王睿思，喬柏一，周曉馥

（吉林師范大學(xué)/吉林省植物資源科學(xué)與綠色生產(chǎn)重點(diǎn)試驗(yàn)室，吉林四平 136000）

月季（Rosa chinensis minima）系薔薇科（Rosaceae）薔薇屬（Rosa）落葉或半落葉低矮型灌木。其香味獨(dú)特，花色奇異，花型雅致，作為傳統(tǒng)的四大切花的材料之一，具有獨(dú)特的經(jīng)濟(jì)價(jià)值?；ǘ浯厣騿紊?，花徑3～5cm，花期不斷，易栽培，適應(yīng)性強(qiáng)，是目前較為流行的花卉種質(zhì)資源[1]。隨著市場(chǎng)對(duì)其需求的逐漸增多，對(duì)其組織培養(yǎng)技術(shù)的研究和改進(jìn)已成為熱點(diǎn)[2]。而有關(guān)外界條件對(duì)月季花誘導(dǎo)的研究卻少之又少，仍有待深入。

成花誘導(dǎo)是高等植物生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，也是植物花器官分化，由發(fā)育生長(zhǎng)過(guò)渡到生殖生長(zhǎng)的重要過(guò)程，這一過(guò)程直接影響花卉的品質(zhì)[3]。月季作為觀賞植物，研究其成花機(jī)制具有重要意義[4]。植物成花主要受溫度、光照、脅迫、誘導(dǎo)條件、外源激素等環(huán)境條件的影響[5]。

蔗糖作為主要碳源之一，在植物成花過(guò)程中具有誘導(dǎo)作用，蔗糖不僅是植物成花的關(guān)鍵調(diào)控因素，還會(huì)一定程度上影響培養(yǎng)物的生長(zhǎng)勢(shì)[6]?？扇苄哉崽鞘侵参锕夂献饔冒捣磻?yīng)階段的有機(jī)合成產(chǎn)物，通過(guò)糖類運(yùn)輸?shù)姆绞揭跃S持體內(nèi)滲透壓并為植物組織提供碳源[7]。植物利用H+-蔗糖協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)的機(jī)制，將光合作用中產(chǎn)生的蔗糖運(yùn)至葉脈的專門細(xì)胞中，通過(guò)維管組織將蔗糖分配到非光合組織。在植物組織培養(yǎng)初期，植物不具備光合作用的能力，因此培養(yǎng)基中的蔗糖可以為幼嫩植物體供能，且有助其他物質(zhì)的合成。

本研究在月季微繁體系基礎(chǔ)上，以月季莖段外植體為材料，通過(guò)月季莖段花芽誘導(dǎo)培養(yǎng)，以及芽增殖培養(yǎng)等手段，探究不同蔗糖濃度對(duì)微型月季組培苗花誘導(dǎo)的影響。以期為優(yōu)化微型月季的組織培養(yǎng)技術(shù)提供參考，為日后植物成花誘導(dǎo)的微觀水平研究提供依據(jù)[8]。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試植株。微型月季，由吉林省植物資源科學(xué)與綠色生產(chǎn)重點(diǎn)試驗(yàn)室培育。

1.1.2 供試培養(yǎng)基。MS固體培養(yǎng)基。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)材料擴(kuò)繁。將微型月季無(wú)菌苗在超凈工作臺(tái)中切成1.5cm左右?guī)б秆康那o段，形態(tài)學(xué)下端接種于蔗糖30g/L，瓊脂7g/L，6-BA 2mL/L，IBA 1mL/L，活性炭0.6g/L，pH值為5.83～5.85的初代基本MS培養(yǎng)基中，培育環(huán)境為：25℃、光照強(qiáng)度2000Lx、光照時(shí)長(zhǎng)16h/d。每隔一段時(shí)間觀察培養(yǎng)情況。

