二氧化氯溶液對(duì)豬瘟病毒的殺滅效果試驗(yàn)

張志博，劉義明，王玉鳳，張向陽(yáng)，劉欣彤，王宏磊，徐 飛，路永強(qiáng)，陳孝杰，李秀波

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所 國(guó)家飼料中藥物基準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室，北京 海淀 100081；2.北京市畜牧總站，北京 朝陽(yáng) 100029)

豬瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)能引起對(duì)豬的高度接觸性致死性傳染病，即豬瘟(Classical swine fever,CSF)[1]，嚴(yán)重危害我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)，是我國(guó)政府計(jì)劃消滅的重大動(dòng)物傳染病之一。目前我國(guó)養(yǎng)豬模式多樣化，規(guī)模各異，各豬場(chǎng)的生物安全等級(jí)也不盡相同，因此在豬瘟疫情防控方面，面臨著嚴(yán)峻挑戰(zhàn)[2]，生物安全防控是豬場(chǎng)防疫最直接的方式，采用有效的消毒劑是豬場(chǎng)的生物安全防控重點(diǎn)措施[3]。

二氧化氯消毒劑是被世界衛(wèi)生組織(WHO)列為A1級(jí)安全高效消毒劑，其消毒具有廣譜性、高效性和安全性[4]。目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于二氧化氯對(duì)病毒的滅活效果評(píng)價(jià)多集中在脊髓灰質(zhì)炎病毒、流感病毒等病毒，如孫榮芳等[5]評(píng)估了二氧化氯對(duì)脊髓灰質(zhì)炎病毒Ⅰ型、單純性皰疹病毒Ⅰ型和腮腺炎病毒等6種病毒的滅活作用；Ogata N等[6]通過(guò)小鼠感染試驗(yàn)評(píng)估了二氧化氯對(duì)甲型流感病毒的滅活效果。但二氧化氯對(duì)豬瘟病毒的殺滅效果評(píng)價(jià)較少，導(dǎo)致二氧化氯應(yīng)用于豬場(chǎng)消毒時(shí)缺少參考依據(jù)，在臨床應(yīng)用時(shí)具有盲目性。因此本試驗(yàn)采用免疫熒光法和懸液定量殺滅試驗(yàn)，測(cè)定了一種二氧化氯溶液對(duì)Thiveral株豬瘟病毒的殺滅效果，并選取市面上使用的二氧化氯粉劑進(jìn)行消毒效果比較，以期為二氧化氯對(duì)豬瘟病毒的消毒標(biāo)準(zhǔn)提供參考與理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試消毒劑 二氧化氯溶液：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所提供，批號(hào):190401；二氧化氯粉劑：張家口市綠潔環(huán)保化工技術(shù)開發(fā)有限公司，批號(hào):20181025。

1.2 細(xì)胞與毒株 豬瘟病毒Thiveral株，購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.3 主要試劑 抗小鼠IgG(全分子)-FITC山羊抗體，貨號(hào):F9006-2 mL，購(gòu)自Sigma公司；Triton X-100，購(gòu)自Sigma公司；PBS緩沖液、MEM培養(yǎng)基、牛血清和青、鏈霉素，均購(gòu)自上海阿拉丁生物科技有限公司；五水合硫代硫酸鈉，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.4 主要溶液配制 中和劑：含0.5%硫代硫酸鈉PBS溶液；標(biāo)準(zhǔn)硬水：每1 L去離子水中含0.304 g的無(wú)水氯化鈣和 0.139 g帶結(jié)晶水的氯化鎂；細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)液：含青、鏈霉素和10%牛血清的MEM培養(yǎng)基；細(xì)胞維持培養(yǎng)液：含青、鏈霉素和2%牛血清的MEM培養(yǎng)基。

1.5 主要儀器 熒光顯微鏡，上海蔡康光學(xué)儀器廠出產(chǎn)；超凈工作臺(tái)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；ZWYR-D2403型恒溫振蕩器，上海智城分析儀器制造有限公司；微量移液器，德國(guó)Eppendorf公司；二氧化碳培養(yǎng)箱，蘇州威爾試驗(yàn)用品有限公司。

