陳明威 魏 明 陶良凡 錢(qián)森和

(安徽工程大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院，安徽 蕪湖 241000)

霍山石斛(DendrobiumhuoshanenseC. Z. Tang et S. J. Cheng)俗稱(chēng)米斛，為蘭科石斛屬植物，是珍稀藥用植物，具有滋陰養(yǎng)胃、清音明目和養(yǎng)顏駐容等功效[1]。大量研究[2-5]表明，石斛含有多糖、石斛堿和酚類(lèi)物質(zhì)等有效成分，具有抗癌、抗白內(nèi)障、抗氧化、降血糖等作用。酚類(lèi)物質(zhì)是植物的次生代謝產(chǎn)物，具有抗腫瘤、抗菌、抗病毒、抗氧化等活性[6-7]。目前，對(duì)石斛多糖、石斛堿等活性成分研究較多，但對(duì)石斛中酚類(lèi)物質(zhì)的研究較少。

石斛中含有大量酚類(lèi)物質(zhì)。體外試驗(yàn)表明，石斛中的酚類(lèi)物質(zhì)具有較強(qiáng)的抗氧化活性[8-10]。目前已從霍山石斛[10]、鐵皮石斛[9]和金釵石斛[8]中提取了石斛粗多酚酚類(lèi)物質(zhì)，粗多酚含有糖類(lèi)、蛋白質(zhì)等成分，這些成分對(duì)其活性研究會(huì)造成干擾。植物多酚的分離純化常用的方法有溶劑萃取、離子沉淀、膜分離、超臨界萃取和層析分離等。其中大孔樹(shù)脂具有良好的選擇性、吸附量大、操作簡(jiǎn)便且成本低等特點(diǎn)，被廣泛用于天然產(chǎn)物的分離[11]。目前，利用大孔樹(shù)脂分離純化霍山石斛多酚還未見(jiàn)報(bào)道。

樹(shù)脂極性、顆粒大小以及表面積大小均能影響酚類(lèi)物質(zhì)的分離效果[12]。研究擬以霍山石斛粗多酚為原料，通過(guò)比較不同樹(shù)脂對(duì)石斛中酚類(lèi)物質(zhì)吸附和解吸特性，篩選適合的樹(shù)脂，優(yōu)化分離工藝參數(shù)，并探討多酚的抗氧化性，旨在為石斛多酚的分離純化和結(jié)構(gòu)鑒定以及功能性食品的開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

霍山石斛：安徽工程大學(xué)組培室；

D101型、AB-8型、HZ-841型、NKA-9型、ADS-7型大孔樹(shù)脂：鄭州和成新材料科技有限公司；

L-抗壞血酸、鐵氰化鉀、磷酸緩沖液、三氯化鐵、Tris-HCl、鄰苯三酚、三氯甲烷、無(wú)水乙醇、無(wú)水碳酸鈉、鹽酸和氫氧化鈉：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

Folin-Ciocalteau酚試劑：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

沒(méi)食子酸：分析純，阿拉丁試劑(上海)有限公司。

1.2 儀器設(shè)備

電子天平：ZA2204B型，上海佑科儀器儀表有限公司；

循環(huán)水式多用真空泵：SHB-ⅢS型，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；

紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：UV745型，上海光譜儀器有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：RE52-AA型，上海亞榮生化儀器廠；

高速冷凍離心機(jī)：TGL-16M型，湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司；

恒流泵：BT1-100型，上海琪特分析儀器有限公司；

自動(dòng)部分收集器：BSZ-100型，上海琪特分析儀器有限公司；

真空冷凍干燥機(jī)：LGJ型，北京松源華興科技發(fā)展有限公司；

高效液相色譜儀：LC-20A型，日本島津公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 霍山石斛粗多酚的制備 霍山石斛鮮條研磨后，用蒸餾水以料液比m料∶m水=1∶60 (g/mL)、提取溫度60 ℃條件下浸提40 min，抽濾后濃縮，濃縮液用80%乙醇溶液醇沉除去多糖、蛋白，抽濾，取上清液濃縮后備用。

1.3.2 多酚的測(cè)定 參照文獻(xiàn)[13]。以沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)，沒(méi)食子酸與福林酚試劑在堿性條件下反應(yīng)后的吸光度(A765 nm)為縱坐標(biāo)，建立沒(méi)食子酸濃度與吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程為：Y=9.36X+0.004 2，R2=0.999 3。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算其多酚類(lèi)化合物質(zhì)量濃度。

