羅定遠(yuǎn) 歐陽(yáng)能太

甲狀腺癌是內(nèi)分泌系統(tǒng)發(fā)病率最多的惡性腫瘤[1]，我國(guó)城市地區(qū)女性甲狀腺癌發(fā)病率位居女性所有惡性腫瘤的第4位，60歲以上人群甲狀腺結(jié)節(jié)發(fā)病率為50%～70%[2]，但惡性腫瘤僅占甲狀腺結(jié)節(jié)中的5%～10%。盡管傳統(tǒng)診斷方式，如超聲、細(xì)針穿刺(FNA)等手段能夠篩選出大多數(shù)甲狀腺癌，但是準(zhǔn)確性有待提高，如按TBS診斷系統(tǒng)細(xì)胞病理還存在較高比例的不確定類型。另外，甲狀腺癌的生物學(xué)行為在細(xì)胞病理層面很難作出具有臨床意義的判斷。

甲狀腺癌分為分化型甲狀腺癌(differentiated thyroid cancer，DTC)、甲狀腺髓樣癌(medullary thyroid cancer，MTC)、低分化甲狀腺癌(poorly differentiated thyroid cancer，PDTC)和未分化癌(anaplastic thyroid cancer，ATC)，DTC包括甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid cancer，PTC)和甲狀腺濾泡癌(follicular thyroid cancer，F(xiàn)TC)。各種類型的甲狀腺癌惡性程度不同，治療方式和預(yù)后也不一樣。DTC臨床上最常見(jiàn)，約占90%，一般預(yù)后較好，但是也有部分DTC早期已出現(xiàn)局部器官侵犯、頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移，嚴(yán)重影響病人生存期和術(shù)后生活質(zhì)量[3]。因此，如何精準(zhǔn)甄別甲狀腺結(jié)節(jié)的良惡性和評(píng)估腫瘤惡性程度具有重要的臨床意義。隨著甲狀腺癌分子機(jī)制研究的深入，從甲狀腺癌生物學(xué)行為的角度，特別是從基因變異層面認(rèn)識(shí)甲狀腺癌的本質(zhì)，分辨低風(fēng)險(xiǎn)甲狀腺癌和高風(fēng)險(xiǎn)甲狀腺癌已成為可能，這將進(jìn)一步提升甲狀腺癌的精準(zhǔn)診斷和治療。

一、甲狀腺癌的基因變異

甲狀腺癌發(fā)生、發(fā)展是多基因調(diào)控的結(jié)果，轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控起主導(dǎo)作用，主要涉及絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路及磷酸肌醇-3-激酶(PI3K)/AKT信號(hào)等通路激活。其中BRAF、TERT、RAS、RET、PAX8/PPARγ和TP53等基因與甲狀腺癌診斷、侵襲性、靶向治療和預(yù)后相關(guān)性較為密切。

1.BRAF：BRAF是一種絲氨酸蘇氨酸激酶，屬于RAF蛋白家族，能激活MAPK通路，與細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、凋亡、分化密切相關(guān)。BRAF位于7q34，其中15號(hào)外顯子突變占約89%，11號(hào)外顯子突變約占11%；2003年首次在甲狀腺癌中發(fā)現(xiàn)BRAF V600E點(diǎn)突變，此位點(diǎn)突變?cè)诩谞钕侔┲械陌l(fā)生率最高，引起第600位谷氨酸取代纈氨酸的錯(cuò)義突變，導(dǎo)致MAPK信號(hào)通路持續(xù)激活。另外，599和601位點(diǎn)突變、BRAF基因易位等變異文獻(xiàn)也有報(bào)道。PTC中BRAF突變率各研究報(bào)道不一，約48%～80%，但在甲狀腺良性結(jié)節(jié)中未發(fā)現(xiàn)[4]。在亞洲群人中，BRAF突變頻率可能還更高一些[5]。Meta分析顯示，BRAF V600E突變的腫瘤不僅明顯出現(xiàn)包膜外浸潤(rùn)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和高臨床分期，而且也顯示病人的復(fù)發(fā)率較高和預(yù)后相對(duì)較差，如BRAF V600E突變的甲狀腺癌出現(xiàn)中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移發(fā)生率為46%，故認(rèn)為其可作為判斷中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子[6]。

