葉 蕾，李浩榕

（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院內(nèi)分泌代謝科 上海市內(nèi)分泌代謝病研究所上海市內(nèi)分泌腫瘤重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200025）

甲狀腺結(jié)節(jié)在臨床非常常見(jiàn)，采用觸診方式，其檢出率即可達(dá)4%～8%，而采用高分辨率B 超檢查則可在高達(dá)68%的人群中檢出甲狀腺結(jié)節(jié)。女性和老年人群的甲狀腺結(jié)節(jié)患病率更高[1-2]，其中7%～15%為甲狀腺癌[3-4]。甲狀腺結(jié)節(jié)按其生物學(xué)行為可分為良性、交界性、惡性三大類(lèi)。良性甲狀腺結(jié)節(jié)包括結(jié)節(jié)性甲狀腺腫、炎性結(jié)節(jié)、甲狀腺囊腫、濾泡性腺瘤等；惡性甲狀腺結(jié)節(jié)分為濾泡上皮來(lái)源和濾泡旁細(xì)胞來(lái)源，濾泡上皮來(lái)源又可根據(jù)其分化程度分為分化型甲狀腺癌、低分化型甲狀腺癌和未分化型甲狀腺癌。其中，分化型甲狀腺癌包括甲狀腺乳頭狀癌（papillary carcinoma of thyroid,PTC）和濾泡狀甲狀腺癌 （follicular thyroid cancer,FTC）2 種亞型，PTC 是最常見(jiàn)的甲狀腺惡性腫瘤。濾泡旁細(xì)胞來(lái)源的惡性結(jié)節(jié)即為甲狀腺髓樣癌，由于其分泌降鈣素，可由血清檢測(cè)檢出，相對(duì)容易診斷。

甲狀腺結(jié)節(jié)診治的關(guān)鍵點(diǎn)是良惡性的鑒別。目前，術(shù)前鑒別甲狀腺結(jié)節(jié)良惡性的金標(biāo)準(zhǔn)方法是在超聲引導(dǎo)下細(xì)針穿刺抽吸活檢（fine-needle aspiration biopsy，F(xiàn)NAB）聯(lián)合細(xì)胞學(xué)檢查。FNAB 檢查已經(jīng)使得甲狀腺結(jié)節(jié)患者術(shù)前診斷出甲狀腺癌的百分比有了顯著提升[5]。在Bethesda 分級(jí)為Ⅵ類(lèi)的結(jié)節(jié)中，甲狀腺癌的百分比高達(dá)99%[6]，但目前也仍有約25%的甲狀腺結(jié)節(jié)無(wú)法通過(guò)FNAB 檢查來(lái)判斷其良惡性，尤其是Bethesda 分級(jí)為Ⅲ～Ⅳ類(lèi)的結(jié)節(jié)，即濾泡性腺瘤或可疑濾泡性腺瘤以及不確定分類(lèi)的甲狀腺結(jié)節(jié)，其中惡性結(jié)節(jié)占6%～34%。在這種情況下，患者如接受手術(shù)，則需承受手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)以及終身甲狀腺激素替代治療，且其中75%的患者在術(shù)后被確診為良性甲狀腺結(jié)節(jié)；患者如選擇采用超聲及FNAB 檢查進(jìn)行隨訪(fǎng)，則需接受潛在的惡性腫瘤患病風(fēng)險(xiǎn)和心理負(fù)擔(dān)?？梢?jiàn)，避免甲狀腺結(jié)節(jié)患者接受過(guò)度治療的關(guān)鍵在于對(duì)Bethesda 分級(jí)為Ⅲ～Ⅳ類(lèi)的結(jié)節(jié)進(jìn)行術(shù)前診斷。近年，甲狀腺結(jié)節(jié)的相關(guān)基因檢測(cè)進(jìn)展為甲狀腺結(jié)節(jié)良惡性的定性提供了參考。

