孫子怡 楊劍婷 謝寧寧 張福生

(1. 安徽科技學(xué)院食品工程學(xué)院，安徽 滁州 239000；2. 安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，安徽 合肥 230031)

微量元素補(bǔ)充劑能夠有效預(yù)防此類缺乏癥，其中，第1～3代補(bǔ)充劑分別為無機(jī)鹽類、有機(jī)酸鹽類和氨基酸螯合物[1]。此外，由金屬螯合肽(Metal Chelating peptide, MCP)與金屬離子配位結(jié)合生成的肽—金屬螯合物，可以作為第4代補(bǔ)充劑的良好備選。相比較而言，其具有吸收效率高和無競爭性等優(yōu)點[2]，是當(dāng)下研究重點之一。

天然蛋白質(zhì)的酶解工藝，既是獲得金屬螯合肽的關(guān)鍵技術(shù)手段之一，也是制備肽—金屬螯合物的重要前提[3-5]。盧素珍等[4]以草魚魚鱗為原料，采用雙酶法制備多肽，運(yùn)用響應(yīng)面法優(yōu)化獲得最佳酶解工藝，使酶解物的水解度得到顯著提升，且具有65.72%的鐵螯合活性。原洪等[5]以花椒籽蛋白為原料，通過單因素和Box-Behnken方法優(yōu)化酶解工藝，獲得最優(yōu)酶解物的水解度和鐵結(jié)合能力分別為7.23%和585.66 mg EDTA/g·蛋白質(zhì)。王常瞵等[6]運(yùn)用蚌肉為原料，以螯合率為指標(biāo)，采用響應(yīng)面法優(yōu)化酶解工藝，制得蚌肉肽。

近年來，中國豬肉消費(fèi)和生豬出欄量均為全球最大，其中，生豬年均出欄頭數(shù)約6億[7]。據(jù)估算[8]，每年可產(chǎn)生約3.0×105t優(yōu)質(zhì)豬血。豬血富含優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)，經(jīng)預(yù)處理離心，可得到血漿液和血球液，分別占65%和35%左右[9]。課題組前期研究[10-11]表明，豬血和豬血漿均有制備優(yōu)異金屬螯合肽的潛力，可作為微量元素補(bǔ)充劑的良好載體。因此，有必要對豬血球制備金屬螯合肽的酶解工藝進(jìn)行優(yōu)化，形成系統(tǒng)化的工藝技術(shù)集成。

研究擬以豬血血球蛋白為原料，檢測其基本營養(yǎng)指標(biāo)和氨基酸組成，再采用堿性蛋白酶進(jìn)行酶解，以水解度為考察指標(biāo)，優(yōu)化血球蛋白肽的最佳工藝，評估血球蛋白肽的金屬螯合能力，以期為豬血資源高值化利用提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

堿性蛋白酶：酶活≥2.4 U/g，合肥博美生物科技有限公司；

豬血：合肥萬潤食品有限公司；

鹽酸、硝酸、高氯酸、硫酸、氫氧化鈉、氯化亞鐵、硫酸鐵銨、硼酸鉀、三硝基苯磺酸等：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

雙光束紫外可見分光光度計：1900PC型，上海譜元儀器有限公司；

pH計：PHS-3C型，上海儀電科學(xué)儀器有限公司；

冷凍干燥機(jī)：FD-1CE型，北京德天佑科技發(fā)展有限公司；

原子吸收光譜儀：iCE 3500型，美國賽默飛世爾公司；

酶標(biāo)分析儀：HR801型，華科瑞科技有限公司；

全自動凱式定氮儀：L-8900型，丹麥福斯分析儀器公司；

電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜(ICP-AES)：iCAP 7400型，賽默飛世爾科技公司。