1.2.2 花誘導(dǎo)培養(yǎng)。將微型月季無(wú)菌莖段接種于以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)花誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，設(shè)置蔗糖濃度梯度，花誘導(dǎo)培養(yǎng)基中附加濃度分別為50g/L、40g/L、30g/L、20g/L、10g/L的蔗糖，具體培養(yǎng)基中激素濃度組合見(jiàn)表1。將微型月季無(wú)菌莖段接種到5種不同蔗糖濃度花誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，每瓶中均勻接3個(gè)微型月季無(wú)菌莖段（接種密度為3株/瓶），每處理均設(shè)3次重復(fù)。

接種后標(biāo)注日期，置于智能人工氣候箱中進(jìn)行花芽誘導(dǎo)培養(yǎng)40d，培育環(huán)境為：25℃，光照周期16h/8h（d/n），光照強(qiáng)度2000Lx。

表1 花誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方

1.2.3 芽增殖培養(yǎng)。40d后將花芽誘導(dǎo)后的組培苗轉(zhuǎn)入芽增殖培養(yǎng)基：MS+NAA 0.1mg/L+TDZ 1.0mg/L+活性炭0.6g/L+蔗糖30g/L+瓊脂7g/L（pH值5.83～5.85）中，置于人工氣候箱中培養(yǎng)10d后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.3 結(jié)果觀測(cè)與統(tǒng)計(jì)方法

花芽未分化前觀察并記錄不定芽的生長(zhǎng)情況?；ㄑ砍霈F(xiàn)后，記錄產(chǎn)生花芽的個(gè)數(shù)與花芽分化情況。花芽進(jìn)一步分化后,觀察花蕾狀況，包括花蕾大小、花色、形狀、花期等植物生理信息。并取不同處理的叢生芽，觀察其花芽形態(tài)。50d時(shí)統(tǒng)計(jì)不同處理組的成花率。成花率（%）=誘導(dǎo)出花蕾的植株數(shù)/無(wú)菌苗總數(shù)×100。數(shù)據(jù)采用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果與分析

經(jīng)不同濃度蔗糖處理的月季無(wú)菌苗莖段8d、15d、30d、40d時(shí)，莖段的花芽分化情況有所不同。0～8d時(shí)，所有經(jīng)處理的莖段均未見(jiàn)花芽分化；15d時(shí)，10mg/L、20mg/L、50mg/L蔗糖濃度下的月季莖段無(wú)花芽形成，而40mg/L、30mg/L蔗糖濃度下月季莖段已出現(xiàn)花芽分化；30d時(shí)，多數(shù)植株出現(xiàn)花芽分化，且各蔗糖濃度下花芽生長(zhǎng)狀況不同，40mg/L時(shí)形成的花芽數(shù)量多于其他蔗糖濃度下形成的花芽，50mg/L蔗糖濃度下多數(shù)月季莖段仍無(wú)花芽形成；40d時(shí)各組別成花程度與生長(zhǎng)狀況明顯不同，以后仍有相似的趨勢(shì)。如圖1所示。

圖1 各蔗糖濃度培養(yǎng)基中組培苗成花情況（40d）

為了進(jìn)一步探究蔗糖濃度對(duì)微型月季成花誘導(dǎo)的關(guān)系，使用SPSS軟件對(duì)蔗糖濃度與花芽數(shù)和誘導(dǎo)率進(jìn)行單因素方差分析并進(jìn)行多重比較。

由表2可知，在第50d，經(jīng)統(tǒng)計(jì)得出：微型月季無(wú)菌苗在蔗糖濃度梯度為10g/L、20g/L、30g/L、40g/L、50g/L的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，各組成花率分別為23.6%，35.7%，54.1%，87.60%，45.4%。蔗糖濃度一定程度影響無(wú)菌苗的成花誘導(dǎo)，在10～40g/L蔗糖濃度之間，花芽數(shù)隨蔗糖濃度的增加而增加，以40g/L為最適宜花芽的形成；當(dāng)蔗糖濃度高于40g/L時(shí)，成花率呈明顯下降趨勢(shì)。蔗糖濃度為40g/L的處理組，成花率最高，為87.6%，且花色適宜，花蕾生長(zhǎng)良好，因此最適花誘導(dǎo)的蔗糖濃度為40g/L。P值為0.00，小于顯著性水平0.05，蔗糖濃度對(duì)微型月季花芽誘導(dǎo)率影響顯著。

