費(fèi) 鵬 邢 敏 焦超芹 楊寶鑫 胡新穎邵安冉 蘆 淋 康懷彬 郭 鸰

(1. 河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽 471023；2. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150030)

大腸桿菌(Escherichiacoli)又稱大腸埃希氏菌，是一種革蘭氏陰性、無芽孢、兼性厭氧的食源性條件致病菌，廣泛存在于蔬菜、水果、外界環(huán)境以及牛肉、雞肉、牛奶等動(dòng)物源食品中[1-2]。該微生物為條件致病菌，一般條件下不致病，但某些特殊血清型的大腸桿菌可引起人或動(dòng)物嘔吐、腹瀉、敗血癥等，嚴(yán)重者可導(dǎo)致患者死亡[3]。目前，關(guān)于大腸桿菌污染食品及加工環(huán)境的報(bào)道已被大量報(bào)道[4-7]，因此，如何有效預(yù)防和控制大腸桿菌對食品的污染是亟待解決的問題。

人們常在食品的運(yùn)輸、加工等過程中添加化學(xué)合成防腐劑以抑制或殺滅病原微生物來延長食品的貨架期，保證食品質(zhì)量[8]。但隨著食源性致病菌耐藥性的增強(qiáng)及化學(xué)防腐劑對人體健康造成的不良影響，使得越來越多的研究者開始傾向于利用植物源活性物質(zhì)作為天然的抑菌劑發(fā)揮殺菌功效[9-10]。胎菊是杭白菊上品的一種，富含揮發(fā)油類、酚類、黃酮類化合物等活性成分，具有抗腫瘤、抗菌、抗氧化、降血壓等生物活性[11]。黃涵年[12]通過牛津杯法測定了杭白菊總黃酮提取物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌及單核細(xì)胞增生李斯特菌的抑菌效果，結(jié)果表明杭白菊總黃酮提取物對4種供試菌均有一定的抑制作用。呂都[13]發(fā)現(xiàn)杭白菊揮發(fā)油對大腸桿菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、枯草芽孢桿菌均有一定的抑菌活性，其最小抑菌濃度為0.325%～1.300%。上述研究表明胎菊提取物對食源性致病菌具有一定的抑菌效果，然而，其可能的抑菌機(jī)理和應(yīng)用并未被深入挖掘。

研究擬以大腸桿菌為供試菌株，以水為溶劑對胎菊進(jìn)行提取，并評估胎菊水提物對大腸桿菌的抑菌效果；通過檢測胎菊水提物對大腸桿菌生長曲線、胞內(nèi)ATP濃度、膜電位、細(xì)胞形態(tài)的影響揭示其可能的抑菌途徑；將胎菊水提物應(yīng)用于熟豬肉的保藏中，以期為開發(fā)一種新的天然防腐劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

胎菊：藝福堂菊博士胎菊，產(chǎn)自浙江省桐鄉(xiāng)市胎菊生產(chǎn)基地，80 g，洛陽大張超市；

豬肉：試驗(yàn)所用豬肉為當(dāng)天屠宰的豬的冷鮮里脊肉，洛陽大張超市；

大腸桿菌(Escherichiacoli)O157：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院菌種庫；