1.6 PK-15細(xì)胞制備 取出凍存的PK-15細(xì)胞，置37 ℃水浴迅速解凍。室溫1 000 r/min離心3 min，棄去上清。用生長(zhǎng)培養(yǎng)液將細(xì)胞重懸后轉(zhuǎn)移至75 cm2培養(yǎng)瓶中，并補(bǔ)加適量生長(zhǎng)培養(yǎng)液，置于含5% CO2的37 ℃ 培養(yǎng)箱培養(yǎng)36～48 h。待細(xì)胞長(zhǎng)滿單層時(shí)，棄掉培養(yǎng)液，用PBS漂洗后加入適量胰酶，置于37 ℃消化2～3 min，輕拍瓶壁使細(xì)胞脫落。加入生長(zhǎng)培養(yǎng)液，用移液器輕輕吹打使細(xì)胞分散，形成均勻的細(xì)胞懸液。接種于75 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)加生長(zhǎng)培養(yǎng)液適量，置于含5% CO2的37 ℃ 培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每日觀察，待細(xì)胞長(zhǎng)滿單層時(shí)，可用于試驗(yàn)。

1.7 Thiveral株豬瘟病毒液的制備 取凍存的豬瘟病毒Thiveral株置于37 ℃水浴迅速融化；按10%的體積接種已經(jīng)長(zhǎng)滿單層PK-15細(xì)胞75 cm2培養(yǎng)瓶，置于含5% CO2的37 ℃ 培養(yǎng)箱中吸附1 h，期間每隔10～15 min晃動(dòng)1次細(xì)胞瓶，使全部細(xì)胞被浸潤(rùn)，防止細(xì)胞因干燥死亡；加入適量細(xì)胞維持液于75 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，37 ℃、5% CO2溫箱中放置72 h；采用免疫熒光抗體試驗(yàn)(FAT)檢測(cè)，當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)亮綠色熒光時(shí)，表明病毒培養(yǎng)成功；然后反復(fù)凍融3次，使宿主細(xì)胞破碎，以釋放病毒，經(jīng)6 000 r/min離心15 min，保留上清，上清液即為所需的病毒懸液，將病毒懸液分裝。取3支病毒懸液，按Reed-Muench法計(jì)算該病毒滴度，病毒滴度達(dá)105.5TCID50/0.1 mL，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.8 中和劑試驗(yàn)

1.8.1 消毒劑、中和劑、中和產(chǎn)物對(duì)PK-15細(xì)胞的影響 參照2002年版《消毒技術(shù)規(guī)范》，主要目的是評(píng)估消毒劑、中和劑及中和產(chǎn)物(中和劑+消毒劑)對(duì)試驗(yàn)用PK-15細(xì)胞的影響。以0.5%硫代硫酸鈉PBS溶液作為中和劑，消毒劑用無(wú)菌硬水稀釋為最大試驗(yàn)濃度75 mg/L，試驗(yàn)在(20±2)℃下進(jìn)行。分為4組，第1組：中和劑；第2組：中和產(chǎn)物(中和劑+消毒劑)；第3組：消毒劑；第4組：細(xì)胞對(duì)照[7]。

1.8.2 消毒劑、中和劑、中和產(chǎn)物對(duì)病毒的影響 參照2002年版《消毒技術(shù)規(guī)范》，主要目的是評(píng)估消毒劑、中和劑及中和產(chǎn)物(消毒劑+中和劑)對(duì)試驗(yàn)用病毒滴度的影響。以0.5%硫代硫酸鈉PBS溶液作為中和劑，消毒劑用無(wú)菌硬水稀釋為雙倍最大試驗(yàn)濃度150 mg/L，試驗(yàn)在(20±2)℃下進(jìn)行，試驗(yàn)分為6組，第1組：病毒懸液+消毒劑；第2組：(病毒懸液+消毒劑)+中和劑；第3組：(標(biāo)準(zhǔn)硬水+病毒懸液)+中和劑；第4組：(消毒劑+中和劑)+病毒懸液；第5組：標(biāo)準(zhǔn)硬水+病毒懸液；第6組：不接毒細(xì)胞對(duì)照[7]。

