周樹(shù)功，張曉雅，張運(yùn)峰

(1.唐山師范學(xué)院 數(shù)學(xué)與信息科學(xué)系， 河北 唐山 063000；2.唐山師范學(xué)院 生命科學(xué)系，河北 唐山 063000)

【研究意義】玉米大斑病(Northern Corn Leaf Blight)是一種嚴(yán)重威脅玉米生產(chǎn)的真菌性病害，在全球溫濕地區(qū)的玉米產(chǎn)地均有發(fā)生，在我國(guó)華北、東北地區(qū)的春玉米產(chǎn)區(qū)和南方海拔較高、氣溫較低的山區(qū)較易流行，發(fā)生嚴(yán)重的年份感病品種減產(chǎn)50 %左右[1]，已經(jīng)成為玉米生產(chǎn)中的重要限制因素[2]。BCK1同源基因在致病真菌中具有細(xì)胞完整性、分生孢子發(fā)育及色素形成方面具有作用[3]，從分子水平確定基因的功能位點(diǎn)，不僅有利于闡明Slt2-homolog途徑作用機(jī)制，還對(duì)尋找防治玉米大斑病菌的新作用靶點(diǎn)奠定基礎(chǔ)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】許多植物病原真菌的生長(zhǎng)發(fā)育都受到胞外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的調(diào)控，如MAPK、cAMP及Ga2+途徑等，尤其是MAPK 途徑對(duì)植物病原真菌生長(zhǎng)發(fā)育和致病性調(diào)節(jié)作用的研究較多[3]。通過(guò)進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在玉米大斑病菌中存在4種MAPK信號(hào)通路，分別是Fus3/Kss1-homolog、Slt2-homolog、Hog1-homolog、Ime2-homolog，4種途徑有著不同的功能：Fus3/Kss1-homolog途徑首先是活化的StSte11激活StSte7，活化的StSte7激活StKss1，被激活的StKss1再激活其他下游靶蛋白參與調(diào)控附著胞后期發(fā)育及病菌的侵入過(guò)程；Slt2-homolog途徑首先活化的StBCK1激活StMkk1，StMkk1激活StSlt2調(diào)控附著胞的侵入及致病性、分生孢子的形成的過(guò)程；Hog1-homolog途徑主要參與調(diào)控病菌的脅迫反應(yīng)及致病性[4]；Ime2-homolog為一條新發(fā)現(xiàn)的MAPK 級(jí)聯(lián)途徑[5]。StBCK1作為Slt2-homolog途徑的關(guān)鍵因子具有重要作用，參與細(xì)胞壁的完整性、分生孢子形成與侵染等?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】雖然StBCK1在玉米大斑病的發(fā)育中起到重要作用，但StBCK1功能的關(guān)鍵位點(diǎn)尚不清楚菌。本研究擬通過(guò)研究不同生理小種的StBCK1基因和蛋白的差異位點(diǎn)，闡明StBCK1基因差異，初步確定StBCK1蛋白的功能位點(diǎn)?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究將確定StBCK1基因功能結(jié)構(gòu)域在不同小種間的保守性，尋找該基因的差異位點(diǎn)，闡明位點(diǎn)差異對(duì)蛋白功能的潛在影響。

1 材料與方法

1.1 菌種

玉米大斑病菌01-23(1號(hào)，Ht2 Ht3 Htn /Ht1)，11-52A(1N號(hào)，Ht2 Ht3 /Ht1 Htn)，11-07D(13號(hào)，Ht2 Htn/Ht1 Ht3)，11-29E(0號(hào)，Ht1 Ht2 Ht3 Htn/0)菌株由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)真菌毒素試驗(yàn)室饋贈(zèng)。

1.2 試劑

真菌基因組提取試劑盒，TA克隆試劑盒，rTaq酶及StBCK1引物由生工(上海)生物技術(shù)公司合成。70 % 乙醇、CTAB、氯仿、異戊醇、β-巰基乙醇、無(wú)水乙醇均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 方法

1.3.1 菌絲體培養(yǎng)和收集 將保藏菌株接種于PDA固體培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)，培養(yǎng)5 d。將在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)5 d左右的菌絲接入裝有液體培養(yǎng)基的三角燒瓶中，100 r/min,28 ℃恒溫培養(yǎng)5～6 d。

1.3.2 基因組DNA的提取和檢測(cè) 利用CTAB法提取玉米大斑病菌的基因組。瓊脂糖凝膠檢測(cè)玉米大斑病菌基因組DNA。取2 μl DNA樣品檢測(cè)DNA質(zhì)量。

