龐戀蘇 匡慧慧 孫 佟 胡 巍 張鳳成 李亞男

口腔的常見疾病如齲病、牙周病、口腔黏膜疾病等均與病菌感染相關(guān)，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為口腔內(nèi)優(yōu)勢菌的出現(xiàn)是誘發(fā)這些疾病發(fā)生發(fā)展的主要原因。溶菌酶(Lysozyme，LYZ)[1]具有抗菌、抗病毒、消炎、增強(qiáng)免疫力等特性，臨床已經(jīng)用溶菌酶來治療上呼吸道感染、咽喉炎等感染性疾病，但其仍具有異源性、生物活性低、性質(zhì)不穩(wěn)定、不耐酸、易產(chǎn)生抗原性等缺點?，F(xiàn)商品化溶菌酶多為蛋清溶菌酶，即由雞蛋蛋清中提取的溶菌酶(Hen egg-White Lysozyme，HEWL)。重組人溶菌酶(Recombinant Human Lysozyme，RHLYZ)來源于人體自身，對人體本身不會產(chǎn)生任何免疫排斥反應(yīng)，也不具有耐藥性，無毒副作用[2]。目前對重組人溶菌酶對口腔的常見致病菌的抑菌作用研究較少，本實驗旨在研究重組人溶菌酶對口腔常見致病菌的抑菌作用，為后續(xù)治療口腔感染的新型制劑的研發(fā)提供研究基礎(chǔ)。

1.實驗材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌群 變形鏈球菌S.mutans UA159(四川大學(xué)口腔生物醫(yī)學(xué)工程重點實驗室)、白色念珠菌ATCC90029(四川大學(xué)口腔生物醫(yī)學(xué)工程重點實驗室)、牙齦卟啉單胞菌(ATCC33277)(四川大學(xué)口腔生物醫(yī)學(xué)工程重點實驗室)、臨床分離菌株(Sm、Ca、Pg)。

1.1.2 培養(yǎng)基 牛心腦浸液培養(yǎng)基(BHI)、科馬嘉(CHROMagar)念珠菌顯色培養(yǎng)基、一次性沙保羅瓊脂培養(yǎng)基(Sabouraud dextrose agar,SAD)、RPMI Medium1640(Gibco)、M-H 瓊脂培養(yǎng)皿、哥倫比亞血平板、Hemin-Vitc 液、羊血(均購自青島海博生物科技有限公司，中國)。

1.1.3 主要儀器和設(shè)備 厭氧產(chǎn)氣袋、密封袋(松隆株式會社，日本)、752N 型紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器，中國)、電子天平、PH儀(貝克曼公司、美國)、恒溫金屬儀、DHZ-DA大容量全溫振蕩器、細(xì)菌微量生化鑒定管、菌板(梅里埃公司，法國)、顯微鏡(奧林巴斯公司，日本)、革蘭染色試劑盒(上海生科生物科技有限公司，中國)、96 孔板(康寧公司，美國)等。

1.1.4 重組人溶菌酶(Recombinant Human Lysozyme，RHLYZ)(廣州奇龍生物醫(yī)藥，中國)、溶菌酶(Lysozyme，LYZ)標(biāo)準(zhǔn)品(北京索萊寶科技公司，中國)，0.9%無菌生理鹽水(四川科倫藥業(yè)股份有限公司，中國)。

1.2 臨床菌株分離培養(yǎng)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn) 所選患者來自于2016 年7 月至2018 年10 月期間就診于解放軍總醫(yī)院、解放軍總醫(yī)院海南醫(yī)院口腔科的患者共52 名，年齡為30～75 歲，進(jìn)行試驗患者均簽署知情同意書，實驗均通過倫理學(xué)審查。

①選取牙體組織缺損達(dá)1/3-2/3、表面發(fā)黑、探診質(zhì)軟，上有軟齲覆蓋的患者。

②戴用可摘義齒6 個月～5 年的患者，診斷為義齒性口炎患者，表現(xiàn)為與義齒接觸的腭、齦黏膜發(fā)紅、水腫，近義齒附近或在義齒承重區(qū)黏膜表面潰爛，觸診質(zhì)軟，或有黃白色斑點狀假膜；實驗室真菌培養(yǎng)為陽性(大于100CFU/ml)。