1.9 病毒滅殺試驗(yàn) 參照2002年版《消毒技術(shù)規(guī)范》，評(píng)價(jià)消毒劑在不同濃度下，分別作用不同時(shí)間，對(duì)Thiveral株豬瘟病毒滅活效果。有機(jī)干擾物是含3%牛血清的PBS溶液，消毒劑用標(biāo)準(zhǔn)硬水分別稀釋為試驗(yàn)可用濃度，設(shè)置2個(gè)時(shí)間梯度(3 min和5 min)。將0.5 mL病毒懸液和0.5 mL有機(jī)干擾物混勻，加入消毒劑4 mL，使混合液中消毒劑有效物質(zhì)濃度含量分別維持在6.25、12.5、25 mg/L和50 mg/L，20 ℃水浴作用至預(yù)定時(shí)間，取上述消毒產(chǎn)物0.1 mL加中和劑0.9 mL，混勻作用10 min。測(cè)定病毒滴度。用無(wú)菌硬水代替消毒劑作為陽(yáng)性對(duì)照，進(jìn)行上述試驗(yàn)[7]。

病毒滅活率=(陽(yáng)性對(duì)照組病毒滴度-試驗(yàn)組病毒滴度)÷陽(yáng)性對(duì)照組病毒滴度×100%

2 結(jié)果

2.1 消毒劑、中和劑、中和產(chǎn)物對(duì)PK-15細(xì)胞的影響分析 試驗(yàn)結(jié)果見中插彩版圖1，將0.5%硫代硫酸鈉的PBS作為中和劑，作用試驗(yàn)細(xì)胞3 h，在光學(xué)顯微鏡下觀察，顯示細(xì)胞形態(tài)正常，生長(zhǎng)狀況良好。將2種消毒劑與中和劑形成的中和產(chǎn)物作用試驗(yàn)細(xì)胞3 h，均顯示細(xì)胞形態(tài)正常，生長(zhǎng)狀況良好。試驗(yàn)結(jié)果表明，中和劑與消毒劑和中和劑形成的中和產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)影響，與對(duì)照組相比并無(wú)明顯差異。

2.2 消毒劑、中和劑、中和產(chǎn)物對(duì)病毒的影響分析 試驗(yàn)結(jié)果見表1，以0.5%硫代硫酸鈉PBS溶液作為中和劑中和這2種供試消毒劑，均顯示第1組無(wú)病毒生長(zhǎng)，第2組與第1組相近且病毒含量遠(yuǎn)小于3、4、5組，3、4、5組的LogTCID50相近，第6組試驗(yàn)細(xì)胞生長(zhǎng)正常且無(wú)細(xì)胞病變。結(jié)果表明，此中和劑可有效中和這2種供試消毒劑對(duì)Thiveral株豬瘟病毒的殺滅作用，且中和劑與中和產(chǎn)物對(duì)Thiveral株豬瘟病毒和試驗(yàn)細(xì)胞無(wú)明顯影響。因此，以0.5%硫代硫酸鈉PBS溶液作為中和劑符合要求。

表1 中和劑鑒定試驗(yàn)結(jié)果

2.3 病毒滅殺試驗(yàn)分析 如表2所示，有效濃度為25 mg/L二氧化氯溶液作用3 min，對(duì)Thiveral株豬瘟病毒滅活率達(dá)100%，滅活效果達(dá)標(biāo)；如表3所示，有效濃度為25 mg/L的二氧化氯粉劑溶解液作用3 min，對(duì)Thiveral株豬瘟病毒滅活率達(dá)100%，滅活效果達(dá)標(biāo)；試驗(yàn)結(jié)果表明，二氧化氯溶液對(duì)Thiveral株豬瘟病毒殺滅效果良好，且與二氧化氯粉劑對(duì)Thiveral株豬瘟病毒殺滅效果相似，兩者濃度為25 mg/L時(shí)，均能殺滅Thiveral株豬瘟病毒。