1.3.3 大孔樹(shù)脂的篩選 所有樹(shù)脂在使用前參照文獻(xiàn)[14]的方法進(jìn)行預(yù)處理。分別稱(chēng)取經(jīng)預(yù)處理后的D101、AB-8、HZ-841、NKA-9、ADS-7型大孔樹(shù)脂各1.0 g于100 mL 錐形瓶中，加入15 mL濃度為2.0 mg/mL的霍山石斛多酚粗提液，在25 ℃，120 r/min恒溫振蕩?kù)o態(tài)吸附4 h，然后吸取上清液測(cè)定多酚的量，并計(jì)算其吸附量和吸附率。將吸附飽和的大孔樹(shù)脂過(guò)濾，然后放入到三角瓶中，加入50%的乙醇15 mL，用保鮮膜將錐形瓶瓶口封住避免乙醇揮發(fā)，放入恒溫振蕩培養(yǎng)箱在25 ℃，120 r/min 條件下振蕩解吸4 h，然后吸取上清液測(cè)定多酚的量，并計(jì)算解吸率。通過(guò)不同樹(shù)脂的吸附率和解吸率確定適合的樹(shù)脂。

(1)

(2)

(3)

式中：

Q——大孔樹(shù)脂對(duì)多酚的吸附量，mg/g；

R1——大孔樹(shù)脂對(duì)多酚的吸附率，%；

R2——洗脫液對(duì)大孔樹(shù)脂中多酚的解吸率，%；

C0——多酚初始濃度，mg/mL；

C1——靜態(tài)吸附完全后上清液中多酚的濃度，mg/mL；

C2——解吸完全后乙醇溶液中的多酚濃度，mg/mL；

V——加入的多酚溶液體積，mL；

m——錐形瓶中加入大孔樹(shù)脂的質(zhì)量，g。

1.3.4 靜態(tài)吸附和解吸試驗(yàn)

(1) 大孔樹(shù)脂靜態(tài)吸附的動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)：分別稱(chēng)取AB-8型大孔樹(shù)脂1.0 g于6個(gè)100 mL的錐形瓶中，各加入多酚粗提液15 mL，每30 min測(cè)定一次上清液中多酚的濃度，計(jì)算其吸附量、吸附率。

(2) 多酚樣品濃度對(duì)吸附量的影響：分別稱(chēng)取AB-8型大孔樹(shù)脂1.0 g于6個(gè)100 mL的錐形瓶中，依次加入0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 mg/mL的多酚粗提液15 mL，在25 ℃，120 r/min恒溫震蕩?kù)o態(tài)吸附150 min，然后測(cè)定多酚含量，并計(jì)算其吸附量和吸附率。

(3) 樣品pH對(duì)樹(shù)脂吸附量的影響：分別稱(chēng)取AB-8型大孔樹(shù)脂1.0 g于6個(gè)100 mL的錐形瓶中，依次加入15 mL的不同pH的多酚粗提液(pH 3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0)，在25 ℃，120 r/min恒溫震蕩?kù)o態(tài)150 min，然后測(cè)定多酚含量，并計(jì)算其吸附量和吸附率。

(4) 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)樹(shù)脂靜態(tài)解吸率的影響：按上述最佳條件吸附多酚至飽和，并計(jì)算其吸附量，然后抽濾，分別加入體積分?jǐn)?shù)為10%，20%，30%，40%，50%，60%的乙醇溶液進(jìn)行洗脫，測(cè)定上清液中多酚含量，計(jì)算其解吸率。

1.3.5 動(dòng)態(tài)吸附和解吸試驗(yàn)

(1) 上樣流速對(duì)大孔樹(shù)脂吸附量的影響：將經(jīng)過(guò)預(yù)處理后的AB-8型大孔樹(shù)脂填充到1.6 cm×60 cm的色譜柱中，填充后樹(shù)脂床直徑為1.6 cm，高50 cm。平衡后，多酚的濃度為2.0 mg/mL，分別以1.0，2.0，3.0，4.0 mL/min的流速進(jìn)行上樣吸附，收集流出液，每一管4 mL，測(cè)定流出液的體積和多酚濃度。檢測(cè)流出液中多酚的泄漏量，泄漏量達(dá)到進(jìn)樣濃度的10%為吸附終點(diǎn)，計(jì)算其最大吸附量。

