局部使用抗生素對(duì)擬行玻璃體內(nèi)注射患者眼表微生物群落影響的自身前后對(duì)照研究△

吳瓊 張明 惠娜 石蕊 黎黎

眼表是人體與外界密切溝通的組織，其由完整的黏膜上皮構(gòu)成上皮屏障，并且是眼部固有免疫的重要組成部分。近年來研究發(fā)現(xiàn)，眼表微生物群落也參與到眼表功能穩(wěn)態(tài)的維持[1]。有研究表明，微生物能夠促進(jìn)耐受性樹突狀細(xì)胞及調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的產(chǎn)生，通過NKT細(xì)胞調(diào)節(jié)細(xì)胞因子分泌，從而發(fā)揮免疫調(diào)控作用[1-2]；并且眼部微生物群落也參與了干眼、翼狀胬肉等疾病的發(fā)生與發(fā)展[3]。全球每年因各種原因需要進(jìn)行玻璃體內(nèi)注射的患者可達(dá)數(shù)千萬人[4]，目前臨床常規(guī)操作為術(shù)前眼局部滴用廣譜抗生素以預(yù)防眼內(nèi)炎發(fā)生，然而越來越多的研究表明，內(nèi)眼手術(shù)前局部抗生素的使用并不能減少眼內(nèi)炎的發(fā)病率，且還存在誘導(dǎo)耐藥、增加醫(yī)療成本等弊端[5]，所以深入全面地研究抗生素對(duì)機(jī)體各個(gè)方面的影響，不斷深化規(guī)范用藥意識(shí)是十分必要的。本研究分析眼局部抗生素的使用對(duì)眼表微生物群落的影響，以更加全面地了解抗生素對(duì)眼表穩(wěn)態(tài)的作用，同時(shí)為進(jìn)一步研究微生物群落與眼表免疫的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 一般資料與分組選取2018年9月至2019年1月在西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院眼科門診以及陜西省人民醫(yī)院眼科住院部就診需行玻璃體內(nèi)注射的患者30例為研究對(duì)象，最終成功建庫測(cè)序并滿足自身前后對(duì)照的患者7例。排除標(biāo)準(zhǔn)：無法隨訪者；合并其他眼表疾病者；3個(gè)月內(nèi)使用過激素或抗生素類眼液、眼膏(除玻璃體內(nèi)注藥圍手術(shù)期用藥外)者；3個(gè)月內(nèi)經(jīng)歷過眼部任何手術(shù)者(除玻璃體內(nèi)注射外)。本試驗(yàn)分為未用藥組和用藥組兩組，其中，未用藥組為未滴用任何抗生素的術(shù)眼結(jié)膜囊菌群；用藥組為滴用左氧氟沙星滴眼液(可樂必妥)1～2 d后的術(shù)眼結(jié)膜囊菌群。本研究通過本院倫理委員會(huì)認(rèn)證，征得患者同意并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集與保存嚴(yán)格無菌眼表取材。受試者入院后未滴任何抗生素眼液前，術(shù)眼滴愛爾凱因滴眼液，1～3 min后囑受試者向上看，打開滅菌凍存管，翻開下眼瞼，使用無菌干棉拭子，輕微壓力涂擦眼球下方的結(jié)膜表面，采集患者下眼瞼結(jié)膜囊內(nèi)微生物，整個(gè)過程用時(shí)10～15 s。術(shù)眼滴左氧氟沙星滴眼液(可樂必妥)每日4次，1～2 d后受試者未沖洗結(jié)膜囊前，再次采用上述方法對(duì)術(shù)眼進(jìn)行結(jié)膜囊微生物樣本采集。結(jié)膜樣本拭子置于1.5 mL無菌管中放入冰盒送入實(shí)驗(yàn)室，-80 ℃冰箱凍存，1周內(nèi)提取16S rDNA。

1.2.2 DNA 提取與PCR擴(kuò)增樣本被接收后，將棉拭子前端無菌處理剪下，轉(zhuǎn)移至破碎管中，研磨5 min，65 ℃裂解13 min，室溫12 000 r·min-1離心10 min。取上清至離心管中，混勻，加入-20 ℃預(yù)冷的異丙醇和100 g·L-1醋酸鈉3 mL，-20 ℃過夜沉淀。重復(fù)離心3 次，晾干后溶于適量緩沖液，使用10 g·L-1瓊脂糖凝膠檢測(cè)DNA 提取質(zhì)量。用V3-341F(5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’)和V4-80R(5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)[6]通用區(qū)引物對(duì)16S V3-V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。取質(zhì)量合格的基因組DNA樣品30 ng及對(duì)應(yīng)的融合引物配置PCR反應(yīng)體系，設(shè)置PCR反應(yīng)參數(shù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，使用Agencourt AMPure XP磁珠對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化并溶于Elution Buffer，貼上標(biāo)簽，完成建庫。使用Agilent 2100 Bioanalyzer對(duì)文庫的片段范圍及濃度進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)合格的文庫根據(jù)插入片段大小，選擇HiSeq平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序。