1.2 方法

1.2.1 血球粉加工流程

豬血→離心分離(6 000 r/min、-4 ℃、15 min)→血球液→超濾(壓力0.15 MPa，溫度45 ℃)→噴霧干燥(進(jìn)風(fēng)溫度150 ℃，排風(fēng)溫度105 ℃)→血球粉

1.2.2 血球蛋白粉酶解工藝 取規(guī)定量血球粉于規(guī)定體積去離子水中，溶解，調(diào)節(jié)pH值，加入規(guī)定比例堿性蛋白酶后，置于恒溫水浴搖床進(jìn)行規(guī)定條件的酶解反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，水解物于100 ℃水浴滅酶3～5 min。冷卻至室溫后，血球酶解液在-4 ℃、6 000 r/min條件下離心15 min，過濾，取上清液，隨后真空冷凍干燥(-55 ℃，48 h)，制備血球蛋白肽。

1.2.3 基礎(chǔ)理化檢測

(1) 脂肪含量：按GB 5009.6—2016的索氏抽提法執(zhí)行。

(2) 水分含量：按GB 5009.3—2010的直接干燥法執(zhí)行。

(3) 蛋白質(zhì)含量：按GB 5009.5—2016的凱氏定氮法執(zhí)行。

1.2.4 氨基酸組成分析 取0.1 g樣品于水解管中，加入10 mL的6 mol/L鹽酸溶液，充氮氣排凈管中空氣。置于110 ℃的烘箱反應(yīng)22 h，再用超純水將溶液定容至50 mL。取其反應(yīng)液1 mL于燒杯中，真空干燥24 h，加入3 mL 0.2 mol/L的色譜純HCl溶液，混勻后取1 mL經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，用氨基酸自動分析儀測定組分。

1.2.5 水解度(DH)測定 采用三硝基苯磺酸法(TNBS法)[12]。稱取一定量樣品，用去離子水稀釋4倍，離心取10 μL上清液和100 μL硼酸鉀(1 mol/L pH 9.2)加入96孔酶標(biāo)板中，之后再加入40 μL TNBS (1.2 g/L)，于37.1 ℃培育1 h。采用酶標(biāo)儀(405 nm)測量吸光值。

1.2.6 單因素試驗

(1) pH值：水解時間4 h、水解溫度50 ℃、底物添加量8%、酶與底物比(m酶∶m底物)1∶250，考察pH值(7.0，8.0，9.0，10.0，11.0)對豬血球蛋白水解物水解效果的影響。

(2) 底物添加量：水解時間4 h、水解溫度50 ℃、酶與底物比(m酶∶m底物)1∶250、pH值9，考察底物添加量(4%，6%，8%，10%，12%)對水解效果的影響。

(3) 水解溫度：水解時間4 h、底物添加量8%、酶與底物比(m酶∶m底物)1∶250、pH值9，考察水解溫度(40，45，50，55，60 ℃)對水解效果的影響。

(4) 酶添加量：水解時間4 h、水解溫度50 ℃、底物添加量8%、pH值9，考察堿性蛋白酶與底物比(m酶∶m底物)(1∶500，1∶250，1∶167，1∶125，1∶100)對水解效果的影響。

(5) 水解時間：水解溫度50 ℃、底物添加量8%、酶與底物比(m酶∶m底物)1∶250、pH值9，考察水解時間(2，4，6，8，10 h)對水解效果的影響。

1.2.7 響應(yīng)面試驗 依據(jù)Box-Behnken中心組合試驗設(shè)計和單因素試驗結(jié)果，選取顯著影響蛋白水解度的因素(水解時間、pH和溫度)進(jìn)行優(yōu)化。

