自動紅細(xì)胞比容校正全血CRP測試結(jié)果特定蛋白分析儀的系統(tǒng)設(shè)計(jì)

陳月玲，王永強(qiáng)，鄭繼波，陳蘭蘭

1.山東大學(xué)附屬山東省耳鼻喉醫(yī)院眩暈科，山東濟(jì)南250022；2.濟(jì)南市第四人民醫(yī)院器材設(shè)備管理科，山東濟(jì)南250031；3.山東省立第三醫(yī)院信息網(wǎng)絡(luò)部臨床醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)部，山東濟(jì)南250021；4.山東大學(xué)附屬山東省立醫(yī)院 臨床醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)部，山東濟(jì)南250021

引言

目前，國內(nèi)外關(guān)于紅細(xì)胞比容（Hematocrit，HCT）對全血C-反應(yīng)蛋白（C-Reactive Protein，CRP）檢測的影響及其校正方法的研究成果有很多[1-4]，如田野等[2]通過試驗(yàn)得出全血CRP水平與HCT值呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系的結(jié)論，并推導(dǎo)了使用HCT值校正全血CRP值的公式。隆維東等[4]測定并計(jì)算了最佳理論HCT范圍。但能夠?qū)崿F(xiàn)一臺設(shè)備同時(shí)實(shí)測HCT及CRP值，并使用HCT值對全血CRP檢測結(jié)果校正的分析儀卻很少。在臨床檢驗(yàn)科室的測試實(shí)踐中，當(dāng)遇到HCT偏離正常值的樣品時(shí)，不得不人工校正后發(fā)布報(bào)告。因此，本文設(shè)計(jì)一款可實(shí)現(xiàn)自動測量HCT及CRP值，并進(jìn)行自動校正的全自動化儀器。

1 系統(tǒng)設(shè)計(jì)

1.1 工作原理

采用散射比濁法[5-8]設(shè)計(jì)光學(xué)部件，采用散射光對全血樣本進(jìn)行HCT測定，自動對CRP測試值進(jìn)行校正。

散射光檢測原理描述如圖1所示，采用650 nm波長的激光I0沿水平軸入射，通過待測樣本時(shí)，光線被粒子顆粒散射，發(fā)生偏轉(zhuǎn)，根據(jù)Rayleigh散射方程，散射光強(qiáng)度與粒子（免疫復(fù)合物）的濃度和體積成正比，即待測物越多，反應(yīng)后形成的粒子也越多，散射光強(qiáng)度也越強(qiáng)。通過測量散射光的強(qiáng)度，可計(jì)算出待測抗原的濃度。

圖1 散射比濁法示意圖

1.2 系統(tǒng)結(jié)構(gòu)

本系統(tǒng)主要由機(jī)械結(jié)構(gòu)和電路系統(tǒng)組成。

1.2.1 機(jī)械結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)

機(jī)械結(jié)構(gòu)組件[9-10]由七大模塊組成，分別為：進(jìn)樣架模塊、樣本針模塊、試劑針模塊、攪拌針模塊、反應(yīng)盤模塊、試劑盤模塊、機(jī)架模塊。機(jī)械結(jié)構(gòu)組件分解圖如圖2所示。

圖2 機(jī)械結(jié)構(gòu)模塊

1.2.1.1 進(jìn)樣架系統(tǒng)

進(jìn)樣架系統(tǒng)主要由進(jìn)樣位、出樣位，推動樣本架的步進(jìn)電機(jī)、相關(guān)導(dǎo)軌、同步帶、傳感器等組成，當(dāng)樣本架放入進(jìn)樣位后，由步進(jìn)電機(jī)驅(qū)動擋片將樣本架推至吸樣位，完成吸樣后，再由擋片將樣本架推至出樣位，完成自動進(jìn)樣。

1.2.1.2 樣本針模塊

樣本針模塊用于將血液樣本添加至反應(yīng)杯中，具有液面探測功能及垂直方向的防撞功能。

1.2.1.3 試劑針模塊

試劑針模塊用于將試劑盤模塊中低溫存儲的試劑抽吸到反應(yīng)杯中，同樣具有液面探測及垂直方向防撞功能。

1.2.1.4 攪拌針模塊

攪拌針模塊用于將樣本與稀釋液，或兩者混合液與第二試劑進(jìn)行混勻，保證充分反應(yīng)。

1.2.1.5 反應(yīng)盤模塊

反應(yīng)盤用于承載反應(yīng)杯，具有加熱功能，保證免疫反應(yīng)處于恒溫37℃的環(huán)境中。安裝有光學(xué)測試模塊，采用激光光源，激光透過反應(yīng)杯后，被光學(xué)感應(yīng)模塊接收。反應(yīng)盤帶有編碼盤，編碼盤與傳感器組件共同保證反應(yīng)盤按需求轉(zhuǎn)動到不同位置，進(jìn)行加樣、加試劑、攪拌及測試等工作。