(2) 乙醇流速對(duì)大孔樹(shù)脂動(dòng)態(tài)洗脫的影響：吸附飽和的AB-8大孔樹(shù)脂，用50%的乙醇溶液分別以1.0，2.0，3.0，4.0 mL/min的流速進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，每一管4 mL，測(cè)定流出液的體積和多酚濃度，并計(jì)算解吸率。

1.3.6 AB-8型大孔樹(shù)脂梯度洗脫

(1) 將經(jīng)過(guò)預(yù)處理后的AB-8型大孔樹(shù)脂填充到1.6 cm×60 cm的色譜柱中，按上述條件，對(duì)霍山石斛多酚進(jìn)行上樣處理，再用蒸餾水洗脫，洗去粗多酚中殘留的還原糖等雜質(zhì)，之后用乙醇進(jìn)行梯度洗脫，洗脫梯度設(shè)置10%為一個(gè)梯度，收集并測(cè)定流出液多酚的濃度，直至霍山石斛多酚洗脫完全。

(2) 梯度洗脫組分高效液相色譜分析：Zorbox SB-C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；柱箱溫度30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm；進(jìn)樣量 10 μL。流動(dòng)相A為100%甲醇，流動(dòng)相B為0.2%乙酸水溶液；流速1 mL/min。梯度洗脫條件為：0～8 min流動(dòng)相A 5%～8%，8～12 min流動(dòng)相A 8%～15%，12～17 min流動(dòng)相A 15%～22%，17～25 min 流動(dòng)相A 22%～50%，25～33 min流動(dòng)相A 50%～60%，33～50 min流動(dòng)相A 60%～5%，總的運(yùn)行時(shí)間51 min。

1.3.7 霍山石斛多酚的體外抗氧化試驗(yàn)

(1) 超氧陰離子清除能力測(cè)定：參照文獻(xiàn)[15]，按式(4) 計(jì)算超氧陰離子的清除率。

(4)

式中：

Q1——超氧陰離子的清除率，%；

A1——三(羧甲基)氨基甲烷+樣品+鄰苯三酚+鹽酸的吸光度；

A2——三(羧甲基)氨基甲烷+樣品+鹽酸的吸光度；

A3——三(羧甲基)氨基甲烷+鄰苯三酚+鹽酸的吸光度。

(2) 總還原力測(cè)定：參照文獻(xiàn)[16]，按式(5)計(jì)算總還原力。

A0=A1-A2，

(5)

式中：

A0——樣品的總還原力；

A1——樣品+磷酸鹽緩沖液+鐵氰化鉀+三氯乙酸+三氯化鐵的吸光度；

A2——蒸餾水+磷酸鹽緩沖液+鐵氰化鉀+三氯乙酸+三氯化鐵的吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)重復(fù)3次，采用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并比較所得數(shù)據(jù)之間的顯著差異性(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 大孔樹(shù)脂的篩選

如表1所示，5種大孔樹(shù)脂對(duì)石斛多酚具有較強(qiáng)的吸附能力，弱極性大孔樹(shù)脂AB-8和HZ-841型對(duì)石斛多酚的吸附量較高，隨著樹(shù)脂極性的增強(qiáng)，其吸附率有所下降，說(shuō)明大孔樹(shù)脂對(duì)石斛多酚具有較好的選擇性。大部分的樹(shù)脂解吸率較高，其中AB-8樹(shù)脂解吸率達(dá)到94.08%。綜合各型號(hào)樹(shù)脂的吸附—解吸結(jié)果，選用AB-8型大孔樹(shù)脂對(duì)霍山石斛多酚進(jìn)行純化。

2.2 靜態(tài)吸附和解吸試驗(yàn)

2.2.1 AB-8大孔樹(shù)脂靜態(tài)吸附霍山石斛多酚的動(dòng)力學(xué)

由圖1可知，大孔樹(shù)脂對(duì)霍山石斛多酚的吸附量隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，在30～150 min時(shí)，大孔樹(shù)脂對(duì)多酚的吸附量逐漸增加，在150 min時(shí)吸附量達(dá)到最大，說(shuō)明在該時(shí)間段內(nèi)，樹(shù)脂對(duì)多酚類(lèi)的吸附仍處在持續(xù)進(jìn)行的狀態(tài)，在150 min之后繼續(xù)吸附，吸附量不再增加，說(shuō)明大孔樹(shù)脂對(duì)多酚的吸附已經(jīng)達(dá)到飽和。