經(jīng)數(shù)據(jù)多重比較處理后發(fā)現(xiàn)，5種蔗糖濃度在0.05顯著水平上，蔗糖濃度10g/L成花率顯著低于蔗糖濃度20g/L，蔗糖濃度20g/L的成花率顯著低于蔗糖濃度50g/L，蔗糖濃度50g/L成花率顯著低于蔗糖濃度30g/L，蔗糖濃度30g/L的成花率顯著低于蔗糖濃度40g/L，且高濃度（40g/L）微型月季處理組別成花率極顯著高于低濃度蔗糖（20g/L、30g/L）處理組別。處理在各平均數(shù)間，字母標(biāo)記各不相同，因此各濃度間有顯著性差異。蔗糖是影響微型月季成花率的主導(dǎo)因子。

表2 蔗糖濃度對(duì)月季成花的影響

蔗糖濃度變化對(duì)微型月季生長(zhǎng)勢(shì)也產(chǎn)生一定影響，表2顯示10～30g/L之間，生長(zhǎng)勢(shì)隨蔗糖濃度的升高而加強(qiáng)；糖濃度大于40g/L，無(wú)菌苗的生長(zhǎng)勢(shì)呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，50g/L高濃度蔗糖誘導(dǎo)下的微型月季植株出現(xiàn)矮化現(xiàn)象，抑制了植株的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)。從花蕾生長(zhǎng)狀況看，不同蔗糖濃度月季花期與花色，花蕾緊湊情況均有所不同。

3 結(jié)論

3.1 花芽誘導(dǎo)率隨蔗糖濃度升高而增加，過(guò)高濃度蔗糖抑制花芽形成

在微型月季花芽誘導(dǎo)的試驗(yàn)過(guò)程中，通過(guò)培養(yǎng)基中附加蔗糖濃度梯度的設(shè)置，發(fā)現(xiàn)蔗糖對(duì)微型月季組培苗成花率影響顯著。結(jié)果顯示，當(dāng)蔗糖濃度在10～40g/L范圍內(nèi)時(shí)，組培苗成花率隨蔗糖濃度增加不斷升高，且微型月季花蕾生長(zhǎng)狀況良好，花蕾直徑增大，這說(shuō)明在一定的蔗糖濃度內(nèi)，蔗糖促進(jìn)成花誘導(dǎo)過(guò)程。當(dāng)蔗糖濃度達(dá)到40g/L時(shí)，隨著蔗糖濃度的增加，成花率顯著下降。表明蔗糖濃度過(guò)高，抑制組培苗形成花芽進(jìn)而降低成花率。確定了最佳蔗糖濃度為40g/L，在此濃度下組培苗成花率最高，為87.6%。在周俊輝等人的試管開(kāi)花誘導(dǎo)的研究也得到了相似的結(jié)論。

3.2 蔗糖濃度影響月季植株生長(zhǎng)勢(shì)水平

微型月季生長(zhǎng)勢(shì)反映了植株生長(zhǎng)發(fā)育的旺盛程度。蔗糖濃度較低情況下，微型月季生長(zhǎng)勢(shì)較弱，適宜蔗糖濃度促進(jìn)植株?duì)I養(yǎng)生長(zhǎng)，而過(guò)高蔗糖濃度下植株生長(zhǎng)緩慢，引起月季不定芽節(jié)間間距減小，體現(xiàn)為植株矮化。甚至有異?；ɡ?、畸形植株的出現(xiàn)，植株的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)受到抑制。

