楊裔堅， 付必莽， 謝 楠， 曹 凡， 蘇瑩珍

1 昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院 肝膽外科， 昆明 650032; 2 昆明學(xué)院 醫(yī)學(xué)院， 昆明 650200

肝癌是全球范圍內(nèi)第6大最常見的癌癥和第4大癌癥相關(guān)死亡原因[1]。肝癌惡性程度高，早期診斷率低，發(fā)病率與病死率的比率接近1，2015年大約有854 000例新發(fā)肝癌病例，而每年估計有810 000例肝癌相關(guān)死亡[2]。肝細(xì)胞癌(HCC)約占原發(fā)性肝癌的75%～85%，是全世界主要的健康問題[3]，在我國癌癥相關(guān)死亡率中排名第3位[4]。手術(shù)切除是HCC患者最重要的治療方法，但由于缺乏早期有效診斷方法，多數(shù)患者初次確診已是晚期，只有20%～30%的患者可接受手術(shù)干預(yù)，且術(shù)后5年內(nèi)的復(fù)發(fā)率高達(dá)50%～70%[1]。早診斷、早治療是HCC治療的重點。血清AFP和肝臟超聲是目前應(yīng)用最廣泛的HCC篩查方法，但兩者的敏感度(25%～65%、60%)均不理想[5]。此外，術(shù)前穿刺檢查也存在一定局限性。近年來，液體活檢已成為診斷癌癥的輔助手段，具有非侵入性、可頻繁檢查的優(yōu)勢，可以在治療期間更好地監(jiān)測疾病進(jìn)展和基因突變，也可以用來驗證癌癥治療藥物的效果[6]。循環(huán)游離DNA(circulating free DNA，cfDNA)是液體活檢的重要組成部分，早在1948年Mandel等[7]便對其進(jìn)行了描述，此后研究發(fā)現(xiàn)腫瘤患者血液中含有腫瘤來源的cfDNA，被稱為循環(huán)腫瘤DNA(circulating tumor DNA，ctDNA)。由于cfDNA含有點突變、拷貝數(shù)變異、染色體重排和甲基化等信息，被視為具有前途的生物標(biāo)志物[8]。近年來，cfDNA在肺癌、乳腺癌、大腸癌、膀胱癌中的診斷與預(yù)后分析價值逐漸顯現(xiàn)，相關(guān)檢測工具逐步開發(fā)，目前美國食品藥品監(jiān)督管理局已正式批準(zhǔn)液體活檢用于癌癥檢測。本文現(xiàn)就cfDNA在HCC診斷和治療中的研究進(jìn)展做一綜述。

1 cfDNA的生物學(xué)特性

1.1 cfDNA的來源 cfDNA是細(xì)胞外雙鏈DNA分子，由小片段(70～200 bp)和較大片段(21 kb)組成[9]。所有細(xì)胞(包括腫瘤細(xì)胞和非惡性細(xì)胞)均釋放cfDNA到循環(huán)系統(tǒng)中，其中癌癥和其他疾病(如腎衰竭和心肌梗死)患者cfDNA水平往往高于健康人群[10]。cfDNA分子的遺傳和表觀遺傳修飾反映了起源細(xì)胞的基因組或表觀基因組，甲基化分析表明，大多數(shù)血漿cfDNA從健康個體的造血細(xì)胞中釋放而來，人體經(jīng)過高強(qiáng)度運動后，造血細(xì)胞釋放大量cfDNA[11-13]。ctDNA的來源目前尚不清楚，大多數(shù)ctDNA被認(rèn)為來源于凋亡和壞死的腫瘤細(xì)胞，這些細(xì)胞將其碎裂的DNA釋放到血液循環(huán)中，DNA也可能通過活的腫瘤細(xì)胞作為游離 DNA分泌，或者通過吞噬細(xì)胞吞噬腫瘤細(xì)胞后分泌[14-16]。