1.3.3StBCK1基因結(jié)構(gòu)域PCR和克隆 PCR體系(50 μl)：10×PCR buffer 5 μl，dNTP 3 μl，StBCK1-L(5’-TACCCCAGGACCATCTACCCAG-3’)3 μl，StBCK1-R(5’- GCAATAGACAGAGACCAGAAC AGTG-3’)3 μl，0.5 μl rTaq聚合酶，加ddH2O至50 μl。反應(yīng)過(guò)程：95 ℃ 5 min，94 ℃ 1 min，55 ℃ 90 s，72 ℃ 90 s,40。利用1.0 %TAE瓊脂糖凝膠、3～5 V/cm電泳檢測(cè)。

1.3.4StBCK1基因結(jié)構(gòu)域克隆和測(cè)序 電泳結(jié)束后利用北京艾德萊生物科技有限公司瓊脂糖凝膠純化回收試劑盒純化、回收正確的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。StBCK1基因片段的TA克隆鏈接參照《TA克隆試劑盒說(shuō)明書(shū)》進(jìn)行。經(jīng)過(guò)Amp抗生素篩選、PCR鑒定和質(zhì)粒提取，獲得PUC18-StBCK1克隆載體；克隆載體送華大基因測(cè)序。

1.3.5 生物信息學(xué)分析 ①以Et28a菌株的StBCK1的蛋白質(zhì)ID號(hào)在UniProKB中搜索查找到該蛋白的InterPro信息，利用GraphView到InterPro里找到蛋白質(zhì)激酶結(jié)構(gòu)域的位置；②利用DNAMAN軟件將測(cè)序小種的DNA序列與Et28a菌株的StBCK1結(jié)構(gòu)域序列比對(duì)，確定NY001和被測(cè)小種5個(gè)菌株的功能結(jié)構(gòu)域；③利用DNAMAN軟件進(jìn)行6個(gè)功能序列對(duì)比，確定SNP位點(diǎn)；④利用MEGA軟件對(duì)6個(gè)小種基因的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行比對(duì)，分析蛋白質(zhì)的突變位點(diǎn)情況；⑤將蛋白質(zhì)序列在DNAMAN中進(jìn)行等電點(diǎn)分析及二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組DNA的檢測(cè)和StBCK1基因的擴(kuò)增

提取玉米大斑病菌的基因組DNA，通過(guò)瓊脂糖檢測(cè)顯示條帶均一且細(xì)直亮沒(méi)有彌散的情況(圖1)，說(shuō)明DNA未出現(xiàn)斷裂、裂解；以及用微量分光光度計(jì)檢測(cè)其濃度和純度，檢測(cè)結(jié)果顯示濃度均達(dá)到了200 ng/μl以上，純度顯示無(wú)蛋白質(zhì)和RNA污染，說(shuō)明提取的玉米大斑病菌的基因組DNA符合下游PCR擴(kuò)增的實(shí)驗(yàn)條件。

2.2 StBCK1蛋白質(zhì)激酶結(jié)構(gòu)域序列位置

通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)檢索獲得StBCK1蛋白質(zhì)激酶結(jié)構(gòu)特征，發(fā)現(xiàn)StBCK1蛋白質(zhì)激酶結(jié)構(gòu)域在DNA序列的4155～5016位，肽鏈的1385～1672位(圖2)。

2.3 StBCK1基因功能結(jié)構(gòu)域序列的SNP分析

通過(guò)比較玉米大斑病菌不同小種的StBCK1基因的功能結(jié)構(gòu)域序列發(fā)現(xiàn)，11-29E與其它小種相比，第2位堿基由G突變?yōu)門(mén)，發(fā)生了顛換； 01-23、NY001和其他4種菌株相比，第243位堿基由C突變?yōu)門(mén)，發(fā)生了轉(zhuǎn)換； 11-29E與其它小種相比，第860位堿基由A突變?yōu)門(mén)，發(fā)生了顛換(圖3)。

圖1 基因組DNA的瓊脂糖凝膠檢測(cè)Fig.1 Detection of genomic DNA by agarose gel

圖2 StBCK1蛋白激酶結(jié)構(gòu)域的位置Fig.2 The location of the StBCK1 protein kinase domain