甲狀腺結(jié)節(jié)相關(guān)基因的突變及重組

一、甲狀腺癌相關(guān)基因的突變

體細(xì)胞基因變異是甲狀腺癌發(fā)生的主要原因[7]，與惡性結(jié)節(jié)相關(guān)的基因變異主要涉及MAPK通路和PI3K 通路，常見(jiàn)的突變基因包括BRAF、RAS、AKT1、PIK3CA、PTEN、TP53 以及RET/PTC 和PAX8/PPARG 基因重組等。學(xué)者研究了腫瘤基因組圖譜和中國(guó)人群PTC 基因圖譜后發(fā)現(xiàn)，絕大多數(shù)PTC 患者的扳機(jī)基因發(fā)生了改變，其中最常見(jiàn)的是BRAF V600E 突變,有45%的經(jīng)典型PTC 以及80%～100%的高細(xì)胞亞型PTC 患者存在該突變[8]；其他PTC常見(jiàn)的基因突變還包括RAS、EIF1AX 及RET/PTC基因重組等[7]。而FTC 常見(jiàn)的基因突變則有RAS、DICER1、PAX8/PPARG 基因重組等[9]。甲狀腺未分化癌（anaplastic thyroid carcinoma,ATC）中，TERT 基因突變最為常見(jiàn),出現(xiàn)頻率為55.56%。74.07%的ATC 患者發(fā)生抑癌基因突變，其中TP53 頻率最高，為48.15%[10]。甲狀腺髓樣癌的致病基因?yàn)镽ET，主要以點(diǎn)突變?yōu)橹?。除此之外，miRNA 表達(dá)異常、甲基化等表觀(guān)遺傳學(xué)異常也被證實(shí)與甲狀腺癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。

二、良性甲狀腺結(jié)節(jié)相關(guān)的基因突變

部分良性甲狀腺結(jié)節(jié)也存在體細(xì)胞驅(qū)動(dòng)基因變異。在甲狀腺良性結(jié)節(jié)中，自主高功能性腺瘤與TSHR、GNAS、EZH1 基因突變有關(guān)[11]；腺瘤樣結(jié)節(jié)與SPOP、EZH1 與ZNF148 這3 個(gè)基因突變有關(guān)。良性甲狀腺結(jié)節(jié)與惡性甲狀腺結(jié)節(jié)之間不僅具有不同的突變譜，兩者的遺傳進(jìn)化也不相同[12]。值得注意的是，RAS 突變雖然在甲狀腺良惡性結(jié)節(jié)中均有出現(xiàn)，但當(dāng)合并不同其他基因突變時(shí)，研究者有不同的解讀意義。

對(duì)各類(lèi)甲狀腺結(jié)節(jié)分子機(jī)制的深入研究為甲狀腺結(jié)節(jié)的分子診斷提供了詳實(shí)的依據(jù)。2015 年，美國(guó)甲狀腺協(xié)會(huì)建議將分子診斷納入良惡性甲狀腺結(jié)節(jié)鑒別診斷的手段[12]。分子診斷能在FNAB檢查的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步提高惡性甲狀腺結(jié)節(jié)術(shù)前診斷的準(zhǔn)確率，尤其是可提高濾泡性腺瘤或可疑濾泡性腺瘤以及不確定分類(lèi)的甲狀腺結(jié)節(jié)的診斷準(zhǔn)確率。

基于體細(xì)胞基因的分子診斷

一、單基因分子診斷

1.BRAF：BRAF 基因突變是診斷甲狀腺癌價(jià)值最高的基因突變。良性甲狀腺結(jié)節(jié)中幾乎不存在BRAF 基因突變，而高達(dá)80%的PTC 中存在BRAF V600E 突變。薈萃分析顯示，BRAF V600E 突變檢測(cè)診斷PTC 的特異度和陽(yáng)性預(yù)測(cè)值均高達(dá)100%[13]。在缺乏FNAB 檢查提示的惡性證據(jù)時(shí)，BRAF V600E 突變強(qiáng)烈提示PTC 可能。除診斷價(jià)值外，BRAF V600E 突變可能還與PTC 患者的預(yù)后相關(guān)。多中心、大樣本隊(duì)列研究發(fā)現(xiàn)，存在BRAF V600E突變的PTC 患者死亡風(fēng)險(xiǎn)較無(wú)該突變的PTC 患者增加了2.66 倍，而其復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)則增加了1.82 倍[14]。但也有研究不支持該結(jié)果，因此還需要進(jìn)一步收集更多的研究數(shù)據(jù)來(lái)明確BRAF 單基因突變預(yù)測(cè)預(yù)后的價(jià)值。