同一樣本對HCT及CRP測試時(shí)，需要使用兩個(gè)反應(yīng)杯，第一反應(yīng)杯注入稀釋液后，樣本針將全血樣本注入該反應(yīng)杯中，測定該樣本的HCT，測試完成后，由樣本針從第一反應(yīng)杯中吸取一定量樣本注入第二反應(yīng)杯中，由試劑針注入試劑，反應(yīng)完成后再次使用散射法對第二反應(yīng)杯中的混合樣進(jìn)行CRP值的測試，并使用第一反應(yīng)杯中測的HCT對CRP值進(jìn)行校正。

1.2.1.6 試劑盤模塊

試劑盤模塊與反應(yīng)盤模塊控制方式類似，同樣使用編碼盤進(jìn)行定位和轉(zhuǎn)動控制。為避免在機(jī)試劑蒸發(fā)或溫度原因?qū)е碌脑噭┰跈C(jī)時(shí)間縮短，試劑盤配有制冷模塊。

1.2.1.7 機(jī)架模塊

機(jī)架模塊包含整機(jī)的手板件外殼、用于承載其他模塊的機(jī)加工件或鈑金件等。

1.2.2 硬件結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)

1.2.2.1 設(shè)計(jì)原則

整機(jī)布局應(yīng)注意大功率器件，應(yīng)布在電路板邊緣，電機(jī)、泵、閥驅(qū)動電路設(shè)計(jì)為獨(dú)立單元，避免大功率器件在啟動、運(yùn)行及停止時(shí)產(chǎn)生的噪音影響其他系統(tǒng)的正常運(yùn)行。儀器電路板較多，運(yùn)動機(jī)構(gòu)復(fù)雜[11-12]，要充分考慮印刷電路板（Printed CircuitBoard Assembly，PCBA）的連接線、風(fēng)道的設(shè)計(jì)。電路板與液路應(yīng)分開，液路采用兩段或多段連接的方式，方便拆卸維修。同一邏輯運(yùn)動下的功能實(shí)現(xiàn)應(yīng)盡量在同一單元內(nèi)完成，減少PCBA之間的通訊。

1.2.2.2 架構(gòu)設(shè)計(jì)

為降低研發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，提高產(chǎn)品的擴(kuò)展性，采用目前廣泛應(yīng)用的微處理器ARM（Advanced RISC Machines，ARM）平臺[13-14]。ARM單片機(jī)與上位機(jī)進(jìn)行通訊，設(shè)備運(yùn)行邏輯、數(shù)據(jù)計(jì)算等由上位機(jī)完成。

選用意法半導(dǎo)體的STM32F407V單片機(jī)，使用CortexIM-M4為內(nèi)核作為主控芯片，負(fù)責(zé)整個(gè)硬件平臺的指令控制、數(shù)據(jù)運(yùn)算及信號處理，通過設(shè)備內(nèi)的光電傳感器采集數(shù)據(jù)，然后通過主控芯片內(nèi)相應(yīng)的模塊進(jìn)行信號處理，再通過中央處理器進(jìn)行算法控制，解析出結(jié)果值并在上位機(jī)上顯示[15-17]。

主控板使用串口與上位機(jī)通訊，主控板與各驅(qū)動板之間則使用控制器域網(wǎng)（Controller Area Network，CAN）通訊。

上位機(jī)與主控板及各模塊控制板之間的通訊如圖3所示。主控板及各模塊控制板實(shí)物圖如圖4～6所示。主控板為控制中樞，包括控制電源，各運(yùn)動機(jī)構(gòu)的運(yùn)行邏輯控制等。各模塊控制板則用于本模塊的驅(qū)動及控制，并將結(jié)果通過主控板反饋至上位機(jī)系統(tǒng)。

2 軟件設(shè)計(jì)

上位機(jī)軟件負(fù)責(zé)界面的操作、結(jié)果的顯示，可進(jìn)行樣本測試、質(zhì)控測試、定標(biāo)測試的申請；以及查詢、打印等必備的輔助功能。

圖3 硬件通訊拓?fù)?/p>

圖4 主控板

圖5 針類模塊控制板

圖6 盤類模塊控制板

下位機(jī)進(jìn)行時(shí)序控制、邏輯控制、數(shù)據(jù)運(yùn)算等，將分析后的結(jié)果傳送到上位機(jī)，在上位機(jī)顯示界面上顯示。

