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      白細胞介素-7 促進原發(fā)性腎病綜合征患兒外周血CD14+單核細胞活性

      2020-12-03 07:07:48馮仕品
      臨床兒科雜志 2020年11期
      關鍵詞:共培養(yǎng)單核細胞活化

      劉 君 馮仕品

      電子科技大學醫(yī)學院附屬婦女兒童醫(yī)院 成都市婦女兒童中心醫(yī)院兒童腎臟內科(四川成都 610017)

      兒童原發(fā)性腎病綜合征(idiopaticnephrotic syndrome,INS)是多種病因造成的腎小球基底膜通透性增高,導致蛋白從尿中排出,表現為大量蛋白尿、低蛋白血癥、水腫、高脂血癥及其他代謝紊亂[1]。INS的病因尚未完全闡明,目前認為免疫系統功能失調、系統性循環(huán)因子異常分泌、腎臟足細胞遺傳性結構異常等因素均參與了INS發(fā)病[1-2]。在非遺傳因素中,多種免疫細胞和細胞因子功能失調所造成的免疫紊亂是INS的重要誘因之一[3]。白細胞介素-7(interleukin-7,IL-7)主要通過IL-7受體α鏈(即CD127)發(fā)揮作用,IL-7/CD 127 信號通路調控并維持免疫細胞分化、發(fā)育和增殖,在感染、腫瘤、自身免疫性疾病中發(fā)揮重要作用[4]。IL-7還可增強肺癌患者CD14+單核細胞的抗原提呈功能,誘導CD4+T細胞活化[5]。既往研究發(fā)現,激素敏感型INS患兒血清IL-7水平升高,且與機體凝血功能密切相關[6-7]。但有關IL-7對INS患者免疫細胞的調節(jié)作用尚未見相關報道。因此,本研究利用體外細胞培養(yǎng)系統,觀察IL-7對INS患兒CD14+單核細胞活性的影響,初步探討IL-7在INS發(fā)病中的作用。

      1 對象與方法

      1.1 研究對象

      選擇2019年1月—2019年7月在成都市婦女兒童中心醫(yī)院兒童腎臟內科住院的INS患兒。研究對象入選標準:①年齡<16歲;②診斷符合中華醫(yī)學會兒科學分會腎臟病學組2016年指南[8],即24 h尿蛋白定量>50mg/(kg·d),血清膽固醇>5.7 mmol/L,血清白蛋白<30 g/L;③未經糖皮質激素治療;④排除慢性病毒感染、自身免疫性疾病、糖尿病、惡性腫瘤、重要臟器功能衰竭等疾病。選擇同時期在本院體檢中心接受健康查體的兒童作為對照組,入選標準:①年齡<16歲;②體檢健康,無遺傳代謝性疾病;③近半年內無其他疾病史。

      本研究方案通過成都市婦女兒童中心醫(yī)院倫理委員會批準,入組患兒法定監(jiān)護人簽署知情同意書。

      1.2 方法

      1.2.1 外周血單個核細胞分離 清晨空腹采集外周靜脈血20 mL,EDTA 抗凝。使用人外周血淋巴細胞分離液(北京索萊寶公司)、采用密度梯度離心法分離外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC),調整細胞濃度至2×107個/mL,加入含10%DMSO的胎牛血清(fetal bovine serum,FBS),液氮凍存?zhèn)溆谩?/p>

      1.2.2 CD 14+單核細胞和CD 4+T 細胞分選和培養(yǎng) 采用磁珠分選法、使用人CD 14 MicroBeads(德國美天旎公司)和人CD4+細胞分選試劑盒(德國美天旎公司)對PBMC中CD14+單核細胞和CD4+T細胞進行分選,操作按說明書要求進行。分選的細胞使用含10% FBS的RPMI 1640于37 ℃、5%CO2條件下進行培養(yǎng)。從33 例INS 組中選取10 例INS 患兒分選的105個CD14+單核細胞,接種于96孔板,設立4個復孔,其中2 個復孔加入培養(yǎng)液,另外2 個復孔加入重組人IL-7(25 μg/L,美國Peprotech公司)刺激培養(yǎng),12h后收集培養(yǎng)上 清。