1.2 cfDNA的種類 (1)DNA片段：游離DNA片段不與任何其他分子或表面結(jié)合。釋放后，它們會被血液中的DNA酶消化。在癌癥患者血液中DNA酶濃度較低，同時可檢測到DNA酶抑制劑，可能導(dǎo)致cfDNA水平的升高[17]。(2)核小體：在細(xì)胞凋亡過程中，染色質(zhì)被切割成寡核小體和單核小體，包裝成囊泡，并在被鄰近細(xì)胞吞噬之前從細(xì)胞中釋放出來。在癌癥患者化療或放療期間，細(xì)胞死亡率較高，吞噬機(jī)制趨于飽和，導(dǎo)致循環(huán)中核小體水平升高[18]。(3)囊泡DNA：囊泡DNA包括凋亡小體、外泌體和細(xì)胞微粒中的DNA，核酸被包裝在這些小體中，并從細(xì)胞中釋放出來，由吞噬細(xì)胞攝取[19]。Holmgren等[20]證實，凋亡小體可以被吞噬細(xì)胞吸收，導(dǎo)致DNA的水平轉(zhuǎn)移。外泌體是由許多類細(xì)胞產(chǎn)生的小泡，它們可能含有核酸和蛋白質(zhì)，腫瘤細(xì)胞釋放的外泌體含有突變的核酸片段，可能有助于原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性癌癥的生長和傳播[21]。

2 cfDNA的檢測方法

最常見的cfDNA檢測方法包括數(shù)字PCR(digital PCR, dPCR)、下一代測序技術(shù)(next generation sequencing, NGS)和擴(kuò)增阻滯突變PCR(amplification refractory mutation system, ARMS PCR)。

2.1 數(shù)字PCR(dPCR) 最初用于cfDNA定量的方法以定量PCR和PCR相關(guān)方法為主，可以在大量野生型DNA存在的情況下，優(yōu)先擴(kuò)增低水平的突變等位基因。研究[22-23]發(fā)現(xiàn)，各種類型癌癥患者血漿中KRAS或APC等基因存在體細(xì)胞突變，同時基于PCR的方法可以檢測cfDNA的微衛(wèi)星改變。然而，這些方法的主要限制在于對早期疾病患者或?qū)χ委熡蟹磻?yīng)的晚期患者的cfDNA檢測時不夠敏感。相較而言，dPCR能夠更加精確地定量小突變等位基因組分，目前通過dPCR進(jìn)行cfDNA分析的主要技術(shù)有BEAMing和微滴數(shù)字PCR(droplet digital PCR，ddPCR)，這些方法允許非常精確地計數(shù)攜帶目標(biāo)突變的總模板分子的數(shù)量，并可達(dá)到0.01%的檢測極限[24]。曹喆等[25]使用ddPCR檢測晚期肺腺癌患者外周血中ctDNA中腫瘤表皮生長因子受體基因突變，發(fā)現(xiàn)其與腫瘤組織該基因突變結(jié)果的符合率為82.4%，敏感度為74.1%，特異度為90.2%，支持其應(yīng)用于臨床。dPCR是目前檢測cfDNA內(nèi)特定突變的金標(biāo)準(zhǔn)，然而該技術(shù)最大的限制是每次只能檢測1個或者少數(shù)突變。由于許多患者體內(nèi)的cfDNA濃度較低，意味著為了評估少數(shù)突變通常需要采集10～20 ml血液，此外，為了使用dPCR來監(jiān)測腫瘤患者的治療反應(yīng)，首先需要通過獲取腫瘤組織來確定至少1個突變，因此通常需要最初的侵入性操作[26]。

2.2 下一代測序技術(shù)(NGS) 不同于dPCR，NGS允許對單個樣本中數(shù)百萬個DNA片段進(jìn)行大規(guī)模平行測序，提供了一次性對許多潛在突變進(jìn)行基因分型的可能性。NGS通常被用于對熱點基因測序以獲得腫瘤的遺傳信息，以便通過深度測序進(jìn)行癌癥個性化分析，其對cfDNA的分析是臨床腫瘤學(xué)中一種有價值的工具。Li等[27]多次使用NGS技術(shù)檢查非小細(xì)胞肺癌患者ctDNA中基因拷貝數(shù)變化，先后檢測發(fā)現(xiàn)EGFR L858R和擴(kuò)增變異、新增c-MET擴(kuò)增、NRAS Q61H和KRAS G12D變異，而后在臨床治療中分別給予相應(yīng)分子靶向藥物治療，取得了滿意的治療效果。然而，在NGS成為常規(guī)使用的臨床檢驗工具之前，其檢測極限仍需改進(jìn)。目前，阻礙NGS精確檢測的限制主要包括：(1)敏感度低，分析血液中微量的ctDNA具有挑戰(zhàn)性[28]。(2)在測序和后續(xù)分析過程中，可能獲得假陽性或假陰性結(jié)果[29]。