上位機(jī)軟件，人機(jī)交互功能的設(shè)計(jì)如圖7所示，軟件系統(tǒng)分為菜單、試劑、任務(wù)、指控及結(jié)果模塊。菜單為功能入口，提供各類功能的接入；試劑模塊則用于顯示試劑剩余量、批號等相關(guān)信息；任務(wù)入口用于新增測試樣本信息的錄入，其中需要選擇樣本為全血標(biāo)本還是血漿/血清標(biāo)本；質(zhì)控則用于儀器質(zhì)控結(jié)果的查看及匯總功能等，同時(shí)質(zhì)控測試時(shí)，信息錄入也在本窗口；結(jié)果則為樣本測試結(jié)果的匯總顯示、查詢等。

圖7 人機(jī)交互功能

在儀器進(jìn)入工作狀態(tài)時(shí)，主程序首先對儀器的電路進(jìn)行整機(jī)初始化，檢查儀器的各運(yùn)行動作是否異常，在確認(rèn)無異常后，儀器自動進(jìn)行日檢，日檢執(zhí)行完成后，儀器檢測清洗桶清洗液的用量、試劑位等的檢測。檢測完成后，可進(jìn)入執(zhí)行流程環(huán)節(jié)，流程結(jié)束后輸出結(jié)果。具體流程如圖8所示。

圖8 系統(tǒng)流程圖

3 性能測試與驗(yàn)證

本分析儀采用了良好的人機(jī)交互設(shè)計(jì)，方便操作者使用。儀器的實(shí)物圖如圖9所示。人機(jī)交互界面如圖10所示。

圖9 產(chǎn)品實(shí)物圖

圖10 人機(jī)交互界面

3.1 性能驗(yàn)證

CRP存在于人血漿或血清中，HCT會對該項(xiàng)目的測試結(jié)果產(chǎn)生較大影響。因此，本儀器設(shè)計(jì)時(shí)，采用散射光對全血樣本進(jìn)行特定蛋白濃度及HCT的測定，實(shí)現(xiàn)自動HCT校正全血CRP測試結(jié)果。

使用CRP試劑及配套的定標(biāo)品、質(zhì)控品及血清樣本，對設(shè)備進(jìn)行定標(biāo)，并進(jìn)行質(zhì)控測試，質(zhì)控通過后，對設(shè)備進(jìn)行準(zhǔn)確度、重復(fù)性及線性的測試[18-19]。

3.1.1 準(zhǔn)確度

儀器準(zhǔn)確度采用編號為ERM-DA474/IFCC的CRP標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行測試，靶值為41.2 mg/L。對標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)測定3次，測試結(jié)果記為(xi)，分別為 43.3、43.1、42.8 mg/L計(jì)算相對偏差結(jié)果分別為5.10%、4.61%和3.88%，按照CRP測定試劑盒行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[20]，相對偏差應(yīng)≤15%。

3.1.2 重復(fù)性

使用高、低值臨床血清樣本對儀器進(jìn)行測試，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差及變異系數(shù)，變異系數(shù)應(yīng)當(dāng)不大于10%[20]，測試結(jié)果表明在臨床高值樣本測試結(jié)果CV值為0.79%，低值樣本測試結(jié)果CV值為3.4%，結(jié)果均優(yōu)于標(biāo)準(zhǔn)要求。

3.1.3 線性

采用高值臨床血清樣本，按照原倍、1/2、1/4、1/16、1/64、1/400的稀釋比例進(jìn)行線性測試，計(jì)算線性相關(guān)系數(shù)。測試數(shù)據(jù)結(jié)果顯示線性相關(guān)系數(shù)R為0.9998。

通過上述測試表明，在使用血清樣本時(shí)，本文中設(shè)計(jì)開發(fā)的特定蛋白儀具有良好的實(shí)用性。

3.2 全血樣本的CRP測試及結(jié)果校正

3.2.1 HCT與全血CRP數(shù)值的線性關(guān)系

對全血CRP進(jìn)行測試時(shí)，對測試結(jié)果進(jìn)行了換算，換算為與血漿樣本等值的結(jié)果見式(1)。

式中：CRPW-全血CRP濃度值；

CRPWR-全血CRP濃度值實(shí)測值；

HCt-固定HCT。

其中Hct值為特定蛋白儀內(nèi)置可修改參數(shù)，一般設(shè)置為40%。

將公式(1)編程輸入軟件系統(tǒng)中，則在測試獲得結(jié)果后，使用固定的HCT40%自動校正全血測試結(jié)果。

由上式可看出，全血CRP濃度值與HCT成線性關(guān)系。驗(yàn)證如下。

采集正常體檢人員EDTA抗凝血兩管，第一管使用3000 r/min離心10 min，第二管靜置發(fā)生血沉后，用移液槍吸取底層紅細(xì)胞，或滴加第一管血漿，并充分混勻的方式，分別使用Sysmex XN-2000儀器測試HCT，以及本文所研發(fā)的特定蛋白儀測試全血CRP濃度。二者關(guān)系如圖11所示。