      1.2.3 CD 14+單核與CD 4+T 細胞共培養(yǎng)系統建立 選擇17 例INS 患兒和7 例對照組純化的CD 14+單核細胞,加入的重組人IL-7(25 μg/L)刺激培養(yǎng)12h,洗滌后建立間接接觸和直接接觸共培養(yǎng)系統[9]。間接接觸培養(yǎng)系統:兩種細胞以1:1的比例分別接種于Transwell培養(yǎng)平板上層小室與下層培養(yǎng)孔中,向下層培養(yǎng)孔中加入抗CD3抗體(1 μg/L)。直接接觸培養(yǎng)系統:兩 種細胞以1:1的比例直接混合,加入抗CD3抗體(1 μg/L)。將CD4+T細胞單獨培養(yǎng)作為對照,培養(yǎng)48 h后收集細胞。另取8例INS患兒CD14+單核細胞 與自體CD 4+T細胞建立直接接觸共培養(yǎng)系統,向培養(yǎng)液中加入抗人IL-6 中和抗體(20 ng/mL,美國Invi vogen公司),培養(yǎng)最后12 h加入布雷非德菌素A(10μg/mL)。

      1.2.4 CD 127 表達以及CD 4+T 細胞分泌 干擾素-γ(IFN-γ)和IL-17的檢測采用流式細胞術檢測。PBMC 使用抗人CD-14-FITC 和抗人CD 127-PE 染色,4 ℃避光孵育30 min。CD14+單核細胞與CD4+T細胞 共培養(yǎng)的細胞加入抗人CD 4-PerCP 4 ℃避光孵育30 min,破膜后加入抗人IFN-γ-APC和抗人IL-17-PE,4 ℃避光孵育20 min。流式抗體購自美國BD公司。使用FACS Calibur流式細胞儀(美國BD公司)獲取細胞,FlowJo10.6軟件分析結果。

      1.2.5 CD 14+單核細胞CD 127 mRNA 檢測 采用實時定量PCR 進行檢測。105個CD 14+單核細胞使用RNA提取試劑盒(德國Qiagen公司)抽提總RNA,取1 μg 總RNA,使用PrimeScript 反轉錄試劑盒(北京寶日生物技術有限公司)進行反轉錄,-20 ℃保存cDNA。使用TB Green實時定量PCR試劑盒(北京寶日生物技術有限公司)進行PCR 反應。引物序列為,①CD 127 上游:5’-AAA GTT TTA ATG CAC GAT GTA GCT T-3’;CD127下游:5’-TGT GCT GGA TAA ATT CAC ATG C-3’。②GADPH上游:5’-GCA CCG TCA AGG CTG AGA AC-3’;GAPDH下游:5’-TGG TGA AGA CGC CAG TGG A-3’。每個樣本做3個重復,在ABI 7500實時定量PCR儀(美國Applied Biosystem公司)上進行檢測。

      1.2.6 培養(yǎng)上清中細胞因子表達檢測 采用酶聯免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)檢測。使用ELISA 檢測試劑盒檢測血清IL-7 水平、培養(yǎng)上清IL-1β、IL-6、IL-8、IL-12、IL-18、人單核細胞趨化蛋白-1(monocyte chemotactic protein-1,MCP-1)和人腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)水平。所有ELISA試劑盒均購自美國eBioscience公司,操作按說明書要求進行。

      1.3 統計學分析

      使用SPSS 17.0統計軟件進行數據分析。符合正態(tài)分布的計量資料以均數±標準差()表示,多組間比較采用裂區(qū)設計資料的方差分析或單因素方差分析,存 在差異后進一步兩組間比較采用SNK-q檢驗,兩組 間比較采用兩獨立樣本t檢驗或配對t檢驗;非正態(tài)分布計量資料以中位數(四分位數范圍)表示,組間比 較采用Wilcoxon 秩和檢驗。計數資料以百分比表示,組間比較采用χ2檢驗。以P<0.05 為差異有統計學意義。

      2 結果

      2.1 一般情況

      共納入INS組患兒33例,男23例、女10例,年齡3.0~13.0 歲,平均年齡(6.9±2.9)歲,發(fā)病時間7.0~30.0 d,平均病程(20.0±8.0)d,24 h 尿蛋白(4.1±1.8)g,血清白蛋白(20.0±6.0)g/L,膽固醇(6.8±1.4)mmol/L。其中24 例表現為單純型,9 例表現為腎炎型。對照組15 例,男11 例、女4 例,年齡4~14歲,平均年齡(7.9±2.5)歲。兩組性別構成、年齡、身高、體質量、體質指數比較差異均無統計學意義(P>0.05)。見表1。

