張林波 姜文

膜性腎病(MN)是以電子顯微鏡觀察到的上皮下免疫復(fù)合物沉積為主要病理特征，70%～75%的MN屬于抗祖細(xì)胞抗原自身抗體的自身免疫性疾病，如抗磷脂酶A2受體(PLA2R)抗體、1型血小板反應(yīng)蛋白7A域等[1-3]。60%～75%的特發(fā)性MN(IMN)是由于抗PLA2R抗體所致。有研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，腎臟組織中的PLA2R抗體陽性、血清PLA2R抗體滴度升高與疾病活動(dòng)度增加和腎移植后MN復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)增高相關(guān)，揭示了抗PLA2R抗體對(duì)MN的直接致病性[4-6]。本研究旨在探討抗PLA2R抗體和IMN疾病活動(dòng)度的相關(guān)性，并比較抗PLA2R抗體滴度和補(bǔ)體激活產(chǎn)物C5a與IMN短期預(yù)后的相關(guān)性。

對(duì)象與方法

1.對(duì)象：納入2015年1月～2016年12月于我院治療的IMN患者72例。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡20～80歲；(2)病理檢查結(jié)果確診為IMN；(3)在免疫抑制劑治療前進(jìn)行腎臟病理活檢。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)1年內(nèi)失訪；(2)合并惡性腫瘤、系統(tǒng)性紅斑狼瘡或肝炎；(3)實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果不完整。根據(jù)血清抗PLA2R抗體檢測(cè)結(jié)果，將72例患者分為抗PLA2R抗體陽性組(陽性組，50例)和抗PLA2R抗體陰性(陰性組，22例)，其中陽性組男33例，女17例，年齡37～79歲，平均年齡(60.42±12.31)歲；陰性組男15例，女25例，年齡34～78歲，平均年齡(58.22±14.63)歲。本研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)審批通過，所有患者均簽署知情同意書。

2.方法

(1)臨床資料收集：收集所有患者的臨床資料，包括性別、年齡、是否合并糖尿病、高血壓、高脂血癥。收集患者腎穿刺病理活檢前的血清白蛋白、總膽固醇、血清肌酐、估算的腎小球?yàn)V過率(eGFR)和尿蛋白丟失量(尿蛋白/肌酐比值，UPCR)。以UPCR反映蛋白尿嚴(yán)重程度，UPCR<0.3為完全緩解，0.3≤UPCR≤3.5或蛋白尿從初始值降低至少50%且至少2周UPCR<3.5為部分緩解[7]。1年內(nèi)病情持續(xù)患者指患者UPCP>0.3持續(xù)1年及1年以上。

(2)血漿抗PLA2R抗體和C5a滴度檢測(cè)：采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)血漿中抗PLA2R抗體及C5a水平。在室溫下全血離心10 min分離血清，通過抗PLA2R抗體 ELISA試劑盒(Thermo Fisher公司)和C5a Elisa試劑盒(Thermo Fisher公司)分別測(cè)定血清中抗PLA2R抗體和C5a水平。血清中抗PLA2R抗體滴度≥20 RU/ml即可診斷為抗PLA2R抗體陽性。

(3)腎臟組織病理活檢：在普通光學(xué)顯微鏡檢測(cè)中，將腎臟組織病理標(biāo)本用福爾馬林固定后用石蠟包埋，并進(jìn)行蘇木素-伊紅(HE)染色。在電子顯微鏡檢測(cè)中，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)流程，將腎臟病理組織標(biāo)本浸泡于2.5%戊二醛溶液中進(jìn)行固定，并經(jīng)鋨酸染色、樹脂包埋后切成70 nm厚薄片放置在銅網(wǎng)上，復(fù)染后進(jìn)行透射電子顯微鏡觀察。采用免疫熒光染色檢測(cè)腎臟組織中免疫球蛋白(Ig)，包括IgA、IgG和IgM，并根據(jù)熒光強(qiáng)度，采用半定量方法進(jìn)行含量評(píng)估分析，總分為0～5分，分值越高，則Ig表達(dá)量越強(qiáng)，其中0分為陰性，1分為極弱陽性，2分為弱陽性，3分為中等陽性，4分為強(qiáng)陽性，5分為極強(qiáng)陽性。通過免疫熒光染色法對(duì)腎臟組織IgG亞型沉積情況進(jìn)行分析，包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。通過免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)腎臟組織中抗PLA2R抗體的表達(dá)情況，并根據(jù)染色陽性細(xì)胞百分比，分為高表達(dá)(≥50%陽性率)和低表達(dá)(<50%陽性率)。

結(jié) 果

1.兩組患者臨床資料比較：與陰性組比較，陽性組患者血清白蛋白水平更低、抗PLA2R抗體滴度更高(P<0.05)。但兩組患者性別、年齡、合并疾病、UPCR、總膽固醇、血清肌酐、eGFR、C5a水平和免疫抑制劑使用率比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 兩組患者臨床資料比較

2.血漿與腎臟組織中抗PLA2R抗體表達(dá)量的相關(guān)性分析結(jié)果：血漿與腎臟組織中抗PLA2R抗體表達(dá)具有較強(qiáng)的一致性(χ2=31.001，P<0.001)。見表2。

表2 血漿與腎臟組織中抗PLA2R抗體表達(dá)量的相關(guān)性分析

3.血漿抗PLA2R抗體滴度與UPCR的關(guān)系：Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示，血漿抗PLA2R抗體滴度與IMN患者的UPCR呈正相關(guān)(r=0.323，P=0.028)。但血漿C5a濃度與IMN患者的UPCR無明顯相關(guān)性(r=-1.023，P=0.362)。