大腸桿菌分離菌株2020-1、2020-2、2018-4、2018-5、2020-3、2019-8：分別從牛肉、雞肉、黑芝麻糊及設(shè)備表面分離得到；

胰蛋白胨大豆瓊脂(tryptone soya agar，TSA)、溶菌肉湯培養(yǎng)基(Luria-Bertani，LB)：青島海博生物有限公司；

乙醇、戊二醛、餓酸、氫氧化鈉等：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

ATP試劑盒：碧云天生物科技有限公司；

十二烷基琥珀酸酐、DiBAC4(3)熒光探針：索萊寶生物科技有限公司。

1.2 主要儀器設(shè)備

精密電子天平：Pl203型，梅特勒—托利多儀器有限公司；

生物超凈工作臺：Bcn-1360型，上海佳勝儀器制造有限公司；

離心機(jī)：GL-21M型，上海市離心機(jī)械研究所；

電熱恒溫培養(yǎng)箱：DHP-9272型，上海一恒科技有限公司；

高壓蒸汽滅菌鍋：LDZY-50kB-Ⅲ型，上海申安醫(yī)療器械廠；

多功能酶標(biāo)儀：Tecan Infinite 200 PRO型，北京普天新橋技術(shù)有限公司；

紫外分光光度計(jì)：DU-800型，美國Beckman公司；

透射電鏡：H-7650型，日本日立公司；

色差計(jì)：Color meter ZE 6000型，上海過望化工有限公司。

1.3 方法

1.3.1 胎菊水提物的制備 參照張赟等[14]的方法。將胎菊粉碎成粉，過82目篩，以水為溶劑，在70 ℃、料液比(V水∶V胎菊)為1∶30 (g/mL)的條件下浸提80 min，收集濾渣，并在相同條件下重復(fù)浸提2次，合并所有濾液，40 ℃ 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)進(jìn)行濃縮以得到胎菊水提物濃縮液，最后使用真空冷凍干燥裝置將其干燥成粉末，冰箱冷藏備用。

1.3.2 受試菌株 參照呂都[13]的方法對大腸桿菌O157和其他5株大腸桿菌進(jìn)行活化，上述6種菌均用于胎菊水提物抑菌活性的評估中，而大腸桿菌O157用于抑菌機(jī)理的探索和熟豬肉保藏的應(yīng)用。

1.3.3 抑菌圈直徑(DIZ)的測定 采用牛津杯法[15]。無菌條件下吸取100 μL濃度為107CFU/mL的菌懸液并涂布在TSA平板上，將3個(gè)無菌牛津杯均勻地插入培養(yǎng)基，并向每個(gè)牛津杯中加入200 μL濃度為10 mg/mL的胎菊水提物溶液，在37 ℃下培養(yǎng)24 h后測量抑菌圈直徑。抑菌圈直徑大小所代表的含義為：直徑>20 mm，表示菌種對抑菌劑極敏感；15～20 mm為高度敏感；10～14 mm 為中度敏感；7～9 mm為低敏；<6 mm為不敏感[16]。

1.3.4 最小抑菌濃度(MIC)、最小殺菌濃度(MBC)的測定 MIC與MBC分別指抑制細(xì)菌生長及殺滅細(xì)菌的最低濃度。根據(jù)Fei等[17]的方法。將滅菌后冷卻至50 ℃的TSA培養(yǎng)基加入到24孔板中，加入胎菊水提物并調(diào)整質(zhì)量濃度為2.5，5.0，10.0，20.0，40.0，80.0 mg/mL，每孔終體積為500 μL，對照組使用0.1 mg/mL的氨芐青霉素處理。培養(yǎng)基凝固后，在各孔中央接種2 μL濃度為108CFU/mL的菌懸液，在37 ℃下培養(yǎng)24 h后觀察大腸桿菌生長情況，MIC值為肉眼看不見細(xì)菌生長的最低濃度。制備100 μL菌懸液(108CFU/mL)，經(jīng)過≥1.0 MIC的胎菊水提物處理1 h后再進(jìn)行培養(yǎng)，使菌落無法長出的最低濃度即為MBC值。

1.3.5 生長曲線測定 根據(jù)Shi等[18]的方法。用LB培養(yǎng)基稀釋菌懸液，使其OD600 nm為0.2。向25 μL菌懸液中加入胎菊水提物，使其質(zhì)量濃度分別為0.5 MIC、1.0 MIC、1.5 MIC和2.0 MIC，并調(diào)整終體積為250 μL，未添加胎菊水提物的菌液作為對照。在37 ℃下培養(yǎng)24 h，每隔2 h 取出菌液，使用酶標(biāo)儀檢測其吸光值。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制生長曲線。

