基于流式細(xì)胞術(shù)的乳酸菌快速計(jì)數(shù)方法

□ 楊文奇 沈陽市食品藥品檢驗(yàn)所

在我國的食品檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)體系中，乳酸菌是包含乳桿菌屬、雙歧桿菌屬和嗜熱鏈球菌屬在內(nèi)的幾種不同屬細(xì)菌的統(tǒng)稱。其計(jì)數(shù)方法與細(xì)菌一致，如采用平板計(jì)數(shù)法、MPN法及免疫比色法等。但由于生化特征的差異，用于計(jì)數(shù)的培養(yǎng)基對(duì)不同菌群的選擇性不同，現(xiàn)有方法均存在不同程度的不足。在流式細(xì)胞術(shù)出現(xiàn)后，研究人員通過不斷探索，發(fā)現(xiàn)流式細(xì)胞術(shù)在細(xì)菌計(jì)數(shù)領(lǐng)域具有準(zhǔn)確性較高，且檢測(cè)速度快等優(yōu)勢(shì)，可以應(yīng)用于食品微生物檢測(cè)領(lǐng)域，并展示出其強(qiáng)大的技術(shù)優(yōu)勢(shì)。因此，在食品快速檢測(cè)技術(shù)不斷發(fā)展的今天，在食品安全檢測(cè)時(shí)限要求不斷提高的背景下，將流式細(xì)胞術(shù)應(yīng)用到食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)體系中的前景值得期待。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 儀器與試劑

Attune NxT流式細(xì)胞儀（美國Thermo Fisher公司）；1378Ⅱ級(jí)A2型生物安全柜（美國Thermo Fisher公司）；Heratherm IMH400—S電熱恒溫培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher公司）；SX—700壓力蒸汽滅菌器（日本Tomy公司）。

SYTO?24、碘化丙錠 PI、5—CFDA（美國Thermo Fisher公司）；磷酸鹽緩沖溶液PBS（北京陸橋技術(shù)股份有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

首先對(duì)預(yù)先接種保加利亞乳桿菌（LB）的過夜培養(yǎng)物進(jìn)行倍比稀釋處理，再應(yīng)用染色劑對(duì)100 μL稀釋菌液進(jìn)行染色處理[1]。為獲得染色效果良好的染色劑，使用不同的染色劑進(jìn)行染色，具體如下：① 10 μL SYTO?24；② 10μL PI；③ 10 μL 5—CFDA； ④ SYTO?24 和 PI各 10 μL； ⑤ SYTO?24 和 5—CFDA 各10 μL；⑥ PI和 5—CFDA 各 10 μL。用滅菌的PBS緩沖液對(duì)染色后的菌液定容至1 mL后，在37 ℃的條件下孵育15 min，置于流式細(xì)胞儀中計(jì)數(shù)。另取100 μL的稀釋菌液，按照平板計(jì)數(shù)法方法進(jìn)行操作，通過對(duì)比分析，明確流式細(xì)胞術(shù)在乳酸菌計(jì)數(shù)方面的檢測(cè)線性范圍。

同時(shí)，在流式細(xì)胞術(shù)計(jì)數(shù)方法中，為最大限度提高計(jì)數(shù)準(zhǔn)確性，本實(shí)驗(yàn)設(shè)定多個(gè)變量，根據(jù)流式圖結(jié)果明確最優(yōu)實(shí)驗(yàn)參數(shù)。設(shè)定的變量如下：①染色液濃度，SYTO?24設(shè)定為0.05、0.1、0.15 2 mmol/mL與0.2 mmol/mL 4個(gè)濃度梯度，PI設(shè)定為 5、10、15 μg/mL 與 20 μg/mL 4 個(gè) 濃 度 梯度；②孵育時(shí)間，設(shè)定為5、10、15 min；③上樣速度與讀取時(shí)間，上樣速度設(shè)定為30、60、90、120 μL/min與150 μL/min，讀取時(shí)間設(shè)定為30、60、90、120、150 s與 180 s；④儀器參數(shù)，調(diào)節(jié)流式細(xì)胞儀通道的增益和閾值參數(shù)，前側(cè)向散射光通道與熒光通道的增益電壓每次提升100，綠色熒光通道的閾值每次提升500。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