1.2.8 ICP-AES檢測螯合活性 改進(jìn)Wang等[13]的方法制備肽—金屬螯合物。向5 mL蛋白質(zhì)水解物(20 mg/mL)中添加1.0 mL ZnCl2(50 mg/mL)或FeCl2(50 mg/mL)或CuCl2(50 mg/mL)無機(jī)鹽溶液，用0.5 mol/L NaOH和0.5 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH值至6.0。30 ℃ 下反應(yīng)45 min后在8 000× g下離心15 min，去除上清液，獲得沉淀物。針對沉淀物，采用80%乙醇溶液復(fù)溶，漩渦混合后，8 000× g離心，取沉淀，反復(fù)操作3次，制得金屬螯合物?？瞻捉M以1 mL蒸餾水代替ZnCl2或FeCl2或CuCl2溶液。GSH(20 mg/mL)和EDTA(5 mg/mL)作為陽性對照組。

參照Chope等[14]的方法，采用ICP-AES檢測金屬螯合物中鐵、銅和鋅的含量。分析條件：傳動功率1 300 W；冷卻氣體流速15 L/min；輔助氣體流速0.2 L/min；載氣流速0.8 L/min；注射速度1.5 mL/min；波長206.20 nm；觀察方法為軸位。

螯合率按式(1)計算：

R=[(C樣品-C空白)/(C總-C空白)]×100%，

(1)

式中：

R——螯合率，%；

C樣品、C空白、C總——分別是肽—金屬螯合物、蛋白水解物、混合溶液(無機(jī)鹽和蛋白水解物)的金屬離子含量，μg/mL。

1.2.9 統(tǒng)計分析方法 采用SPSS 16.0的one-way (ANOVA)進(jìn)行方差分析，試驗數(shù)據(jù)取3個平行試驗的平均值。采用Design Expert 8.0進(jìn)行響應(yīng)面工藝設(shè)計。

2 結(jié)果與分析

2.1 基本營養(yǎng)指標(biāo)

對豬血及血球蛋白粉的基本營養(yǎng)指標(biāo)進(jìn)行分析比較，如表1所示。豬血水分含量為95.06%，脂肪含量較低。經(jīng)分離后制備出的血球蛋白粉水分含量為7.34%，蛋白含量為91.60%。有報道[15]指出，豬血球蛋白具有優(yōu)異的營養(yǎng)特征。團(tuán)隊前期研究[10-11]已經(jīng)證明豬血和豬血漿中蛋白質(zhì)是金屬螯合肽的優(yōu)異前體。因此，優(yōu)異的豬血球蛋白可用于后續(xù)金屬螯合肽的制備研究。

2.2 氨基酸組成分析

對豬血粉和血球蛋白粉的氨基酸組成及含量進(jìn)行分析比較，結(jié)果見表2。兩種蛋白粉的酸解產(chǎn)物中均檢測出16種氨基酸，色氨酸受到破壞，未檢出。豬血和血球蛋白中均檢出7種必需氨基酸，其中亮氨酸、賴氨酸、纈氨酸和苯丙氨酸含量豐富。這與趙治國等[16]報道的血球蛋白粉氨基酸組成特征類似。

2.3 單因素試驗

2.3.1 pH值 由圖1可知，水解度指標(biāo)值隨pH值的增大呈先增大后減小的趨勢，與薛照輝等[17]報道菜籽蛋白酶解有關(guān)規(guī)律的變化趨勢相似。當(dāng)反應(yīng)體系pH值>10時，蛋白酶在強(qiáng)堿性條件下空間構(gòu)象發(fā)生改變，降低蛋白酶對底物的酶解效率，導(dǎo)致水解能力降低[18]。故最佳pH值為10。

表1 豬血和血球蛋白粉的基本營養(yǎng)指標(biāo)

表2 豬血粉和豬血球蛋白粉的氨基酸組成分析?