1.3.6 胞內(nèi)ATP含量的測定 根據(jù)Sánchez等[19]的方法。取2 mL菌懸液(OD600 nm=0.5)，并加入胎菊水提物，使胎菊水提物終質(zhì)量濃度分別為0 MIC(對照組)、1 MIC 和2 MIC。在37 ℃下處理30 min后，利用試劑盒法對其胞內(nèi)的ATP進(jìn)行提取，并測定其相對發(fā)光值。

1.3.7 膜電位的測定 根據(jù)Guo等[20]的報(bào)道。將125 μL 的菌懸液(OD600 nm=0.5)與0.5 μL的DiBAC4(3)熒光探針加入到黑色不透明的96孔板中，然后加入胎菊水提物，使其終質(zhì)量濃度分別為1 MIC和2 MIC，對照組為未經(jīng)胎菊水提物處理的菌懸液，37 ℃培養(yǎng)30 min后，使用多功能酶標(biāo)儀測定樣品在激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為492 nm和515 nm下的熒光強(qiáng)度。

1.3.8 透射電鏡觀察 參照Li等[21]的報(bào)道。如1.3.6所述，菌懸液(OD600 nm=0.5)經(jīng)過質(zhì)量濃度0 MIC、1 MIC和2 MIC的胎菊水提物37 ℃處理4 h后，于8 000 g/min下離心5 min制備菌泥。4 ℃下向菌泥中加入2.5%的戊二醛固定2 h，離心并用磷酸緩沖液洗滌3次，再用1%餓酸固定2 h，重復(fù)洗滌3次。用體積分?jǐn)?shù)50%，70%，90%，100%的乙醇對上述樣品進(jìn)行脫水處理(10 min)，利用十二烷基琥珀酸酐對其進(jìn)行包埋，最后對樣品進(jìn)行醋酸鈾酰和檸檬酸鉛雙重染色，并置于透射電鏡下選取10 000× 放大倍數(shù)觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.3.9 胎菊水提物在熟豬肉中的應(yīng)用 根據(jù)Guo等[22]的報(bào)道。將新鮮豬肉切成1.5 g左右的小塊，于121 ℃下滅菌15 min得到無菌熟豬肉，用質(zhì)量濃度為1 MIC和2 MIC 的胎菊水提物浸泡10 s后在無菌培養(yǎng)皿中放置30 min，未浸泡的熟肉樣品作為對照組。將濃度為103CFU/mL 的大腸桿菌O157接種到熟豬肉樣品中，無菌袋密閉保存在4 ℃環(huán)境下6 d，分別在第0，3，6天取出樣品，對大腸桿菌進(jìn)行平板計(jì)數(shù)，同時(shí)測定熟肉樣品的色度(a*、b*、L*)重復(fù)3次讀數(shù)取平均值。

1.3.10 數(shù)據(jù)分析 除透射電鏡試驗(yàn)外，其他試驗(yàn)重復(fù)3次，試驗(yàn)結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，使用SPSS軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，顯著性檢驗(yàn)采用單因素方差分析(P<0.05)。

2 結(jié)果與討論

2.1 DIZ、MIC和MBC值的測定

以抑菌圈直徑(DIZ)、MIC及MBC值作為評定指標(biāo)來檢測胎菊水提物對大腸桿菌的抑菌效果，結(jié)果如表1所示。結(jié)果表明，胎菊水提物對7株大腸桿菌DIZ、MIC和MBC的范圍分別為(12.40±0.32)～(13.80±0.41) mm，10～20 mg/mL和20～40 mg/mL?，F(xiàn)有的研究也報(bào)道了一些植物源天然產(chǎn)物對大腸桿菌的抑制效果，例如烏梅有機(jī)酸和胡桃醌對大腸桿菌的MIC分別為31.25 mg/mL和60.00 μg/mL[23-24]，石榴皮多酚對大腸桿菌的MBC值為31.25 mg/mL[25]，與上述天然產(chǎn)物相比，胎菊水提物對大腸桿菌抑制作用處于中等偏上水平。為進(jìn)一步探究胎菊水提物對大腸桿菌的抑菌機(jī)制，選取大腸桿菌O157進(jìn)行后續(xù)研究。