      2.2 血清IL-7及CD14+單核細胞中CD127表達

      INS 患兒血清IL-7 水平高于對照組,差異具有統計學意義(P<0.05)。見表1。CD 14+單核細胞中CD 127 平均熒光強度(mean fluorescence intensity,MFI)的典型流式圖檢測見圖1。

      CD14+單核細胞中CD127 MFI和mRNA的相對表達量在對照組和INS患兒之間的差異均無統計學意義(P>0.05)。見表1。

      表1 對照組和INS患兒一般情況、血清IL-7及CD14+單核細胞中CD127表達比較

      圖1 CD14+單核細胞中CD127 平均熒光強度典型流式細胞檢測圖

      2.3 IL-7對CD14+單核細胞分泌炎癥細胞因子影響

      經IL-7 刺激的CD 14+單核細胞分泌IL-1 β、IL-6、IL-8、MCP-1和TNF-α的水平高于無IL-7刺激的CD 14+單核細胞,差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

      2.4 IL-7刺激對CD14+單核細胞誘導的CD4+ T細胞活化的影響

      使用IL-7 刺激CD 14+單核細胞后,分別建立CD 14+單核細胞與自體CD 4+T 細胞間接接觸和直接 接觸共培養(yǎng)系統,CD 4+T 細胞單獨培養(yǎng)為對照組。培養(yǎng)48 h后檢測CD4+T細胞分泌IFN-γ(Th1細胞) 和分泌IL-17(Th17細胞)的比例,典型流式散點圖見圖2。

      采用裂區(qū)設計的方差分析對INS 分選細胞和對照組分選細胞中Th1和Th17細胞比例的差異進行分析。培養(yǎng)方法作為一級處理因素,是否加入IL-7作為二級處理因素。INS分選細胞中,培養(yǎng)方法和是否加入IL-7兩因素的交互作用有統計學意義(FA×B=15.79、11.09,P<0.001),直接接觸培養(yǎng)中Th 1 和Th 17 細胞比例均高于間接接觸培養(yǎng)系統(FA=50.67、34.94,P<0.001),IL-7 對Th 1 和Th 17 細胞比例有影響(FB=23.68、17.27,P<0.001)。進一步分析發(fā)現,在間接接觸培養(yǎng)系統中,無IL-7刺激和經IL-7刺激Th1和Th17細胞比例與CD4+T細胞單獨培養(yǎng)的差異均無統計學意義(P>0.05),在直接接觸培養(yǎng)系統中,Th1和Th 17 細胞比例均顯著高于CD 4+T 細胞單獨培養(yǎng)(t=5.226、3.934,P<0.01);經IL-7 刺激后,Th 1 和Th17細胞比例顯著高于無IL-7刺激(t=3.544、3.548,P<0.01)。見表3。對照組分選的細胞中,培養(yǎng)方法和是否加入IL-7 兩因素的交互作用有統計學意義(FA×B=4.281、3.358,P<0.05),直接接觸培養(yǎng)中Th1和Th17細胞比例均高于顯著高于間接接觸培養(yǎng)系統(FA=14.82、7.934,P<0.01),IL-7對Th1和Th17細胞比例有影響(FB=3.814、5.638,P<0.05)。在直接接觸培養(yǎng)系統中,經IL-7刺激后,Th1和Th17細胞比例顯著高于無IL-7刺激(t=3.999、4.150,P<0.01)。見表3。

      2.5 抗IL-6抗體對IL-7介導INS患兒CD14+單核細胞誘導CD4+ T細胞活化的影響

      表2 IL-7刺激對INS患兒CD14+單核細胞分泌細胞因子影響(,pg·mL-1)

      表2 IL-7刺激對INS患兒CD14+單核細胞分泌細胞因子影響(,pg·mL-1)

      圖2 典型流式細胞檢測圖

      INS患兒CD14+單核細胞在IL-7刺激后,與自體CD 4+T 細胞直接接觸共培養(yǎng),并向培養(yǎng)液中加入抗人IL-6中和抗體。

      無刺激組、經抗IL-6 刺激組、經IL-7 刺激組、經IL-7+抗IL-6刺激組4組之間Th1比例差異有統計學意義(F=3.67,P<0.05)。兩兩比較發(fā)現,經IL-7 刺激組Th1比例均高于無刺激組和經IL-7+抗IL-6刺激組(P<0.05)。見表4。