圖1 pH值對蛋白水解度的影響

2.3.2 底物濃度 由圖2可知，當(dāng)?shù)孜锾砑恿繛?%～8%時，水解度指標(biāo)值隨底物濃度的升高而略微增加，但不顯著；當(dāng)達(dá)到8%時，水解度達(dá)到最大，與殷俊峰等[11]研究豬血漿蛋白的水解度與底物濃度之間的關(guān)系有著相似的影響。這可能是因為部分酶沒有與分離蛋白充分接觸以及產(chǎn)物達(dá)到一定量時會對反應(yīng)有抑制作用。因此，底物添加量應(yīng)控制在8%左右。

圖2 底物添加量對蛋白水解度的影響

2.3.3 水解溫度 由圖3可知，當(dāng)水解溫度<50 ℃時，水解度呈上升趨勢；當(dāng)水解溫度>50 ℃時，水解度開始下降。陳樹俊等[19]研究也表明在50 ℃時，酶解核桃粉的水解度達(dá)到最大。推測這是由于水解溫度在達(dá)到蛋白酶的最佳溫度之前，升高反應(yīng)體系的溫度將促進(jìn)蛋白酶活性，而之后升溫則會抑制其活性。因此，選擇水解溫度為50 ℃ 用于后續(xù)工藝優(yōu)化。

2.3.4 酶添加量 由圖4可知，水解度在酶與底物比(m酶∶m底物)為1∶500～1∶100內(nèi)添加量呈上升趨勢而后緩慢下降。這可能與酶本身也是一種蛋白質(zhì)，當(dāng)酶與底物比過大時對酶解過程造成干擾有關(guān)。因此，酶與底物比(m酶∶m底物)可選擇1∶250。

2.3.5 水解時間 由圖5可知，水解度呈先快速增加后緩慢增大的趨勢，與黃艷燕等[20]報道水解大米蛋白的酶解時間與水解度的變化趨勢相似。這可能是因為隨著產(chǎn)物濃度的增加一定程度上抑制了反應(yīng)的進(jìn)行。考慮到經(jīng)濟(jì)及生產(chǎn)效率，最終選擇水解時間為6 h用于后續(xù)工藝優(yōu)化。

通過上述5個酶解水解度單因素試驗發(fā)現(xiàn)：水解溫度、水解時間及pH值對血球蛋白粉水解度具有顯著影響(P<0.05)，蛋白酶與底物比和底物添加量對血球蛋白粉水解度的影響不顯著(P>0.05)。

圖3 水解溫度對水解度的影響

圖4 酶與底物比對蛋白水解度的影響

圖5 水解時間對蛋白水解度的影響

由此，在響應(yīng)面優(yōu)化中僅對水解度具有顯著影響的3個因素進(jìn)行酶解工藝優(yōu)化。其中固定酶與底物比(m酶∶m底物)為1∶250，底物添加量為8%。

2.4 響應(yīng)面試驗

2.4.1 響應(yīng)面優(yōu)化試驗與回歸模型分析 用Design-Expert 8.0.5軟件對酶解工藝進(jìn)行三因素三水平響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計，試驗因素與水平見表3，結(jié)果見表4。

對試驗結(jié)果進(jìn)行二次多元回歸模型擬合，分析得到血球蛋白粉酶解工藝的回歸方程為：

Y=-616.485 25+56.702 5A+12.512B+12.561C-0.069 5AB+0.308 75AC-0.106 75BC-2.590 75A2-0.112 63B2-0.741 44C2。

(2)

為驗證上述擬合模型的準(zhǔn)確性和有效性，對回歸方程進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表5。

表3 響應(yīng)面試驗因素與水平

表4 豬血球蛋白制備螯合肽的酶解工藝響應(yīng)面分析結(jié)果

模型P<0.000 1差異水平極顯著，失擬項不顯著。由此可知，該模型可合理解釋大部分試驗變化情況。因此，該模型具有較好的合理性和準(zhǔn)確性。

通過上述一次項回歸方程，發(fā)現(xiàn)影響水解度的順序為A>C>B，且A和C項影響呈極顯著(P<0.000 1)；平方項中A2、B2和C2項均呈極顯著(P<0.000 1)；交互項中只有BC項影響顯著。因此，影響水解度大小因素順序：pH值>水解時間>水解溫度。

2.4.2 響應(yīng)面圖分析 由圖6可知，當(dāng)水解溫度為50 ℃，pH值在9.0～10.0范圍內(nèi)增加時，蛋白水解度快速上升，pH值在10.0～11.0范圍內(nèi)增加時，水解度緩慢下降；pH值為10時，水解度隨水解溫度的增加先升后降。

表5 響應(yīng)面回歸模型的方差分析?