③選取慢性牙周炎的患者，臨床表現(xiàn)為牙齒松動Ⅰ°，BI 指數(shù)為3，附著喪失為1～2mm，牙周袋深度為≥4mm。

1.2.2 標(biāo)本采集 ①用拭子沾取齲壞表面的軟齲組織及深部牙體組織，置于緩沖液中。

②用清水漱口后，用浸濕生理鹽水的滅菌棉簽擦拭對應(yīng)的黏膜，將獲取的樣本浸入培養(yǎng)液中。

③用無菌吸潮紙尖在牙周炎患者牙周袋內(nèi)蘸取齦溝液后置于緩沖液中。

1.3 菌株培養(yǎng)和菌液制備 經(jīng)實驗室和鏡下檢查確定為目標(biāo)菌株后，觀察培養(yǎng)基上菌落的生長情況，挑選典型菌落4～5 個，接種于BHI-S 培養(yǎng)平板內(nèi)，37℃厭氧(80%N2、10%CO2、10%H2)環(huán)境下復(fù)蘇48 小時，取出培養(yǎng)好的細(xì)菌在3000rpm4℃條件下離心10 分鐘，棄去上清液，按麥?zhǔn)媳葷岱▽⒓?xì)菌的濃度調(diào)至1×103cfu/ml，備用。

1.4 實驗前期制備 實驗分為三組：陽性藥物組，實驗藥物組，空白對照組。

用無菌生理鹽水配成每1L 含重組人溶菌酶0.25g、0.5g、1g、1.5g、2g、3g 的RHLYZ 液，濃度分別為0.25g/L、0.5g/L、1g/L、1.5g/L、2g/L、3g/L。陽性對照藥物組為HEWL 液，同理配置同樣濃度。無菌生理鹽水為空白對照組。

1.5 抑菌藥物敏感實驗

1.5.1 定性試驗 ①參照全國臨床檢驗操作規(guī)程第三版[3]中的抗細(xì)菌藥物敏感性試驗中的方法進(jìn)行藥敏試驗：挑取大約5 個菌落至5ml 生理鹽水中，旋搖成均勻的菌懸液后，制備成0.5 號麥?zhǔn)瞎軡岫龋诰鷳乙褐薪駸o菌棉簽，在試管內(nèi)壁液上方通過旋轉(zhuǎn)棉簽擠出多余的菌液。用棉簽的側(cè)面從3 個不同的方向密涂在含有5%～10%無菌脫纖維羊血、維生素K1 的哥倫比亞血平板上。白色念珠菌用沙保羅瓊脂培養(yǎng)基。均勻涂布菌液。②將滅菌干燥后的6mm 濾紙片放入培養(yǎng)皿，每個菌板放3，分別滴加不同質(zhì)量濃度的RHLYZ 液、HEWL 液、無菌生理鹽水，每個紙片滴加10μL，各紙片間距離均勻相等。③37℃孵育，觀察18～24 小時，厭氧菌置于37℃厭氧(80%N2、10%CO2、10%H2)培養(yǎng)，若未見生長者應(yīng)培養(yǎng)24～48 小時，觀察和記錄抑菌環(huán)直徑，用卡尺記錄直徑，判定抑菌活性。④分別設(shè)置兩組藥物不同的6 種藥物濃度，每組藥物濃度重復(fù)10 次。⑤抑菌環(huán)直徑大小用表示。

1.5.2 定量試驗 ①采用M27-A2 方案[4]中的操作步驟：將RHLYZ 與無菌生理鹽水混勻得到濃度為2g/L 的藥物溶液。取無菌的96 孔板，第一孔加入200uL 菌液作為陽性對照組，第二孔加入200uL 藥液，3 至11 孔分別加入100uL MH 肉湯培養(yǎng)基，從第二孔吸取100uL 加入第三孔，混勻，再吸取100uL 加入第四孔，混勻，以此類推，第十一孔吸取100uL 棄去，此時各孔藥物濃度從第二孔至第十一孔依次為2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125、0.015625、0.0078125、0.00390625g/L，第十二孔加入200uL 培養(yǎng)基作為空白對照組，然后在2 至11 孔分別加入100uL 的菌液。將接種好的96 孔板放置37℃培養(yǎng)箱種進(jìn)行培養(yǎng)，24H 觀察菌液生長情況，同時用標(biāo)準(zhǔn)菌株做質(zhì)控。采用酶標(biāo)儀以空白液體培養(yǎng)基調(diào)零測各孔光密度值(OD450)。