2.3 擴(kuò)增阻滯突變PCR(ARMS PCR) ARMS是一種等位基因特異度PCR聯(lián)合熒光探針的新型技術(shù)，基于實時PCR平臺結(jié)合特異引物和雙環(huán)探針檢測DNA樣品中含有的突變基因。Feng等[30]研究表明，ARMS PCR檢測肺癌患者血漿EGFR突變的敏感度與ddPCR相似(76.5% vs 80.4%)，特異度相似(100% vs 89.3%)。Li等[31]研究發(fā)現(xiàn)，ARMS PCR在晚期肺癌患者cfDNA的EGFR突變檢測中具有較高的敏感度和特異度，支持其在臨床上作為組織活檢的補(bǔ)充或替代方法。然而，ARMS技術(shù)檢測敏感度有限(檢測限度為1%)，單次只能檢測單個基因且只能用于檢測已知突變，在一定程度上限制了其應(yīng)用[32]。

3 cfDNA在HCC中臨床應(yīng)用價值

3.1 cfDNA在HCC診斷中的應(yīng)用 肝癌患者cfDNA水平較健康人群升高，并隨腫瘤負(fù)荷動態(tài)變化[33]。Jiang等[34]開展了大規(guī)模平行測序，以單堿基分辨率和全基因組方式對90例HCC、67例慢性乙型肝炎、36例乙型肝炎肝硬化和32例健康對照者的血漿cfDNA大小進(jìn)行了詳細(xì)分析，結(jié)果顯示，HCC的診斷敏感度為80%，特異度為94%，受試者工作特征曲線下面積為0.93，發(fā)現(xiàn)HCC患者血漿中存在異常短和長的cfDNA分子片段，較短的片段優(yōu)先攜帶與腫瘤相關(guān)的拷貝數(shù)畸變。Kisiel等[35]使用靶富集長探針定量擴(kuò)增信號(TELQAS)的NGS測定HCC患者cfDNA中的6個甲基化標(biāo)志物，診斷敏感度為95%，特異度為92%，受試者工作特征曲線下面積為0.96。另有研究[36]表明，對于早期局限性腫瘤而言，血漿cfDNA的液體活檢敏感度是有限的，單獨使用cfDNA對肝癌的最大檢測能力僅為60%，但基于NGS和 HiSeq 4000測序系統(tǒng)的開發(fā)的CancerSEEK液體活檢技術(shù)，采取綜合cfDNA突變與腫瘤抗原水平的算法，能夠早期預(yù)測卵巢癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、食管癌、結(jié)直腸癌、肺癌與乳腺癌等8種最常見癌癥，且能精準(zhǔn)定位原發(fā)癌灶，其中肝癌的敏感度95%，特異度99%。

3.2 cfDNA在HCC預(yù)后中的應(yīng)用 Xu等[37]研究發(fā)現(xiàn)，ctDNA甲基化標(biāo)志物除了在HCC診斷中具有較高的敏感度和特異度，還與患者的腫瘤負(fù)荷、分期、治療反應(yīng)和預(yù)后相關(guān)，此外，由于其相對較短的半衰期(約2 h)，可以快速地調(diào)整基于ctDNA的治療計劃。Li等[38]選取155例肝癌手術(shù)切除患者、60例慢性乙型肝炎患者和20例健康對照者，使用甲基化特異度PCR測定cfDNA Marker-IGFBP7啟動子甲基化，結(jié)果顯示，HCC患者IGFBP7啟動子甲基化是總生存期的獨立預(yù)后預(yù)測因子(HR=3.864，95%CI：2.073～7.203，P=0)，與早期腫瘤復(fù)發(fā)有關(guān)(P=0.001)。Marchio等[39]通過HCC患者cfDNA檢測P53基因的R249S突變，發(fā)現(xiàn)突變患者通常表現(xiàn)出明顯增加的循環(huán)AFP水平、高HBV DNA載量以及血細(xì)胞計數(shù)值惡化，提示其與疾病嚴(yán)重度相關(guān)。另一項研究[40]中，30例HCC患者中7例腫瘤直徑>5 cm或有轉(zhuǎn)移，其中6例患者cfDNA至少檢測到1個突變。在這些患者的cfDNA和腫瘤組織DNA中分別檢測到87%(80/92)和95%(87/92)的突變，表明cfDNA和腫瘤組織DNA的體細(xì)胞突變率相似，結(jié)果表明，腫瘤突變負(fù)荷和突變等位基因數(shù)量與腫瘤大小和分級有關(guān)。