2.4 功能結(jié)構(gòu)域氨基酸序列變化

在氨基酸序列的第1位氨基酸的比對(duì)(圖4)發(fā)現(xiàn)11-29E與其他致病小種相比，氨基酸由絲氨酸變?yōu)楫惲涟彼釣殄e(cuò)義突變，該變化會(huì)影響α螺旋的形成，使其含量減少，可能導(dǎo)致MAPK信號(hào)通路相關(guān)蛋白接受信號(hào)后同源二聚化的形成。第89位氨基酸的比對(duì)中01-23、NY001和其他4種菌株相比，氨基酸由亮氨酸變?yōu)楸奖彼釣殄e(cuò)義突變，該變化會(huì)利于形成β折疊，而β折疊可以起到穩(wěn)定MAPKKK的三維構(gòu)象的作用，進(jìn)而對(duì)酶活性產(chǎn)生影響。11-29E菌株的第287位氨基酸與其它致病小種不同，氨基酸由天冬酰胺突變?yōu)楫惲涟彼釣殄e(cuò)義突變，這個(gè)突變會(huì)影響氨基酸的疏水性質(zhì)。

圖3 DNA序列比對(duì)結(jié)果Fig.3 The alignment results of DNA sequence

圖4 蛋白質(zhì)序列比對(duì)Fig.4 The alignment results of protein sequence

圖5 StBCK1基因的氨基酸序列磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)Fig.5 Predicted phosphorylation sites of deduced amino acid sequence of StBCK1 from Setospaeria turcica

2.5 StBCK1基因編碼氨基酸序列的磷酸化位點(diǎn)分析

磷酸化和去磷酸化是細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)的重要激活途徑。用 NetPhos2.0 Server在線程序(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)對(duì)StBCK1基因所編碼氨基酸序列中的 Ser、Thr 和 Tys 3 種氨基酸殘基可能成為的磷酸化位點(diǎn)作出預(yù)測(cè)，由磷酸化位點(diǎn)分析可知，可能成為該蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)的為5 個(gè) Ser分別位于序列51/116/120/163/221號(hào)位；2 個(gè) Thr分別位于序列的8/125號(hào)位；1 個(gè) Tyr位于序列的286號(hào)位(圖5)。

3 討 論

單核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorphism, SNP)為第三代分子標(biāo)記技術(shù)，是近幾年最有發(fā)展?jié)摿Φ姆肿訕?biāo)記技術(shù)，具有多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)量多、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)[6]，廣泛用于腫瘤的發(fā)生[7-9]、植物性狀的形成[10]等領(lǐng)域的研究。

在植物病菌真菌基因組中SNP的發(fā)生頻率較高，平均每500～1000 bp個(gè)堿基中就有一個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)[11]，通過(guò)對(duì)01-23、11-29E等4 個(gè)致病小種的SNP發(fā)生頻率為0.35 %。DNA堿基的多態(tài)性變化改變了各小種StBCK1蛋白質(zhì)氨基酸組成，尤其功能結(jié)構(gòu)域氨基酸的變化可對(duì)蛋白的活性造成顯著的影響，在第287位氨基酸由冬酰胺突變?yōu)楫惲涟彼峥梢允拱被岬氖杷再|(zhì)發(fā)生改變，而疏水作用是蛋白質(zhì)折疊的主要驅(qū)動(dòng)力，在保持蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)上起作用，可能參與活性中心的形成。推測(cè)該位點(diǎn)的多態(tài)性會(huì)對(duì)各小種StBCK1蛋白產(chǎn)生功能差異。與蛋白序列對(duì)結(jié)果結(jié)合分析，由于第1位序列中氨基酸由絲氨酸變?yōu)楫惲涟彼幔被岬氖杷再|(zhì)也發(fā)生了改變，所以可能導(dǎo)致與它臨近的第8位的Thr磷酸化位點(diǎn)受其影響，進(jìn)入導(dǎo)致蛋白質(zhì)內(nèi)部位點(diǎn)不容易被磷酸化；287位氨基酸由天冬酰胺突變?yōu)楫惲涟彼?，氨基酸的輸水性質(zhì)和電荷量也發(fā)生了改變，可能使與其臨近的第286位Tyr不易被磷酸化，導(dǎo)致蛋白質(zhì)活性降低，從而使玉米大斑病菌的致病性減弱。細(xì)胞壁的完整性對(duì)玉米大斑病菌感染寄主有重要作用，導(dǎo)致分生孢子數(shù)目不足，附著胞不能形成侵染絲，使其致病性降低[12]，通過(guò)明確StBCK1在不同小種中的差異，推測(cè)這些位點(diǎn)變化是導(dǎo)致玉米大班病菌致病性差異重要因素。

4 結(jié) 論

通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)玉米大斑病菌StBCK1基因的功能結(jié)構(gòu)域在不同小種間高度保守；結(jié)構(gòu)域中核苷酸和氨基酸位點(diǎn)的差異均會(huì)改變StBCK1蛋白的高級(jí)結(jié)構(gòu)和磷酸化活性，進(jìn)而對(duì)小種致病性產(chǎn)生了影響。