      3 討論

      IL-7 在感染、腫瘤和自身免疫性疾病中均發(fā)揮重要的免疫調控作用,通過CD 127 介導的信號通路增強CD 8+T 細胞殺傷功能,促進病原體和腫瘤細胞的清除[10-11]。人類免疫缺陷病毒慢性感染患者接受IL-7治療可降低血漿可溶性CD14表達,提示IL-7可降低機體系統性炎癥[12]。相反,IL-7外顯子5缺陷基因編碼的蛋白刺激可誘導CD 14+單核細胞促炎因子表型,增加脂類代謝相關基因表達[13]。本研究發(fā)現,INS患兒外周血IL-7表達升高,這與既往的研究結果一致[6-7]。但IL-7對INS患兒CD14+單核細胞調控作用的研究較少。本研究發(fā)現,CD14+單核細胞表面的模型CD127蛋白和總CD127(模型和可溶型)mRNA相對表達量在對照組和INS患兒之間的差異無統計學意義,與在肝癌患者中的研究結果一致[14],提示炎癥和腫瘤均未改變單核細胞中CD127的表達,INS患兒CD14+單核細胞對IL-7的反應性升高與CD127水平無關。而IL-7刺激可促進INS患兒CD14+單核細胞分泌炎癥細胞因子,提示INS患兒中升高表達的IL-7可增強CD14+單核細胞促炎功能,誘導INS病程中的炎癥應答,促進疾病進展。

      在類風濕性關節(jié)炎患者中,CD 14+單核細胞可誘導CD 4+T 細胞活化的過程依賴兩種細胞的直接接觸[5]。本研究發(fā)現,CD14+單核細胞在間接接觸共培養(yǎng)系統中不能誘導Th 1 和Th 17 的表型活化,僅在CD 14+單核細胞和CD 4+T 細胞直接接觸的條件下,CD 14+單核細胞才能有效介導INS 患兒CD 4+T 細胞 向Th 1 和Th 17 細胞的活化,這與既往的研究結果一致[5,9,15]。提示CD14+單核細胞主要通過其抗原提呈功能誘導CD 4+T 細胞活化,但細胞因子分泌在這一過程中是否發(fā)揮作用尚不清楚。由于IL-7主要通過促進IL-6分泌誘導病毒特異性CD8+T細胞和濾泡輔助性T 細胞的活性[10,16],而本研究發(fā)現,在INS 患兒中,IL-7均可增強CD14+單核細胞誘導的CD4+T細胞活化,說明IL-7可促進CD14+單核細胞功能。而抗IL-6中和抗體可抑制IL-7誘導的CD14+單核細胞對CD4+T細胞的調控作用,提示在INS患兒中,CD14+單核細胞對CD4+T細胞的調控作用亦有賴于IL-6的分泌。然而本研究具有一定局限性,未設立治療前后INS 患兒的對比,因此,IL-7 對INS 患兒CD 14+單核細胞的調控機制仍有待深入探討。

      綜上,INS 患兒升高表達的IL-7 可促進CD 14+單核細胞分泌炎癥細胞因子,IL-7 刺激的CD 14+單核細胞可能通過直接接觸和分泌IL-6 誘導INS 患兒CD4+T細胞活化,提示IL-7可增強CD14+單核細胞的功能,在INS 中發(fā)揮促進炎癥影響、誘導疾病進展的作用。

      表3 IL-7刺激對INS患兒CD14+單核細胞誘導Th1和Th17細胞活化影響(,%)

      表3 IL-7刺激對INS患兒CD14+單核細胞誘導Th1和Th17細胞活化影響(,%)

      注:1)與CD4+單獨培養(yǎng)比較,P<0.05;2)與CD4+/CD14+直接接觸無IL-7刺激比較,P<0.05;3)一級處理因素;4)二級處理因素;5)一級處理因素和二級處理因素的交互作用

      表4 抗IL-6抗體對IL-7介導的CD14+單核細胞誘導Th1/Th17活化影響(,%)

      表4 抗IL-6抗體對IL-7介導的CD14+單核細胞誘導Th1/Th17活化影響(,%)

      注:1)與無刺激組比較,P<0.05;2)與經IL-7刺激組比較,P<0.05

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