由圖7可知，當(dāng)水解時間為6 h，水解溫度在45～50 ℃ 范圍內(nèi)增加時，蛋白水解度呈上升趨勢，水解溫度在50～55 ℃范圍內(nèi)增加時，水解度有下降趨勢；水解溫度為50 ℃時，水解度隨水解時間的增加先升后降。

由圖8可知，當(dāng)水解時間為6 h，pH值在9.0～10.0范圍內(nèi)增加時，蛋白水解度快速上升，pH值在10.0～11.0 范圍內(nèi)增加時，水解度緩慢下降；當(dāng)pH值為10時，水解度隨水解時間的增加先上升后下降。

2.4.3 響應(yīng)面試驗最優(yōu)工藝參數(shù) 由軟件程序優(yōu)化得到最佳工藝參數(shù)為pH值10.69、水解溫度48.50 ℃、水解時間6.76 h。在此工藝條件下，豬血球蛋白粉的酶解水解度的預(yù)測值為37.81%。

按最佳酶解工藝設(shè)計3次平行實驗，取試驗數(shù)據(jù)結(jié)果的平均值，獲得實測酶解水解度為37.83%，較預(yù)測值高0.02%。相對誤差絕對值的平均值小于10%，表明響應(yīng)面法優(yōu)化的酶解工藝結(jié)果是準(zhǔn)確可靠的。

圖6 pH與水解溫度相互作用影響的三維圖和等高線圖

圖7 水解溫度與水解時間相互作用影響的三維圖和等高線圖

圖8 pH與水解時間相互作用影響的三維圖和等高線圖

2.5 豬血球蛋白肽金屬螯合能力

將制備的酶解產(chǎn)物分別與FeCl2、ZnCl2和CuSO4溶液進(jìn)行螯合，得到含有不同金屬元素的螯合物，采用ICP-AES檢測鐵、銅和鋅的含量，扣除空白，計算其金屬螯合能力的強(qiáng)弱。以GSH和EDTA制備的金屬螯合物為陽性對照[13,21]，進(jìn)行螯合產(chǎn)物的活性比對。由表6可知，豬血球蛋白肽金屬螯合物的鐵、銅、鋅螯合能力分別達(dá)到EDTA的38.45%，12.13%，50.78%，分別達(dá)到GSH螯合能力的46.55%，14.12%，62.23%。

3 結(jié)論

采用堿性蛋白酶水解豬血血球液中的血球蛋白制備水解物，并評價其金屬螯合潛力。在單因素試驗中發(fā)現(xiàn)，水解溫度、水解時間和pH對蛋白水解具有明顯影響，底物添加量和酶與底物比影響不顯著。選擇底物添加量為8%、酶與底物比(m酶∶m底物)為1∶250為固定條件，通過響應(yīng)面試驗優(yōu)化血球蛋白酶解工藝，得到最佳工藝條件為pH 10.69，水解溫度48.50 ℃，水解時間6.76 h。在該條件下，蛋白水解度的預(yù)測值為37.81%，實測值為37.83%。豬血球蛋白肽具有對鐵、銅和鋅離子的螯合能力，具有制備第4代微量元素補(bǔ)充劑的潛力。在后續(xù)試驗中還需對金屬螯合物的結(jié)構(gòu)性質(zhì)進(jìn)行表征研究。

表6 豬血球蛋白肽金屬螯合物的鐵、銅、鋅含量?