2.2 胎菊水提物對細(xì)胞生長曲線的影響

胎菊水提物對大腸桿菌O157生長曲線的影響如圖1 所示。與空白組相比，經(jīng)過不同質(zhì)量濃度胎菊水提物處理后的大腸桿菌的生長被明顯的抑制，且抑菌效果隨著胎菊水提物質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng)。當(dāng)胎菊水提物質(zhì)量濃度大于2 MIC時(shí)，大腸桿菌被完全抑制。此外，從圖1中可知，胎菊水提物對大腸桿菌的抑制主要是延長了遲緩期，縮短了對數(shù)期。

2.3 胎菊水提物對胞內(nèi)ATP濃度的影響

ATP能夠?yàn)樗谢罴?xì)胞生物體提供能量，與物質(zhì)的代謝，能量的釋放、儲存和利用有關(guān)，是反映細(xì)胞存活狀況的重要參數(shù)[20]。由圖2可知，與對照組相比，胎菊水提物顯著降低了菌體細(xì)胞中的ATP含量(P<0.05)，可能是由于胎菊水提物作用下受試細(xì)菌細(xì)胞膜被破壞，導(dǎo)致胞內(nèi)ATP的泄漏，進(jìn)而影響細(xì)胞能量代謝，抑制大腸桿菌生長。類似地，F(xiàn)ei等[17]發(fā)現(xiàn)橄欖多酚能夠降低阪崎克羅諾桿菌胞內(nèi)ATP濃度，并將其歸因于細(xì)胞膜損傷，與試驗(yàn)研究結(jié)果一致。此外，研究[19, 26-27]表明，由于天然產(chǎn)物作用下ATP合成酶活性降低、K+的損失、細(xì)胞水解速率增加等均可以顯著降低細(xì)菌胞內(nèi)的ATP含量。

表1 胎菊水提物對7株大腸桿菌菌株的DIZ、MIC和MBC

圖1 不同濃度的胎菊水提物對大腸桿菌生長的影響

2.4 胎菊水提物對細(xì)胞膜電位的影響

DiBAC4(3)是一種膜電位敏感的親脂性陰離子熒光染料，進(jìn)入細(xì)胞后可與細(xì)胞中的蛋白質(zhì)結(jié)合發(fā)出熒光，因此可以通過測定細(xì)胞中的熒光強(qiáng)度來判斷細(xì)胞膜電位的變化[18]。如圖3所示，與空白對照組相比，經(jīng)質(zhì)量濃度為1 MIC和2 MIC的胎菊水提物處理后，菌體細(xì)胞膜的相對熒光值顯著增加(P<0.05)，表明在胎菊水提物的作用下大腸桿菌細(xì)胞膜發(fā)生了去極化，且胎菊水提物質(zhì)量濃度越高，去極化現(xiàn)象越明顯。細(xì)胞膜去極化是細(xì)胞膜透性發(fā)生改變的重要表現(xiàn)，與胞內(nèi)pH的改變及細(xì)胞膜上K+、Na+等濃度的改變有關(guān)[28]，因此上述結(jié)果表明胎菊水提物破壞了大腸桿菌細(xì)胞膜，進(jìn)而改變了細(xì)胞膜電位，從而影響細(xì)菌生長。

字母不同表示存在顯著性差異(P<0.05)

字母不同表示存在顯著性差異(P<0.05)