2.RAS：RAS 突變雖然是FTC 最常見(jiàn)、PTC 第二常見(jiàn)的基因突變，但其在良性結(jié)節(jié)中也存在。因此，如果細(xì)胞學(xué)檢查提示結(jié)節(jié)為良性，而患者存在RAS 單基因突變，建議以隨訪(fǎng)為主，但患者如果還合并有其他基因突變，特別是TERT 啟動(dòng)子區(qū)、EIF1AX 或TP53 突變時(shí)，則預(yù)示其為高侵襲性甲狀腺癌的風(fēng)險(xiǎn)明顯增高。

3.TERT：TERT 是具有預(yù)后價(jià)值的基因，尤其是與BRAF 突變同時(shí)存在時(shí)，提示患者預(yù)后不良。TERT 基因突變?cè)贏(yíng)TC 中最為常見(jiàn)，出現(xiàn)頻率為55.56%。BRAF 與TERT 雙突變則預(yù)示PTC 患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)將增加9.34 倍，復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)增加8.51 倍[15]。因此，聯(lián)合檢測(cè)BRAF 和TERT 突變具有預(yù)后判斷價(jià)值。

4.RET：RET 基因重組是PTC 的特征性突變之一，而RET 基因點(diǎn)突變是則甲狀腺髓樣癌的特征性突變。RET/PTC 基因重組在PTC 中的發(fā)生率為6.8%；約25%的甲狀腺髓樣癌患者攜帶胚系RET基因突變，臨床可表現(xiàn)為多發(fā)性?xún)?nèi)分泌腺瘤病Ⅱ型，故胚系RET 基因突變檢測(cè)對(duì)多發(fā)性?xún)?nèi)分泌腺瘤?、蛐途哂性\斷價(jià)值，而75%的散發(fā)MIT 患者存在體細(xì)胞RET 基因突變。

總之，單基因的DNA 水平分子診斷成本低、操作方便、解讀簡(jiǎn)單。然而，單個(gè)基因的診斷價(jià)值有限 （如RAS），或者預(yù)后判斷價(jià)值有限 （如BRAF 或TERT），單個(gè)基因突變也不足以同時(shí)診斷各類(lèi)型甲狀腺結(jié)節(jié)，還存在樣本量和診斷周期問(wèn)題。因此，單基因檢測(cè)已經(jīng)不能滿(mǎn)足臨床診斷的需求。

二、多基因分子診斷

隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，針對(duì)體細(xì)胞基因突變的靶向第二代測(cè)序技術(shù)開(kāi)始被應(yīng)用于不確定分類(lèi)的甲狀腺結(jié)節(jié)FNAB 檢查中。2011 年，匹茲堡大學(xué)病理系的Nikiforov 等[16]首次報(bào)道了7 個(gè)基因的聯(lián)合突變檢測(cè)，包括BRAF V600E、NRAS codon 61、HRAS codon 61 和KRAS codons 12/13 點(diǎn)突變，以及RET/PTC1、RET/PTC3、PAX8/PPAR 重組，使得陽(yáng)性預(yù)測(cè)值達(dá)到95%。2013 年，ThyroSeq開(kāi)始進(jìn)入大家的視野[17]，第1 版包括了12 個(gè)基因（BRAF、NRAS、KRAS、HRAS、CTNNB1、PIK3CA、RET、PTEN、TSHR、AKT1、TP53 與GNAS）。3 年后，第1版本升級(jí)為T(mén)hyroSeq 第2 版[18]，增加了TERT 熱點(diǎn)變異檢測(cè) （C228T、C250T） 和42 種融合基因檢測(cè)（RET、PAX8 融合基因等）。前瞻性研究的數(shù)據(jù)表明，第2 版對(duì)于FNAB 檢查分類(lèi)為濾泡性腺瘤或可疑濾泡性腺瘤的診斷準(zhǔn)確率達(dá)到92%[19]。2018 年ThyroSeq 第3 版發(fā)布，增加至112 個(gè)基因，除點(diǎn)突變及融合基因之外，其還納入拷貝數(shù)變異和基因表達(dá)異常。該第3 版基于多基因的 “基因分類(lèi)器（genomic classifier）” 診斷甲狀腺癌的靈敏度達(dá)到98.0%，特異度達(dá)81.8%，準(zhǔn)確率達(dá)到90.9%[20]。之后，美國(guó)和加拿大的2 項(xiàng)前瞻性研究均證實(shí)其具有高效的診斷價(jià)值。美國(guó)的多中心、雙盲前瞻性研究納入了286 例FNAB 檢查結(jié)果不明確的甲狀腺結(jié)節(jié)患者，結(jié)果顯示，ThyroSeq 第3 版診斷甲狀腺癌的靈敏度為94%，特異度為82%，良性報(bào)告率為61%，在報(bào)告為良性的甲狀腺結(jié)節(jié)中，僅有3% 惡性風(fēng)險(xiǎn)[21]，這與FNAB 檢查結(jié)果為良性的惡性風(fēng)險(xiǎn)一致。加拿大的單中心研究納入了50 例FNAB 檢查結(jié)果不明確的病例，結(jié)果顯示，ThyroSeq 第3 版的良性報(bào)告率為58%，其評(píng)估為陽(yáng)性的24 例樣本，術(shù)后病理均為惡性；檢測(cè)結(jié)果為陰性的26 例患者中有3 例行手術(shù)，術(shù)后病理檢查提示僅1 例為惡性[22]。