2.2.2 pH對(duì)大孔樹(shù)脂靜態(tài)吸附的影響 多酚類(lèi)化合物含有羥基[17]，pH值影響酚類(lèi)物質(zhì)在溶液中的狀態(tài)，進(jìn)而影響其與溶劑間的作用。如圖2所示，在一定pH值范圍內(nèi)，隨著pH值的增大，大孔樹(shù)脂的吸附量呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，當(dāng)pH>4時(shí)，大孔樹(shù)脂的吸附量逐漸降低。這是由于在弱酸性環(huán)境下，多酚類(lèi)化合物以分子狀態(tài)存在，而當(dāng)pH值過(guò)高時(shí)，加速了酚羥基電離，產(chǎn)生了相應(yīng)的陰離子，導(dǎo)致酚類(lèi)物質(zhì)與大孔樹(shù)脂間的氫鍵作用減弱，從而降低了大孔樹(shù)脂對(duì)多酚的吸附能力，導(dǎo)致吸附量減少[18]。

表1 大孔樹(shù)脂型號(hào)對(duì)石斛多酚的靜態(tài)吸附和解吸的影響

圖1 AB-8樹(shù)脂吸附霍山石斛多酚的動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)

2.2.3 多酚濃度對(duì)大孔樹(shù)脂靜態(tài)吸附的影響 如圖3所示，多酚濃度對(duì)樹(shù)脂吸附性能具有顯著影響，當(dāng)多酚濃度為0.5～2.0 mg/mL時(shí)，隨著多酚濃度的增加，AB-8樹(shù)脂吸附能力增強(qiáng)。這可能因?yàn)樵谝欢舛认?，大孔?shù)脂更有利于與酚類(lèi)化合物分子接觸，從而能夠吸附更多的酚類(lèi)化合物。而當(dāng)多酚濃度>2.0 mg/mL時(shí)，隨著多酚濃度的增加，大孔樹(shù)脂的吸附量反而減少，這是由于當(dāng)溶液中酚類(lèi)化合物濃度過(guò)高，酚類(lèi)化合物分子間相互作用產(chǎn)生絮凝現(xiàn)象，阻塞樹(shù)脂孔洞，不利于樹(shù)脂對(duì)酚類(lèi)化合物的吸附，因此，多酚濃度為2.0 mg/mL較為適宜。

2.2.4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)AB-8大孔樹(shù)脂靜態(tài)解吸霍山石斛多酚的影響 由圖4可知，乙醇溶液可從AB-8樹(shù)脂中有效地將霍山石斛多酚解吸出來(lái)，且其對(duì)霍山石斛多酚的解吸性能與乙醇溶液的體積分?jǐn)?shù)有關(guān)，隨著乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)的增長(zhǎng)，其對(duì)霍山石斛多酚的解吸率亦呈現(xiàn)增長(zhǎng)趨勢(shì)，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%時(shí)，對(duì)霍山石斛多酚的解吸率最大為94.56%，繼續(xù)增大乙醇溶劑的體積分?jǐn)?shù)，解吸率略有降低。這是因?yàn)橐掖既芤旱捏w積分?jǐn)?shù)較低時(shí)，其相對(duì)極性較強(qiáng)，解吸率較低，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%時(shí)，極性較為適中，解吸率最高；隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，極性降低，解吸率又有所下降。

圖2 樣品pH值對(duì)AB-8樹(shù)脂吸附能力的影響

圖3 樣品濃度對(duì)大孔樹(shù)脂吸附能力的影響

2.3 動(dòng)態(tài)吸附和解吸試驗(yàn)

2.3.1 上樣流速對(duì)大孔樹(shù)脂吸附性能的影響 如圖5所示，上樣流速對(duì)AB-8吸附多酚影響較大，當(dāng)上樣濃度一定時(shí)，隨著上樣流速的增大，則泄漏點(diǎn)出現(xiàn)得越早。當(dāng)上樣流速分別為1.0，2.0，3.0，4.0 mL/min時(shí)，泄漏點(diǎn)分別出現(xiàn)在276，260，248，236 mL附近。此時(shí)的吸附量分別為537.83，507.05，482.73，460.04 mg。樣品流速越慢，泄漏點(diǎn)出現(xiàn)的越晚，吸附量也較大，但上樣時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，工作效率降低。綜合考慮，上樣流速為1.0～2.0 mL/min時(shí)較為適宜。