2.5 透射電子顯微鏡結(jié)果分析

通過透射電子顯微鏡觀察不同質(zhì)量濃度胎菊水提物對大腸桿菌細(xì)胞形態(tài)的影響，結(jié)果見圖4。與未受胎菊水提物處理的對照組相比，經(jīng)質(zhì)量濃度為1 MIC和2 MIC胎菊水提物處理(4 h)后的大腸桿菌細(xì)胞壁與細(xì)胞膜分離，內(nèi)溶物發(fā)生泄漏，菌體內(nèi)部出現(xiàn)空腔，細(xì)胞變癟變皺，發(fā)生嚴(yán)重的變形和塌陷；且隨著胎菊水提物質(zhì)量濃度的增加破壞程度也隨之加劇。由此可知，胎菊水提物能夠明顯破壞大腸桿菌的細(xì)胞形態(tài)，從而導(dǎo)致不可逆的損傷。

2.6 胎菊水提物在熟豬肉保藏中的應(yīng)用

2.6.1 大腸桿菌菌落總數(shù)的變化 不同濃度胎菊水提物對接種到熟豬肉儲存期間大腸桿菌的抑制作用如圖5所示。結(jié)果顯示，與未經(jīng)胎菊水提物處理的對照組相比，在第3天和第6天，經(jīng)質(zhì)量濃度1 MIC和2 MIC胎菊水提物處理后的熟豬肉中大腸桿菌數(shù)顯著性下降(P<0.05)。

圖4 大腸桿菌細(xì)胞的透射電鏡圖

字母不同表示存在顯著性差異(P<0.05)

此外，未經(jīng)胎菊水提物處理的熟豬肉中的大腸桿菌在貯藏期內(nèi)一直呈增長狀態(tài)，而在胎菊水提物的作用下，在整個(gè)貯藏期內(nèi)大腸桿菌的數(shù)目沒有增加。這表明，胎菊水提物可抑制大腸桿菌的生長，從而延長熟豬肉的保質(zhì)期。

2.6.2 色差的變化 對不同濃度胎菊水提物處理后熟豬肉的色度進(jìn)行測定，結(jié)果如表2所示。與對照組相比，質(zhì)量濃度為1 MIC的胎菊水提物雖然均可以降低樣品的L*(亮度)值，并提高b*(黃度)值，但差異不顯著(P>0.05)。當(dāng)質(zhì)量濃度為2 MIC時(shí)，胎菊水提物則可以顯著的改變熟豬肉的L*和b*值(P<0.05)。此外，胎菊水提物對熟豬肉的a*(紅度)值無顯著性差異(P>0.05)。胎菊水提物呈微黃色，結(jié)合上述結(jié)果可知，1 MIC的胎菊水提物對熟豬肉的色差影響不顯著，可作為熟豬肉潛在的防腐劑。

表2 不同質(zhì)量濃度的胎菊水提物對熟豬肉色澤的影響?

3 結(jié)論

胎菊水提物對大腸桿菌具有良好的抑制作用，而這種抑菌作用與胎菊水提物能夠延長大腸桿菌生長的遲緩期、縮短對數(shù)期、降低胞內(nèi)ATP濃度、引起細(xì)胞膜去極化和破壞細(xì)胞形態(tài)造成胞內(nèi)物質(zhì)的泄漏有關(guān)。此外，胎菊水提物在熟豬肉6 d的貯藏期內(nèi)可以降低樣品中的大腸桿菌總數(shù)，且1 MIC的質(zhì)量濃度對產(chǎn)品的色澤沒有顯著的影響。綜上，胎菊水提物有潛力作為一種新型抑菌劑和防腐劑運(yùn)用于食品工業(yè)中。在今后的研究中，還需對胎菊水提物對產(chǎn)品感官品質(zhì)、加入劑量和安全性進(jìn)行深入的探討，從而為更好地將胎菊水提物應(yīng)用于食品的貯藏提供理論依據(jù)。