4 討論

研究結(jié)果表明，蔗糖濃度可影響微型月季植株的成花率，花蕾狀態(tài)與生長(zhǎng)勢(shì)，蔗糖在微型月季花誘導(dǎo)的過(guò)程中，作為關(guān)鍵因子產(chǎn)生了積極影響[9]。蔗糖在高等植物中不可或缺。分析前人的研究發(fā)現(xiàn)，蔗糖的花誘導(dǎo)機(jī)制主要與以下因素有關(guān)：蔗糖是光合作用的主要產(chǎn)物，在植物器官作為代謝原料提供能量，形成的中間產(chǎn)物為其他生物大分子的合成提供碳骨架[10]。在寧志珩的脫毒馬鈴薯試管薯誘導(dǎo)的研究中有提到。與此同時(shí)，蔗糖還涉及植物糖信號(hào)的介導(dǎo)，影響相關(guān)基因的活性?；ㄑ糠只俏⑿驮录境苫ǖ氖滓獩Q定條件[11]?；ㄕT導(dǎo)機(jī)制的敏感性很大程度上受到蔗糖這一營(yíng)養(yǎng)條件的限制[12]。在微型月季花誘導(dǎo)的過(guò)程中，蔗糖作為重要因子影響植物生長(zhǎng)進(jìn)程。前人的研究發(fā)現(xiàn)表明，蔗糖除影響培養(yǎng)基的滲透勢(shì)外，在分子水平還可以作為特殊信號(hào)，調(diào)控開(kāi)花基因，使其處于高表達(dá)狀態(tài)。微型月季的4個(gè)開(kāi)花途徑:春化途徑、光周期途徑、赤霉素途徑和自主途徑，均與以FT基因?yàn)橹行牡拈_(kāi)花基因密切相關(guān)[13]。在植物成花誘導(dǎo)期間，蔗糖含量往往出現(xiàn)短期的增加。王恒以夏菊為試驗(yàn)材料，通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，證實(shí)了受蔗糖誘導(dǎo)的FT基因即“開(kāi)花素”基因參與花期調(diào)控[14]。石永春等同樣發(fā)現(xiàn)蔗糖能夠上調(diào)頂芽中FT基因的表達(dá),促使長(zhǎng)日照植物在日照時(shí)間不足的情況下開(kāi)花。在對(duì)其他成花基因突變體進(jìn)行蔗糖處理，仍能夠誘導(dǎo)花的形成[15]。因此認(rèn)為，蔗糖可能通過(guò)促進(jìn)FT基因和其他成花基因的表達(dá)而誘導(dǎo)開(kāi)花。

此外蔗糖可以代替環(huán)境信號(hào)調(diào)控植物的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)，影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育，進(jìn)而影響生長(zhǎng)勢(shì)。本研究中發(fā)現(xiàn)蔗糖濃度變化，微型月季生長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)弱有所不同。分析前人研究發(fā)現(xiàn)，蔗糖含量的波動(dòng)以信號(hào)的形式調(diào)控激素或其他信號(hào)途徑，影響植株的生長(zhǎng)狀態(tài)。例如，在李瑞杰等[16]的研究中發(fā)現(xiàn)蔗糖對(duì)植物中乙烯的含量存在負(fù)調(diào)控。近年來(lái)蔗糖作為植物信號(hào)分子調(diào)控機(jī)制的研究有所增多，但蔗糖在組織中如何進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)仍不明確，仍有待進(jìn)一步研究[17]。

本研究探究了不同蔗糖濃度對(duì)微型月季組培苗花誘導(dǎo)的影響，確定了最佳蔗糖濃度，并根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果與前人的研究經(jīng)驗(yàn)，從生理生化以及分子生物學(xué)等角度分析了其內(nèi)在原因，從而為蔗糖對(duì)微型月季的花誘導(dǎo)機(jī)制提供了寶貴經(jīng)驗(yàn)。隨著技術(shù)手段的發(fā)展和研究水平的深入，蔗糖對(duì)微型月季的花誘導(dǎo)機(jī)制會(huì)更加完善，從而為植物生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控提供新的理論支撐。