根據(jù)上述對(duì)比實(shí)驗(yàn)，可明確最佳的流式細(xì)胞術(shù)乳酸菌計(jì)數(shù)方法的各項(xiàng)參數(shù)，為該方法的推廣應(yīng)用提供幫助。在方案①～③的單染方案下，獲得的流式圖不含核酸顆粒，說明不能區(qū)分乳酸菌的活性，計(jì)數(shù)準(zhǔn)確性偏低；在雙熒光染色方案中，方案④和⑥）表現(xiàn)出生物性顆粒，基于PI染料的不能透膜特征，可準(zhǔn)確判斷細(xì)菌活性，正確計(jì)數(shù)。且由于方案⑥的兩種染料結(jié)合位點(diǎn)存在差異，因此，在流式細(xì)胞術(shù)乳酸菌計(jì)數(shù)中，可將SYTO?24和PI作為染料。

在不同染料濃度對(duì)比中，根據(jù)兩種染料不同濃度的流式圖對(duì)比，SYTO?24的濃度為0.1 mmol/L、PI的濃度為10 μg/mol時(shí)，計(jì)數(shù)效果最佳。

在不同孵育時(shí)間對(duì)比中，15 min下的流式圖細(xì)菌顆粒表現(xiàn)最為顯著，說明該時(shí)間下的計(jì)數(shù)較為準(zhǔn)確。

在不同上樣速度與讀取時(shí)間對(duì)比中，中速與高速熒光信號(hào)更為穩(wěn)定，以兩者為基礎(chǔ)進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，明確不同流速、時(shí)間對(duì)乳酸菌計(jì)數(shù)結(jié)果是否有影響，并對(duì)流速與時(shí)間進(jìn)行單因素方差分析，上樣速度為30 μL/min、讀取時(shí)間為180 s時(shí)，均值最大，即計(jì)數(shù)效果最佳。

在不同儀器參數(shù)對(duì)比中，增益優(yōu)化結(jié)果為：陽性區(qū)域起點(diǎn)置于1 000強(qiáng)度時(shí)，可全面檢測(cè)乳酸菌；在熒光強(qiáng)度設(shè)定為1 000強(qiáng)度時(shí)，區(qū)分度最大；閾值優(yōu)化結(jié)果如下：綠色熒光通道陽性區(qū)域?yàn)樽顑?yōu)閾值，參數(shù)設(shè)定為1 000。

按照上述參數(shù)，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)乳酸菌進(jìn)行計(jì)數(shù)，并與平板計(jì)數(shù)法對(duì)比。對(duì)比結(jié)果顯示，二者計(jì)數(shù)結(jié)果相差無幾，相關(guān)性系數(shù)為0.995 5，說明該計(jì)數(shù)方法可在食品檢測(cè)中推廣應(yīng)用。為明確該計(jì)數(shù)方法的檢出限，按照上述方法，選擇LB的過夜稀釋液為檢測(cè)對(duì)象，其余條件不變，將孵育時(shí)間縮短為3 min，獲得的活菌數(shù)即為最低檢出限，為3×108cells/mL。對(duì)于超過該數(shù)值的乳酸菌，需對(duì)其進(jìn)行稀釋處理，方可獲得準(zhǔn)確計(jì)數(shù)結(jié)果。

3 結(jié)論

綜上所述，流式細(xì)胞術(shù)在乳酸菌計(jì)數(shù)中具有計(jì)數(shù)效率高、計(jì)數(shù)準(zhǔn)確等優(yōu)勢(shì)，可推廣應(yīng)用。在應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行乳酸菌快速計(jì)數(shù)時(shí)，可選擇0.1 mmol/L的SYTO?24 和 10 μg/mol的PI作為染料，在37 ℃條件下對(duì)染色細(xì)菌液進(jìn)行15 min的孵育，置于流式細(xì)胞儀中計(jì)數(shù)，流式細(xì)胞儀的最佳條件為流速30 μL/min、讀取時(shí)間180 s、增益值與閾值設(shè)定為1 000。