MIC 判定：待測孔與陽性對照孔OD450 值有顯著差異(P＜0.05)的最低質(zhì)量濃度為MIC。

MBC 判定：取“MIC 判定”中未見渾濁的高質(zhì)量濃度孔前后2 孔，吸出培養(yǎng)液，涂布普通瓊脂平板，37℃培養(yǎng)18～24 小時后計數(shù)菌落，＜5cfu/平板的培養(yǎng)孔質(zhì)量濃度即為MBC。

②同理測定陽性藥物組HEWL 的MIC、MBC。

1.6 統(tǒng)計方法 采用SPSS22.0 統(tǒng)計軟件中One-Way ANOVA 對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，P＜0.05即認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)差異。

2.結(jié)果

2.1 K-B 法測定抑菌環(huán)直徑大小 由表1、表2 可見，對于口腔三種常見致病菌，RHLYZ 組均比HEWL 組產(chǎn)生的抑菌環(huán)直徑大，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

隨著藥物濃度逐漸增加，抑菌環(huán)大小相對應(yīng)出現(xiàn)增加，兩兩對比發(fā)現(xiàn)，在變形鏈球菌組和牙齦卟啉單胞菌組1.5g 和3g 為有效藥物濃度，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。白色念珠菌組，隨著藥物濃度增加，抑菌環(huán)大小差異均有意義。說白色念珠菌對RHLYZ和HEWL 敏感，并且與藥物濃度成正相關(guān)。

2.2 稀釋法測定MIC 和MBC 表3 看出，RHLYZ 組在對抗白色念珠菌時，0.03125g/L 極低質(zhì)量濃度即對其有抑制作用，0.125g/L 即有殺滅作用，RHLYZ 對變形鏈球菌在0.125g/L 的濃度時即可對它們產(chǎn)生生長抑制作用，而在對抗變形鏈球菌時也小于HEWL 組，綜合實驗可以看到RHLYZ 組的MIC 和MBC 也都小于HEWL，說明重組人溶菌酶的抑菌活性強(qiáng)于蛋清溶菌酶組。兩組藥物對以上三種微生物均有抑制作用，其中白色念珠菌抑制作用最佳，牙齦卟啉單胞菌次之，變形鏈球菌最差。

表1 重組人溶菌酶抑菌環(huán)直徑測量結(jié)果() mm

表1 重組人溶菌酶抑菌環(huán)直徑測量結(jié)果() mm

*代表兩不同組對比有統(tǒng)計學(xué)意義，**代表同組兩兩對比有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.05。

表2 蛋清溶菌酶抑菌環(huán)直徑測量結(jié)果() mm

表2 蛋清溶菌酶抑菌環(huán)直徑測量結(jié)果() mm

*代表兩不同組對比有統(tǒng)計學(xué)意義，**代表同組兩兩對比有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.05。