3.2.2 HCT的測定

為實(shí)現(xiàn)使用HCT對全血CRP進(jìn)行校正，本儀器采用散射光測試的方法，獲得HCT數(shù)值。

全血樣本被吸注到預(yù)先加入了稀釋液的反應(yīng)杯中，反應(yīng)盤將該反應(yīng)杯旋轉(zhuǎn)至測試位，獲得散射光強(qiáng)度值，并通過曲線獲得HCT值，利用該HCT值進(jìn)行校正。散射光強(qiáng)度值（為方便表示，對散射光強(qiáng)度進(jìn)行了換算）與HCT的關(guān)系如圖12所示。

圖11 全血CRP濃度與HCT的線性關(guān)系

圖12 HCT與散射光強(qiáng)度值

由圖12可知，HCT與散射光強(qiáng)度值有線性關(guān)系，因此，可使用二者關(guān)系建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，用于根據(jù)散射光強(qiáng)度計(jì)算HCT值。

3.2.3 利用HCT對全血CRP的校正

使用3.2.1中以獲得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。根據(jù)隆維東[4]等研究結(jié)論，校正計(jì)算的公式為式(2)。

將公式(2)輸入至儀器計(jì)算程序中。

取3.2.1中，梯度HCT樣本，使用修改了校正公式特定蛋白儀進(jìn)行全血CRP測定。每個(gè)標(biāo)本測定三次，取平均值列于表1校正值一列。

表1 不同HCT校正CRP值

根據(jù)隆維東等[4]的結(jié)論，當(dāng) HCT 處于（36.0±3.5）%范圍時(shí)，全血標(biāo)本在使用式(1)的方式校正時(shí)，與血清標(biāo)本直接測試結(jié)果無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。故以HCT38%樣本CRP濃度為該樣本真值（49.15 mg/L），使用該真值計(jì)算與所有校正值的相對偏差，列于表1相對偏差一列。不同HCT梯度的同一來源樣本的CRP測試結(jié)果均得到了校正，符合標(biāo)準(zhǔn)要求[20]。

4 結(jié)論

本儀器設(shè)計(jì)的HCT測試功能獲取的HCT值精確度雖無法與血球儀精度相媲美，但可以有效的校正CRP的值，濃度值的相對偏差，均小于15%，可以滿足臨床要求。

本分析儀其進(jìn)樣架系統(tǒng)具有一定的先進(jìn)和優(yōu)越性，可以避免人工因素的影響，大幅度提高檢測效率；樣本針、試劑針和攪拌針，三個(gè)模塊分工協(xié)作，可以極大的提高運(yùn)行效率；配合清洗部分，可以減少一定耗材損耗，降低使用成本；反應(yīng)盤和試劑盤模塊都采用特殊設(shè)計(jì)的編碼盤，根據(jù)任務(wù)需求，轉(zhuǎn)動到不同的部位，反應(yīng)盤配合檢測系統(tǒng)，可以準(zhǔn)確無誤的進(jìn)行判別，提高診斷的準(zhǔn)確性以及檢測效率；試劑盤配合冷卻模塊，可以減少試劑的損耗，降低一定的使用成本。

本分析儀的硬件部分，采取電路板和液路分開布置，電路板以及液路部分都在儀器邊緣位置，方便拆卸，對后續(xù)的售后維護(hù)提供了極大的便利。本分析儀的軟件部分，采用良好的人機(jī)交互界面，通俗易懂，方便使用者的操作。

本分析儀沒有加入閉蓋穿刺功能和獨(dú)立的急診位，這兩個(gè)不足之外將會是我們以后研究和完善的方向。量產(chǎn)機(jī)可參考本文的設(shè)計(jì)思路，加入閉蓋穿刺、設(shè)立急診位等方便臨檢的功能?？煽康馁|(zhì)量、持續(xù)穩(wěn)定的設(shè)備運(yùn)行，是臨檢科室的主要要求，新開發(fā)的設(shè)備，應(yīng)當(dāng)進(jìn)行足夠時(shí)間的可靠性試驗(yàn)，運(yùn)行穩(wěn)定性試驗(yàn)等，在充分驗(yàn)證設(shè)備可靠性基礎(chǔ)上注冊并量產(chǎn)。