基于RNA 和miRNA 表達(dá)的分子診斷

一、基于RNA 的分子診斷

過(guò)去，基于RNA 表達(dá)的分子診斷，其最大瓶頸是靈敏度不足。直到2010 年，來(lái)自Veracyte 公司的Kennedy 博士團(tuán)隊(duì)運(yùn)用FNAB 檢查結(jié)果的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，在納入100 余個(gè)在良惡性結(jié)節(jié)間差異表達(dá)的基因之后，初步發(fā)現(xiàn)基因表達(dá)譜分析診斷甲狀腺癌的靈敏度達(dá)到95%，特異度為75%。2012 年，新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志發(fā)表了多中心、前瞻性研究結(jié)果，研究者在之前研究的基礎(chǔ)上，選擇了167 個(gè)基因，建立了Afirma Gene Expression Classifier （Afirma GEC）表達(dá)譜芯片，發(fā)現(xiàn)Afirma GEC 診斷甲狀腺濾泡性腺瘤或可疑濾泡性腺瘤的陰性預(yù)測(cè)值達(dá)到96%，靈敏度高達(dá)92%，但特異度僅為52%[24]。2018 年，在A(yíng)firma GEC 的基礎(chǔ)上，學(xué)者采用第二代測(cè)序技術(shù)構(gòu)建了Genomic Sequencing Classifier（GSC），其納入了1 115 個(gè)核心基因進(jìn)行綜合分析，GSC 在陰性預(yù)測(cè)值維持在96%的情況下，可將特異度提高至91%[25]。

有研究對(duì)Afirma GEC、GSC 與ThyroSeq 系列的診斷效能進(jìn)行了比較分析。2018 年，一項(xiàng)平行隨機(jī)對(duì)照研究直接比較了Afirma GEC 與ThyroSeq第2 版在Bethesda Ⅲ、Bethesda Ⅳ結(jié)節(jié)中的診斷效能[26]，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ThyroSeq 第2 版的診斷特異度更高（66%比91%），其可以讓更多的受試者避免診斷性手術(shù)，兩者的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值則分別為39%和57%。39%接受Afirma GEC 檢測(cè)的患者避免了診斷性甲狀腺腺葉切除，而62%接受ThyroSeq 第2 版檢測(cè)的患者避免了手術(shù)。

二、基于miRNAs 的分子診斷

業(yè)內(nèi)對(duì)基于miRNAs 的分子診斷，認(rèn)可度相對(duì)較低。早在2008 年，研究發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于良性甲狀腺結(jié)節(jié)，甲狀腺癌組織具有特異的miRNA 表達(dá)譜，且病理類(lèi)型不同，miRNA 表達(dá)譜也不同。甲狀腺髓樣癌與濾泡細(xì)胞來(lái)源的甲狀腺癌miRNA 表達(dá)譜完全不同。miR-187、miR-221、miR-222、miR-181b、miR-146b、miR-155、miR-224 在濾泡細(xì)胞來(lái)源的甲狀腺癌中均一致高表達(dá)。而在A(yíng)TC 中，這7 個(gè)miRNA表達(dá)的水平較低，但miR-302c、miR-205、miR-137會(huì)有顯著的高表達(dá)。該研究提示，檢測(cè)miRNA 異常表達(dá)可能也可以作為甲狀腺癌的分子診斷方法[27]。2018 年，基于19 種miRNAs 表達(dá)的panel （包含miR-221、miR-222 和miR-146b 等）發(fā)表，結(jié)果證實(shí)其能夠從FNAB 檢查結(jié)果不確定的甲狀腺結(jié)節(jié)中準(zhǔn)確鑒別出分化良好的甲狀腺癌，其診斷特異度和陽(yáng)性預(yù)測(cè)值均為100%，陰性預(yù)測(cè)值為87%，靈敏度為91%，總體準(zhǔn)確率達(dá)到了94%[28]。