1.2.3 測(cè)序及數(shù)據(jù)處理使用IIIumina 的Miseq PE301+8+8+301平臺(tái)進(jìn)行雙端測(cè)序。根據(jù)華大基因提供的高通量測(cè)序的下機(jī)數(shù)據(jù)(raw data)，利用FLASH軟件進(jìn)行拼接、過濾、嵌合體去除，利用USEARCH(v7 .0.1090)軟件進(jìn)行OTUs(operational taxonomic units)聚類分析，根據(jù)OTUs聚類分析結(jié)果，采用Observed species、Ace、Chao、Simpson、Shannon評(píng)估指數(shù)分別對(duì)樣本進(jìn)行Alpha多樣性分析，以評(píng)估單個(gè)樣本的物種豐富度；Beta多樣性分析用于測(cè)量兩個(gè)或多個(gè)組合之間的差異。采用 GreenGene數(shù)據(jù)庫進(jìn)行注釋。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，連續(xù)變量的組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，分類變量的組間比較采用χ2檢驗(yàn)，在樣本量或理論數(shù)較小時(shí)使用Fisher確切概率法。使用R(v3.2.1)軟件的mixOmics包進(jìn)行PLS-DA(partial least squares discrimination analysis)分析，PLS-DA分析是一種用于判別分析的多變量統(tǒng)計(jì)分析方法，常用于判斷研究對(duì)象如何分類。使用mother(v.1.31.2)軟件對(duì)各樣品的Alpha多樣性指數(shù)等指標(biāo)進(jìn)行計(jì)算。分析各物種在樣品中的含量，進(jìn)而計(jì)算出不同樣品間的Beta多樣性值。Beta多樣性通過 QIIME(v1.80)方法進(jìn)行計(jì)算。使用Lefse軟件對(duì)LDA分析的P值設(shè)定，根據(jù)Segata等[7]的方法，以3.0作為判斷“顯著差異菌落”的閾值。

2 結(jié)果

2.1 患者一般資料本研究納入30例(43眼)患者，17例單眼，13例雙眼，共獲得86例標(biāo)本，成功建庫41例標(biāo)本，其中7例患者可形成自身前后比較，共14例標(biāo)本。入選患者年齡及性別、疾病構(gòu)成的比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)，納入自身前后對(duì)照研究的7例患者有較好的代表性(見表1)。

表1 納入研究患者一般資料

2.2 OTUs聚類分析兩組共獲得607 362條有效序列和869個(gè)OTUs，未用藥組共得到659個(gè)OTUs，用藥組共得到575個(gè)OTUs，兩組共有的OTUs為365 個(gè)(圖1A) 。抗生素使用后，OTUs數(shù)量的確減少。PLS-DA分析顯示，未用藥組與用藥組分成了兩個(gè)群落，表明兩組OTUs豐度上有顯著性差異(圖1B) 。

圖1 OTUs 聚類分析 A:維恩圖;B:基于OTUs豐度的PLS-DA 分析

2.3 人眼表微生物群落多樣性分析Alpha多樣性分析結(jié)果表明，未用藥組組內(nèi)與用藥組組內(nèi)眼表微生物群落的Alpha多樣性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.38；見圖2)，表明未用藥組組內(nèi)與用藥組組內(nèi)眼表微生物的群落構(gòu)成差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Beta多樣性分析結(jié)果顯示，未用藥組與用藥組眼表微生物群落的Beta多樣性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.32，統(tǒng)計(jì)量值為180；見圖3)。

2.4 人眼表微生物群落的分類組成對(duì)所有樣本進(jìn)行分析，在未用藥組,厚壁菌門所占比例最大(30.0%)，其次為放線菌(26.8%)、變形菌(26.1%)、擬桿菌(10.9%)、藍(lán)藻菌(2.7%)。在用藥組，變形菌所占比例最大(40.2%)，其次為厚壁菌門(33.6%)、放線菌(12.4%)、擬桿菌(3.7%)、藍(lán)藻菌(2.9%)(圖4A)。與未用藥組相比，用藥組中變形菌與厚壁菌門的占比增多，但放線菌的占比減少。在屬水平，未用藥組主要為放線菌、棒狀桿菌、表皮葡萄球菌，用藥組主要為α-變形菌、鞘脂單胞菌、鏈球菌；與未用藥組相比，用藥組中鞘脂菌(10.4%vs.5.2%)、鏈球菌(12.5%vs. 1.4%)、不動(dòng)桿菌(4.2%vs. 3.2%)的占比增多，而葡萄球菌(7.0%vs. 9.4%)與棒狀桿菌(6.6%vs.21.4%)的占比減少(圖4B)。在種水平，與未用藥組相比，用藥組約氏不動(dòng)桿菌(2.6%vs. 1.3%)、馬鏈球菌(11.0%vs. 0%)的占比增多，而表皮葡萄球菌的占比減少(5.4%vs. 9.4%)(圖4C)。圖4D為關(guān)鍵物種差異比較柱狀圖(種水平上)TOP10物種相對(duì)豐度，松鼠葡萄球菌、馬鏈球菌在未用藥組中相對(duì)豐度極低，而在用藥組中相對(duì)豐度顯著上升，與之前的柱狀圖結(jié)果一致。以上結(jié)果顯示，用藥后共生菌/條件致病菌(葡萄球菌、棒狀桿菌)明顯減少，致病菌(鏈球菌、不動(dòng)桿菌)增加。