表3 藥物對三種菌作用的MIC和MBC g/L

3.討論

齲齒是人類的常見病和多發(fā)病，我國齲齒的發(fā)病率為35%～45%，兒童和老人約可達(dá)70%[5]。變形鏈球菌被認(rèn)為是齲病的主要致病菌，它通過與口腔唾液相互黏附于牙面，利用食物中的蔗糖產(chǎn)生胞外多糖，分解產(chǎn)酸使牙齒pH 下降，在酸環(huán)境中生長繁殖，變形鏈球菌具有較強(qiáng)的耐酸能力，使釉質(zhì)再礦化受阻礙從而產(chǎn)生齲損。牙齦卟啉單胞菌是目前公認(rèn)的牙周炎主要優(yōu)勢菌，屬于革蘭氏陰性菌，在慢性牙周炎的檢出率約為28%～97.4%[6]。義齒性口炎是老年人最常見的口腔黏膜疾病，且發(fā)病率隨年齡增長顯著提高，在義齒及牙列缺失患者粘膜表面多發(fā)現(xiàn)白色念珠菌，現(xiàn)也多認(rèn)為義齒性口炎是白色念珠菌感染引起?？谇恢写嬖?00 多種微生物，往往疾病的發(fā)生不是一種細(xì)菌作用的結(jié)果，現(xiàn)也多認(rèn)為菌群失調(diào)是導(dǎo)致疾病發(fā)生發(fā)展的主要原因，但如何抑制優(yōu)勢菌的生長，達(dá)到菌群微生態(tài)平衡需要進(jìn)一步研究。

溶菌酶廣泛存在于人體液中，是人唾液中的重要抗菌成分，它能選擇性的分解微生物的細(xì)胞壁達(dá)到抑制細(xì)菌的作用。在本實驗中，重組人溶菌酶組優(yōu)于蛋清溶菌酶組原因可能有以下：①重組人溶菌酶主要從動物反應(yīng)器中提取，蛋清溶菌酶為商品化制劑，導(dǎo)致兩者酶作用環(huán)境不同，乳汁中含有豐富的乳鐵蛋白和抗菌物質(zhì)，重組人溶菌酶含有非特異性免疫因子，故發(fā)揮抗菌作用強(qiáng)于溶菌酶。②兩者分子結(jié)構(gòu)存在差異，重組人溶菌酶在pH=5 的條件下能夠最大限度的溶解幾丁質(zhì)[7]，也能夠使其β-1,4 糖苷鍵斷裂從外部直接溶解細(xì)胞壁，使細(xì)菌裂解死亡，而溶菌酶的穩(wěn)定性僅為重組人溶菌酶的1/3，無法有效的保持抑菌活性。③蛋清溶菌酶作為一種外源蛋白，具有免疫原性和毒副作用[8]，這些重組人溶菌酶均不具有。

國內(nèi)外研究以人溶菌酶活性作為標(biāo)準(zhǔn)對其他溶菌酶進(jìn)行鑒定發(fā)現(xiàn)，奶牛溶菌酶活性為1/300，豬為1/3000，最接近的為雞，活性是人溶菌酶的1/3[9]。人溶菌酶優(yōu)于自然界中溶菌酶，但一直以來因為生長周期漫長、產(chǎn)量低、風(fēng)險高、資金回報率低等各種因素導(dǎo)致出現(xiàn)價格高昂、商品化困難、無法大批量化生產(chǎn)等問題，使重組人溶菌酶無法直接應(yīng)用于臨床。雞蛋來源的溶菌酶已經(jīng)在臨床上廣泛應(yīng)用，雖然兩者具有相似性，但來源不同和結(jié)構(gòu)不同還是使得雞蛋溶菌酶在很多方面遜色于人溶菌酶，并沒有將溶菌酶的優(yōu)勢徹底發(fā)揮，綜合多數(shù)研究可以發(fā)現(xiàn)雞蛋溶菌酶抑菌譜差于人溶菌酶。另外，人溶菌酶還有多種其特有的免疫原性，能夠協(xié)同抗病毒、抗腫瘤、抑菌等。

2005 年世界衛(wèi)生組織的統(tǒng)計資料顯示，感染性疾病仍是死亡原因頭三號殺手[10]?？咕幬镌陂L期使用中已經(jīng)具有耐藥性，并且刺激性大、毒性高，口腔抗菌藥物還存在局部藥物濃度過高、易使黏膜、牙面著色等問題。因此，尋找一種使用安全、能有效調(diào)理口腔菌群平衡的藥物成為治療疾病的重點。通過生物工程的方法生產(chǎn)的重組人溶菌酶，不會產(chǎn)生任何耐藥性以及不良反應(yīng)，生物活性也較蛋清溶菌酶得到顯著提高，在疾病防治領(lǐng)域展現(xiàn)出令人矚目的前景。