3.3 cfDNA在HCC監(jiān)測和治療評價中的應(yīng)用 目前，臨床主要通過影像學(xué)和AFP評估腫瘤治療反應(yīng)，但AFP敏感度較差，應(yīng)用價值受限。cfDNA分析腫瘤的分子變化對于指導(dǎo)適當(dāng)?shù)陌邢蛑委熓呛苤匾模送膺€可能有助于監(jiān)測治療反應(yīng)，因為血漿中的突變狀態(tài)反映了患者的腫瘤負(fù)荷，并與患者的臨床狀況相關(guān)[41]。Ikeda等[42]對26例HCC患者進(jìn)行32次cfDNA NGS分析，檢測到54～70個基因中的單核苷酸變異、擴(kuò)增、融合和特異度插入/缺失改變，88.5%的患者具有至少1個特征性改變，所有患者均有至少1個潛在可以采取治療措施的突變，最常見的突變基因為P53(16/26，61.5%)；1例使用卡培他濱治療患者的連續(xù)ctDNA評估顯示，在疾病進(jìn)展后出現(xiàn)了一種新的P53突變，表明cfDNA用于HCC耐藥性檢測是可行的，可以無創(chuàng)獲得潛在的可采取治療措施的突變和潛在的分子靶向治療的信息，并可以觀察腫瘤基因隨著治療策略的突變情況。Cai等[43]在綜合治療過程中監(jiān)測了1例HCC患者，觀察到即使在影像診斷和第1次TACE治療AFP水平增加之前，含有8個體細(xì)胞突變信息的cfDNA水平便已升高，在此過程中，1個錯義體細(xì)胞突變在第1次TACE治療后被發(fā)現(xiàn)，第2次手術(shù)后無法檢測到，而在第2次復(fù)發(fā)時卻急劇增加。上述研究表明，cfDNA可以實時跟蹤不同突變體的變化和治療反應(yīng)。

此外，ctDNA中檢測到的體細(xì)胞突變可以指導(dǎo)治療。1例晚期HCC患者由于1個CDKN2A基因失活和1個CTNNB1基因激活突變接受哌柏西利(CDK4/6抑制劑)和塞來昔布(COX-2/WNT抑制劑)治療，2個月后，γ-羧基凝血酶原水平下降84%(1410 ng/ml降至242 ng/ml)，AFP低于基線水平。1例PTEN基因失活和MET基因激活突變的晚期HCC患者接受西羅莫司(雷帕霉素靶蛋白mTOR抑制劑)和卡博替尼(MET抑制劑)后，AFP水平下降63%(8320 ng/ml降至3045 ng/ml)[44]。提取肝癌患者血液中的cfDNA可以提供可利用的基因組圖譜，并在藥物治療方面提供指導(dǎo)。

早期診斷仍然是提高肝癌治愈率的關(guān)鍵，然而在腫瘤發(fā)生的早期階段，血漿中cfDNA含量較低，無法提供可靠的診斷信息。由于ctDNA的甲基化變化發(fā)生在腫瘤形成的早期，并且具有潛在的可逆性，同時cfDNA不同的甲基化組合展現(xiàn)出優(yōu)異的敏感度和特異度，因此cfDNA甲基化在HCC早期診斷中具有前景。目前的研究大多采用不同的技術(shù)和檢測標(biāo)準(zhǔn)來檢測cfDNA，從而產(chǎn)生不同的敏感度和特異度，因此標(biāo)本采集處理、cfDNA的提取及檢測必須標(biāo)準(zhǔn)化。cfDNA在診斷上具有較高的特異度，其聯(lián)合多標(biāo)志物分析則可以提高腫瘤診斷特異度，多種cfDNA甲基化標(biāo)志物組合與腫瘤抗原相結(jié)合還可進(jìn)一步提升診斷效果?，F(xiàn)有文獻(xiàn)報道的大多數(shù)數(shù)據(jù)來自亞洲國家，研究結(jié)論的通用性可能有限，因為性別和種族對DNA甲基化模式有顯著影響。肝癌的不同病因可能影響肝癌的DNA突變譜，cfDNA確切的來源目前尚不清楚。因此，未來需要更多的基礎(chǔ)研究，明確cfDNA的生物學(xué)特性，針對不同病因、不同地域、不同種族患者進(jìn)行橫向研究。通過提高儀器的精確性和易用性，同時聯(lián)合生物信息學(xué)、大數(shù)據(jù)等多平臺優(yōu)勢改善檢測的敏感度。相信未來以cfDNA為代表的液體活檢技術(shù)將在HCC診斷和治療領(lǐng)域大放異彩。

作者貢獻(xiàn)說明：楊裔堅負(fù)責(zé)課題設(shè)計，資料分析，撰寫論文；謝楠、曹凡參與搜索論文資料，修改論文；付必莽、蘇瑩珍負(fù)責(zé)擬定寫作思路，指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。