圖2 組間Alpha多樣性盒形圖 A:Observed species指數(shù)；B:Chao指數(shù)；C:Ace指數(shù)；D:Shannon指數(shù)；E:Simpson指數(shù)；F:Good’s coverage

圖3 組間Beta多樣性盒形圖

圖4 未用藥組和用藥組核心群落比較 A:門水平；B：屬水平；C：種水平；D：種水平上關(guān)鍵物種差異比較柱狀圖TOP10條形圖

2.5 樣本組間菌群構(gòu)成差異分析以LDA值3.0作為標(biāo)準(zhǔn)來檢測(cè)樣本中的顯著物種。通過對(duì)兩組樣本進(jìn)行Lefse分析顯示，未用藥組中共有8種顯著菌被發(fā)現(xiàn)，它們分別屬于不同分類水平的菌:微球菌、allobaculum、放線菌、莫拉克斯菌、韋榮球菌(圖5)。用藥組無任何菌的LDA值大于3.0，說明經(jīng)過抗生素處理后的結(jié)膜囊菌群發(fā)生顯著變化。allobaculum屬于厚壁菌門，這與前面的物種豐度柱狀圖結(jié)果一致。

圖5 未用藥組LDA 評(píng)分大于3.0的8種菌

3 討論

微生物群落對(duì)外界環(huán)境變化較敏感，不同的飲食結(jié)構(gòu)、不同地域的受試者微生物群落構(gòu)成就可能會(huì)有明顯的差異[8-10]。因此，本研究采用自身前后對(duì)照的設(shè)計(jì)，排除受試者的生活環(huán)境、用眼習(xí)慣、飲食結(jié)構(gòu)等個(gè)人因素對(duì)結(jié)果產(chǎn)生的影響，更可靠地反映抗生素這單一因素對(duì)眼表微生物群落的影響。初期共收集30例患者用藥前后86例標(biāo)本，由于DNA濃度、配對(duì)等因素，最終分析7例患者共14例標(biāo)本，其中成功建庫百分比為47.67%(41/86)，納入自身對(duì)照標(biāo)本百分比為16.28%(14/86)，充分說明自身對(duì)照研究的難點(diǎn)，樣本量較少，與其他文獻(xiàn)報(bào)道的自身對(duì)照研究相似[11]。

本研究結(jié)果顯示，用藥組中OTUs的數(shù)量顯著低于未用藥組。使用抗生素眼液減少了結(jié)膜囊微生物的物種多樣性。這一發(fā)現(xiàn)與抗生素對(duì)腸道和口腔微生物群落的影響相似[12]。Alpha多樣性與Beta多樣性分析均未發(fā)現(xiàn)用藥前后眼表微生物群落的顯著性差異，考慮與樣本量較少有關(guān)，仍需要加大樣本量進(jìn)一步研究。

在本研究中，變形菌門、厚壁菌門、放線菌門、擬桿菌門和藍(lán)藻菌門被確定為5種主要的眼部結(jié)膜微生物群，這與文獻(xiàn)[13-14]報(bào)道的結(jié)果相似。在屬水平的觀察可知，用藥組與未用藥組相比，棒狀桿菌、葡萄球菌含量減少，鞘脂菌、鏈球菌、不動(dòng)桿菌含量增多。在種水平，用藥組與未用藥組相比，表皮葡萄球菌含量減少，而馬鏈球菌與約氏不動(dòng)桿菌含量增多，與美國Bascom Palmer眼科研究所的系列研究結(jié)果相似[15-16]，眼表菌群包含多種革蘭陽性細(xì)菌，使用抗生素后，革蘭陰性細(xì)菌(如鏈球菌)的含量增加。既往文獻(xiàn)結(jié)果顯示，抗生素的使用降低了眼表共生菌群(如棒狀桿菌[17-18])與非致病性細(xì)菌/條件致病菌(如表皮葡萄球菌)[19-20]的百分比，而致病菌鏈球菌[21]與不動(dòng)桿菌[22-23]的豐度增加。這種菌群比例的失調(diào)，不利于眼內(nèi)炎的預(yù)防[18,24-25]。

目前已有大量研究認(rèn)為，在玻璃體內(nèi)注射術(shù)前廣泛使用抗生素并不能顯著降低眼內(nèi)炎發(fā)生率[26-27]，其原因尚不清楚，有待進(jìn)一步深入研究。本研究的意義在于，從微生物群落角度發(fā)現(xiàn)，眼局部抗生素的使用破壞了眼表微生物穩(wěn)態(tài)的平衡，使致病菌豐度增加，推測(cè)可能與術(shù)后感染發(fā)生率未顯著下降有關(guān)。本研究結(jié)果表明，眼局部使用抗生素的確會(huì)影響擬行玻璃體內(nèi)注射患者的眼表穩(wěn)態(tài)維持，為將來深入探索其中作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。