）技術(shù)目前占據(jù)了rAAV基因沉默平臺的主導(dǎo)地位，它是mRNA水平調(diào)控的重要機(jī)制。shRNA在用基因沉默技術(shù)時，存在基因沉默脫靶的可能。使用Pol III啟動時，高表達(dá)的shRNA可能會影響內(nèi)源性miRNA的生成途徑，引起細(xì)胞毒性[8]。并且，AAV載體在遞送編碼shRNA的基因DNA序列時，載體基因組可能會因為DNA序列的短發(fā)卡結(jié)構(gòu)而被截斷，使基因組的同源性受影響[9]。然而，使用AAV載體遞送編碼siRNA的工程化pre-miR-33可以解決上述問題，基因沉默脫靶概率和細(xì)胞毒性被降低，并且基因沉默效率與shRNA不相上下[10]。

3 腺相關(guān)病毒基因載體在基因治療中的挑戰(zhàn)

3.1 待優(yōu)化的病毒包裝系統(tǒng)

AAV病毒最常用的兩個包裝系統(tǒng)為哺乳動物人胚胎腎細(xì)胞293（HEK29）包裝系統(tǒng)和桿狀病毒/Sf9系統(tǒng)。其中，桿狀病毒/Sf9系統(tǒng)是最早使用的包裝系統(tǒng)之一，可用于生產(chǎn)多種表型的AAV病毒，此系統(tǒng)的包裝成本較低，但病毒衣殼組分極易發(fā)生改變、生物效價較差。另外，由于包裝時衣殼基因輔助質(zhì)粒使用的VP1起始密碼子為非經(jīng)典的ACG，使得此系統(tǒng)包裝的AAV病毒感染效率較差[11]。然而，考慮到大規(guī)模生產(chǎn)的成本問題，桿狀病毒/Sf9系統(tǒng)更適合應(yīng)用于商業(yè)生產(chǎn)中。為了解決其存在的問題，有團(tuán)隊嘗試對VP1起始密碼子進(jìn)行替換，但此方法缺乏不同血清型AAV生產(chǎn)所必需的靈活性。ZOLOTUKHIN等人通過篩選效果較弱的KOZAK序列，改變了核糖體掃描起始位點，建立了能夠包裝多種AAV血清型的昆蟲包裝系統(tǒng)，此系統(tǒng)與哺乳細(xì)胞包裝系統(tǒng)相比，病毒VP1和VP2蛋白含量大大增加，并且包裝的AAV5病毒 DNA污染率更低、生物效價更優(yōu)、在小鼠大腦組織中的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率更好[12]。除了對于包裝系統(tǒng)的優(yōu)化外，衣殼蛋白表達(dá)單元的設(shè)計對于組裝有效的基因治療載體也至關(guān)重要[13]。

3.2 有限的基因組表達(dá)效率

應(yīng)用腺相關(guān)病毒載體時發(fā)現(xiàn)，它的基因組在核內(nèi)表達(dá)效率十分有限，并且對于某些難轉(zhuǎn)型細(xì)胞，其介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)較低，而這可能與其胞內(nèi)運輸和核內(nèi)活動有關(guān)。據(jù)研究報道，細(xì)胞中存在一種伴侶蛋白FKBP52，它會在細(xì)胞表皮生長因子受體蛋白酪氨酸激酶的作用下，發(fā)生酪氨酸或蘇氨酸/絲氨酸磷酸化，在AAV介導(dǎo)外源基因胞內(nèi)運輸時，磷酸化的FKBP52能使其衣殼表面的酪氨酸殘基磷酸化，衣殼蛋白泛素化水平因此提高，被蛋白酶體識別和降解的概率大大提高，最終外源基因表達(dá)效率受到抑制，并且，在細(xì)胞核中，磷酸化的FKBP52會與AAV載體基因組3’端的D序列結(jié)合，阻礙基因組第二條鏈的合成，從而降低AAV載體介導(dǎo)的基因表達(dá)效率[14]。此外，低效率的內(nèi)含體-溶酶體逃逸過程也可能阻礙其順利完成胞內(nèi)運輸過程，阻礙基因表達(dá)。

3.3 高昂的治療費用

盡管AAV載體藥物在治療某些罕見疾病方面取得了卓越的科學(xué)成就，但它的大規(guī)模臨床使用和商業(yè)開發(fā)仍面臨極大挑戰(zhàn)。其中，由于目前AAV病毒包裝系統(tǒng)仍未最優(yōu)化，并且有限的基因表達(dá)效率增大了前期研究和臨床治療中病毒滴度的使用量，使基因治療中AAV載體藥物的價格十分高昂。例如，世界上首個基因治療藥物Glybera。它被用于治療脂蛋白脂肪酶缺乏[15]，由于其高昂的治療費用和較少的市場需求，在歐盟上市期間僅有一名患者接受治療，使其成為歷史上使用者最少的藥物之一，最終被宣布退出市場[16]。因此，實現(xiàn)AAV載體藥物廣泛使用需要調(diào)整治療費用和增加患者普及率。然而，這一目標(biāo)的實現(xiàn)需要有扎實的科研成果支持，因此，提高AAV載體的包裝效率、轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和基因表達(dá)效率是解決問題的關(guān)鍵。

4 展望

基因治療是人類治療腫瘤、傳染病、遺傳病的新方向。與傳統(tǒng)治療方法相比，它可對疾病進(jìn)行治療，從根本上起到預(yù)防、緩解，甚至根治疾病的作用。AAV載體作為一種低免疫原性的病毒載體，在安全性方面優(yōu)于其他病毒載體，是目前基因治療領(lǐng)域的研究熱點，并且已開始應(yīng)用于一些疾病的臨床治療中。

但AAV載體在某些細(xì)胞中的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和基因表達(dá)效率仍有待提高。并且，要實現(xiàn)腺相關(guān)病毒載體藥物的廣泛使用，還要解決載體的大規(guī)模生產(chǎn)問題。然而，隨著人類對AAV研究的深入，其基因組特點和感染機(jī)制以及胞內(nèi)過程越來越清晰，基于此的基因組改造和載體優(yōu)化越來越成熟，相信在不久的將來，會有越來越多高安全性和兼?zhèn)溆行缘腁AV藥物在臨床上市，服務(wù)于更多有需要的人群。

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R450

A

10.15913/j.cnki.kjycx.2020.13.066

2095－6835（2020）13－0157－03

譚靚（1995—），女，湖南衡陽人，研究生，研究方向為生物制藥、基因治療。

李泰明（1963—），女，江蘇南京人，博士，副教授，研究方向為生物制藥。

〔編輯：嚴(yán)麗琴〕