不同分子診斷平臺(tái)的比較及分子診斷的局限性

一、不同分子診斷平臺(tái)

上述幾種分子診斷共同的優(yōu)勢(shì)在于陰性預(yù)測(cè)價(jià)值較高，因此主要臨床用途為避免不必要的手術(shù)，但陽(yáng)性預(yù)測(cè)值尚待進(jìn)一步提升，尤其是Afirma GEC、GSC 平臺(tái)。ThyroSeq，尤其是第3 版本綜合了DNA 和RNA 檢查，使得陽(yáng)性預(yù)測(cè)值在Bethesda Ⅲ類(lèi)結(jié)節(jié)中達(dá)到77%，Ⅳ類(lèi)結(jié)節(jié)中達(dá)到83%。但這需要同時(shí)獲取FNAB 的DNA 和RNA 樣本，分別建庫(kù)測(cè)序，因此檢測(cè)成本也大幅提高。目前，以上幾類(lèi)平臺(tái)均未進(jìn)入中國(guó)，因而其在我國(guó)甲狀腺結(jié)節(jié)患者中的診斷價(jià)值尚未被確認(rèn)。目前，國(guó)內(nèi)有多個(gè)企業(yè)自主研發(fā)的甲狀腺癌基因檢測(cè)panel，但納入基因數(shù)量普遍偏少，缺少大樣本的人群數(shù)據(jù)證實(shí)其診斷價(jià)值。

二、分子診斷的局限性

雖然分子診斷為甲狀腺良惡性結(jié)節(jié)的術(shù)前診斷提供了有效的工具，但是存在取材失敗、費(fèi)用昂貴、缺失有效信息的風(fēng)險(xiǎn)分層標(biāo)志物等方面的問(wèn)題，極大限制了其被廣泛應(yīng)用。比如取材問(wèn)題，雖然甲狀腺因其獨(dú)特的解剖學(xué)位置，醫(yī)師能通過(guò)細(xì)針穿刺獲取組織，但FNAB 穿刺樣本仍有其特殊性，約1%的穿刺樣本中濾泡細(xì)胞數(shù)量太少，無(wú)法獲得可靠的分子診斷數(shù)據(jù)。此外，標(biāo)本中攜帶陽(yáng)性突變腫瘤細(xì)胞的百分比也會(huì)直接影響陽(yáng)性位點(diǎn)的檢出。昂貴的檢測(cè)成本也是一個(gè)重要的問(wèn)題，雖然測(cè)序成本日益下降，然而這些商業(yè)檢測(cè)方案的價(jià)格仍舊很昂貴。在我國(guó)，醫(yī)療手術(shù)費(fèi)用遠(yuǎn)低于西方國(guó)家，因此當(dāng)分子檢測(cè)成本接近手術(shù)費(fèi)用時(shí)，更多的患者和醫(yī)務(wù)人員會(huì)直接選擇手術(shù)。最后，目前缺乏提示甲狀腺癌風(fēng)險(xiǎn)分層的分子事件，不能有效指導(dǎo)手術(shù)治療的范圍和隨訪(fǎng)管理方案。

前景及展望

精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)包括精準(zhǔn)診斷和精準(zhǔn)治療，是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的發(fā)展趨勢(shì)。因此，甲狀腺結(jié)節(jié)的分子診斷也是大勢(shì)所趨。目前，真實(shí)世界數(shù)據(jù)已經(jīng)證實(shí)分子診斷可以避免相當(dāng)數(shù)量的甲狀腺結(jié)節(jié)患者接受不必要的手術(shù)。未來(lái)希望分子檢測(cè)能夠進(jìn)一步降低成本，并在甲狀腺癌風(fēng)險(xiǎn)分層方面提供更多的臨床幫助，實(shí)現(xiàn)分子診斷預(yù)測(cè)甲狀腺結(jié)節(jié)患者預(yù)后的價(jià)值。