2.3.2 乙醇洗脫流速對(duì)解吸的影響 由圖6可知，隨著洗脫液的流出，多酚逐漸被洗脫出來(lái)，乙醇溶液在不同流速下對(duì)多酚的洗脫效果均較好。流速越快，多酚越早被洗出，但洗脫峰有拖尾現(xiàn)象，流速慢，洗脫曲線(xiàn)峰較為集中，多酚溶液濃度較高，洗脫液收集區(qū)間為100～200 mL。因此，洗脫流速為1 mL/min較為適宜。

2.4 乙醇梯度洗脫和高效液相色譜分析

如圖7所示，蒸餾水洗脫未檢測(cè)到酚類(lèi)物質(zhì)，而在10%，20%，30%和40%濃度下得到了4個(gè)洗脫組分，分別為DHP-1，DHP-2，DHP-3和DHP-4。通過(guò)高效液相色譜分析(圖8)，4個(gè)洗脫組分的含量分別為16.3%，14.8%，20.9%，26.2%，經(jīng)樹(shù)脂處理后4個(gè)組分的總多酚純度為76.2%。

圖4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)AB-8樹(shù)脂解吸多酚的影響

圖5 上樣流速對(duì)AB-8樹(shù)脂吸附能力的影響

圖6 乙醇流速對(duì)動(dòng)態(tài)解吸AB-8樹(shù)脂中霍山石斛多酚的影響

圖7 AB-8樹(shù)脂的乙醇梯度洗脫圖譜

圖8 粗多酚和梯度洗脫組分的高效液相色譜圖譜

2.5 霍山石斛多酚的體外抗氧化能力

2.5.1 超氧陰離子的清除 超氧陰離子過(guò)多會(huì)對(duì)機(jī)體的DNA和蛋白質(zhì)等造成損傷[19]，有效清除機(jī)體中過(guò)多超氧陰離子等活性氧是開(kāi)發(fā)功能性食品的關(guān)鍵。如圖9所示，隨著樣品濃度的增加，多酚各個(gè)組分對(duì)超氧陰離子的清除能力也越強(qiáng)，當(dāng)濃度達(dá)到0.4 mg/L時(shí)，各個(gè)多酚組分之間的清除能力差異較為明顯，且趨于穩(wěn)定，其中DHP-1組分與同濃度的維生素C相比，差異性不顯著(P>0.05)，說(shuō)明霍山石斛多酚組分具有較強(qiáng)的清除超氧陰離子的能力，且其清除能力依次為DHP-3>DHP-4>DHP-1>DHP-2>粗多酚。DHP-3對(duì)超氧陰離子能力接近維生素C，可以作為很好的抗氧化劑，開(kāi)發(fā)功能性食品。

2.5.2 霍山石斛多酚總還原力的比較 如圖10所示，在整個(gè)還原力指標(biāo)中，4個(gè)多酚分離組分之間的還原力差異較為明顯，且其還原力大小依次為DHP-3>DHP-4>DHP-1>DHP-2>粗多酚。相比于維生素C，還原力的差異性較為顯著。

圖9 多酚組分對(duì)超氧陰離子的清除率

3 結(jié)論

通過(guò)靜態(tài)吸附和解吸試驗(yàn)篩選出了適于霍山石斛多酚分離純化的樹(shù)脂AB-8，其最佳分離純化工藝條件為：靜態(tài)吸附150 min 即達(dá)到飽和，多酚溶液pH 4.0，濃度2.0 mg/mL，上樣流速1.0 mL/min；洗脫流速1.0 mL/min。通過(guò)10%，20%，30%，40%的乙醇溶液的梯度洗脫，獲得了4個(gè)洗脫組分，分別為DHP-1、DHP-2、DHP-3、DHP-4，其含量分別為16.3%，14.8%，20.9%，26.2%，總酚的純度達(dá)到76.2%；霍山石斛多酚的抗氧化能力較為顯著，各組分抗氧化活性由大到小依次為DHP-3>DHP-4>DHP-1>DHP-2>粗多酚，且隨著樣品濃度的增加，總的還原力和對(duì)超氧陰離子清除能力逐漸增加，呈明顯的濃度相關(guān)性。但4個(gè)洗脫組分的多酚具體成分組成還有待進(jìn)一步研究。

圖10 多酚總還原力的比較