表2 二氧化氯溶液對(duì)Thiveral株豬瘟病毒滅活效果

表3 二氧化氯粉劑對(duì)Thiveral株豬瘟病毒滅活效果

3 討論

本試驗(yàn)的主要目的是研究一種二氧化氯溶液對(duì)豬瘟病毒的滅殺效果，為二氧化氯對(duì)豬瘟病毒的消毒標(biāo)準(zhǔn)建立參考與理論依據(jù)，對(duì)二氧化氯類消毒劑應(yīng)用于豬場(chǎng)消毒提供指導(dǎo)建議。Thiveral株豬瘟病毒是中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供的一種標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)性病毒，在豬瘟類病毒中有普遍的代表性，且具有繁殖力強(qiáng)、培養(yǎng)時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)，能夠有效地縮短試驗(yàn)周期，因此試驗(yàn)使用Thiveral株豬瘟病毒作為消毒對(duì)象[8]。采用精確的病毒檢測(cè)方法是提高試驗(yàn)準(zhǔn)確性與科學(xué)性的前提，目前國(guó)際上對(duì)病毒含量檢測(cè)方法眾多，并無(wú)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，主要的方法有細(xì)胞感染法[9]、雞胚感染法[10]、動(dòng)物感染法[11]、熒光定量PCR[12]、RT-qPCR法[13]及免疫學(xué)等方法，本試驗(yàn)將細(xì)胞感染法與免疫熒光法相結(jié)合，利用滅活前后的Thiveral株豬瘟病毒分別感染PK-15細(xì)胞，然后使用免疫熒光法測(cè)定PK-15細(xì)胞的病變反應(yīng)，此法能夠精確的測(cè)定出豬瘟病毒含量。

中和劑試驗(yàn)證明了中和劑與中和產(chǎn)物對(duì)試驗(yàn)細(xì)胞無(wú)影響，且對(duì)病毒滴度也沒有影響，可以進(jìn)行病毒滅殺試驗(yàn)。病毒滅殺試驗(yàn)表明，濃度為12.5 mg/L二氧化氯溶液作用3 min，對(duì)Thiveral株豬瘟病毒滅活率達(dá)96.84%，當(dāng)作用時(shí)間延長(zhǎng)至5 min，對(duì)該病毒滅活率提高到99.11%；當(dāng)濃度提高到25 mg/L時(shí)，作用3 min，對(duì)該病毒滅活率達(dá)100%，能完全殺滅病毒。有效濃度為12.5 mg/L的二氧化氯粉劑溶解液，對(duì)Thiveral株豬瘟病毒作用3 min時(shí)，滅活率達(dá)99.07%，延長(zhǎng)作用時(shí)間至5 min，對(duì)該病毒滅活率上升至99.25%；當(dāng)濃度提高到25 mg/L時(shí)，作用3 min，對(duì)該病毒滅活率也可達(dá)100%。試驗(yàn)結(jié)果表明，二氧化氯溶液對(duì)Thiveral株豬瘟病毒殺滅效果良好，且與二氧化氯粉劑對(duì)Thiveral株豬瘟病毒殺滅效果相近，兩種消毒劑對(duì)該病毒的滅活效果相近的原因可能是由于兩者的有效成分均為二氧化氯。本試驗(yàn)結(jié)果表明，二氧化氯對(duì)豬瘟病毒具有良好的滅活效果，對(duì)二氧化氯類消毒劑應(yīng)用于豬場(chǎng)消毒具有指導(dǎo)意義。

作為理想的消毒劑應(yīng)該滿足廉價(jià)、低毒和高效這三大基本要素。二氧化氯作為國(guó)際公認(rèn)的高效、無(wú)毒和安全的綠色消毒劑，廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)、制藥、畜牧、公共環(huán)境等多領(lǐng)域，具有滅菌、消毒、防霉、保鮮等用途[14]，二氧化氯溶液具有無(wú)殘留、穩(wěn)定性好、價(jià)格低等優(yōu)點(diǎn)，有廣闊的應(yīng)用前景。