4.血漿抗PLA2R抗體滴度與腎小球Ig沉積程度的相關(guān)性分析結(jié)果：根據(jù)腎臟病理活檢結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IgG強(qiáng)陽性(IgG評(píng)分4～5分)患者的PLAR2抗體滴度明顯高于IgG弱陽性患者[IgG評(píng)分0～3分，(154.32±24.21)RU/ml比(67.82±15.81)RU/ml，P=0.039]。對(duì)不同IgG亞型進(jìn)行分析，IgG1、IgG2、IgG3和IgG4亞型患者的血漿抗PLA2R抗體水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[(102.31±21.18)RU/ml、(98.26±25.01)RU/ml、(116.29±27.84)RU/ml及(108.39±15.20)RU/ml，P>0.05]。腎臟組織中IgA陰性與IgA陽性沉積患者的血漿抗PLA2R抗體水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[(103.9±21.2)RU/ml比(107.8±25.3)RU/ml，P>0.05]，且IgM陰性與IgM陽性沉積患者的血漿抗PLA2R抗體水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[(108.3±25.0)RU/ml比(105.2±21.7)RU/ml，P>0.05]。

5.影響IMN患者1年內(nèi)病情持續(xù)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素分析結(jié)果：抗PLA2R抗體陽性和未使用免疫抑制劑治療是影響IMN患者1年內(nèi)病情持續(xù)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)。見表3。

表3 影響IMN患者1年內(nèi)病情持續(xù)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素分析

討 論

Beck等[4]最早發(fā)現(xiàn)抗PLA2R抗體是IMN患者自身免疫性抗體的靶標(biāo)。隨后Hofstra等[8]研究發(fā)現(xiàn)抗PLA2R抗體與MN疾病活動(dòng)度相關(guān)。盡管有研究認(rèn)為抗PLA2R抗體與蛋白尿的嚴(yán)重程度無關(guān)[9]，但其與疾病緩解程度密切相關(guān)。本研究顯示抗PLA2R抗體與蛋白尿嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，血漿抗PLA2R抗體滴度與腎臟組織中的IgG沉積也密切相關(guān)。腎小球內(nèi)低IgG沉積表明免疫復(fù)合物形成較少，提示腎小球破壞和蛋白尿程度較低。

在自身抗體與足細(xì)胞抗原結(jié)合后，免疫復(fù)合物形成可啟動(dòng)補(bǔ)體系統(tǒng)激活，導(dǎo)致膜攻擊復(fù)合物插入足細(xì)胞，從而起到細(xì)胞毒性作用，進(jìn)而破壞過濾屏障產(chǎn)生蛋白尿。在補(bǔ)體激活過程中存在補(bǔ)體剪切產(chǎn)物產(chǎn)生。C3剪切成C5是經(jīng)典凝集素或補(bǔ)體替代途徑的最終共同途徑。剪切的補(bǔ)體片段可沉積在腎小球組織中如C3c，或釋放到外周循環(huán)中如C5a。更多自身抗體可能在腎臟組織中形成更多免疫復(fù)合物，刺激更多補(bǔ)體激活，并導(dǎo)致更嚴(yán)重蛋白尿。此外，C5a是一種強(qiáng)烈的炎癥激活物，可影響T淋巴細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞功能。本研究發(fā)現(xiàn)抗PLA2R抗體陰性組與陽性組C5a水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。血漿C5a水平反映了補(bǔ)體激活和器官清除而產(chǎn)生的平衡狀態(tài)。由于免疫復(fù)合物形成，在腎小球中產(chǎn)生的C5a可釋放到外周循環(huán)中，因此IMN患者血漿C5a水平明顯升高。由于C5a分子量較小，可輕易透過損傷腎小球而濾出。此外，血漿C5a可被高度血管化器官清除，或在腎小球中與炎癥或腎小球細(xì)胞一起被螯合而清除，因此本研究中并未發(fā)現(xiàn)抗PLA2R抗體陰性組與陽性組C5a水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

抗PLA2R抗體滴度是否與IMN患者預(yù)后相關(guān)目前尚無定論。Hoxha等[10]認(rèn)為抗PLA2R抗體滴度較高IMN患者的蛋白尿緩解周期明顯延長(zhǎng)。而Bech等[11]則認(rèn)為抗PLA2R抗體滴度不能有效評(píng)估IMN患者疾病預(yù)后情況。Medrano等[12]提出血漿抗PLA2R抗體滴度的改變?cè)缬诘鞍啄虻某霈F(xiàn)，且抗PLA2R抗體滴度下降與蛋白尿緩解存在時(shí)間滯后性。Tomas等[13]則進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)血漿高抗PLA2R抗體滴度與IMN患者腎功能的快速喪失有關(guān)。本研究也顯示了抗PLA2R抗體滴度的升高是IMN患者病情持續(xù)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，抗PLA2R抗體滴度升高與IMN患者的預(yù)后降低密切相關(guān)。

綜上所述，血漿抗PLA2R抗體滴度的升高可有效評(píng)估IMN患者疾病活動(dòng)度和預(yù)后，為IMN患者的治療和疾病活動(dòng)度動(dòng)態(tài)檢測(cè)提供了新的生物學(xué)標(biāo)志物。