2.RAS：RAS基因編碼p21蛋白，位于細(xì)胞內(nèi)膜面，具有GTP酶活性，參與細(xì)胞增殖信號(hào)傳導(dǎo)調(diào)控系統(tǒng)。RAS熱點(diǎn)突變位于2號(hào)外顯子(密碼子12及13)，3號(hào)外顯子(密碼子61)，其中密碼子12的點(diǎn)突變最為常見(jiàn)。在機(jī)制上，激活的RAS綁定GTP，從而具有GTP激活活性，使GTP轉(zhuǎn)換成GDP，突變RAS失去GTP激活活性，導(dǎo)致RAS組成性激活。突變的RAS能夠激活MAPK和PI3K/AKT兩條通路，特別是以后者為主，并且RAS主要是在甲狀腺濾泡癌的增殖和轉(zhuǎn)移中起主導(dǎo)作用。RAS有3種亞型：HRAS、KRAS和NRAS，在甲狀腺癌中突變最多的是NRAS，并主要與濾泡癌復(fù)發(fā)及預(yù)后不良相關(guān)[7]。

3.端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(telomerase reverse transcriptase，TERT)：TERT啟動(dòng)子是酶調(diào)節(jié)的主要靶點(diǎn)，TERT啟動(dòng)子突變產(chǎn)生一個(gè)新的ETS轉(zhuǎn)錄因子家族結(jié)合位點(diǎn)，上調(diào)TERT轉(zhuǎn)錄，熱點(diǎn)突變位于基因轉(zhuǎn)錄起始上游的-124bp(C228T)和-146bp(C250T)，PTC中突變率為5%～15%、FTC為10%～35%、PDTC為20%～50%、ATC為30%～75%。TERT啟動(dòng)子突變與甲狀腺癌的惡性程度密切相關(guān)，與BRAF突變具有協(xié)同作用，增加甲狀腺腫瘤的侵襲性[8]。

4.RET：RET屬于原癌基因，編碼細(xì)胞膜受體酪氨酸激酶，RET與PTC基因融合會(huì)激活RET，進(jìn)而激活MAPK和PI3K/AKT通路。目前研究顯示相關(guān)的基因融合形式有10種以上，其中RET/PTC1 和 RET/PTC3最為常見(jiàn)。DTC中有RET/PTC1和RET/PTC3兩種基因融合，約占80%，其中RET/PTC3往往與電離輻射引起的濾泡亞型PTC相關(guān)。伴有RET/PTC基因融合的DTC增加EGFR表達(dá)和磷酸化，常常出現(xiàn)更多的區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。此外，50% MTC伴有RET基因點(diǎn)突變，尤其是密碼子918位點(diǎn)的突變，約98%的MEN2A病人存在RET基因胚系突變[9-10]。

5.PAX8/PPARγ：PAX8和PPARγ基因的重排發(fā)生在2號(hào)染色體q13和3號(hào)染色體p25之間，導(dǎo)致PAX8和PPARγ基因融合，PAX8/PPARγ融合能夠使野生型PPARγ抑制因子的作用失活，同時(shí)也能使某些PAX8應(yīng)答基因激活。這種基因易位在FTC中發(fā)生率約為30%～60%，F(xiàn)VPTC約38%。PPARγ基因突變與FTC、非典型甲狀腺濾泡腺瘤等有關(guān)。在PTC中，PAX8/PPARγ融合僅見(jiàn)于濾泡亞型，且與多灶性及血管侵襲相關(guān)[10-11]。

6.TP53：TP53基因含11個(gè)外顯子和10個(gè)內(nèi)含子，編碼p53蛋白，監(jiān)控細(xì)胞周期DNA損傷、調(diào)控細(xì)胞增殖、維持細(xì)胞正常生長(zhǎng)和抑制惡性細(xì)胞增殖。TP53基因突變多發(fā)于5～9號(hào)外顯子，在各種侵襲型較強(qiáng)的甲乳癌亞型中常見(jiàn)，如甲狀腺乳頭狀癌柱狀細(xì)胞-高細(xì)胞亞型等，而在正常甲狀腺組織以及甲狀腺濾泡腺瘤、慢性甲狀腺炎等良性病變中通常不能檢出突變型p53蛋白[4]。因此，目前認(rèn)為TP53基因與甲狀腺癌的發(fā)生和去分化有關(guān)，提示預(yù)后不良。

二、甲狀腺癌分子診斷臨床應(yīng)用的現(xiàn)狀

明確診斷是腫瘤治療的前提，超聲及超聲引導(dǎo)下FNA是甲狀腺結(jié)節(jié)良惡性甄別的首選方法[2，12]。2017 版Bethesda報(bào)告系統(tǒng)將細(xì)胞學(xué)診斷結(jié)果分為6個(gè)等級(jí)[13]，分別為I類-標(biāo)本無(wú)法診斷、Ⅱ類-良性病變、Ⅲ類-意義不明確的細(xì)胞不典型病變/濾泡性病變(AUS/FLUS)、Ⅳ類-濾泡性腫瘤/可疑濾泡性腫瘤(FN/SFN)、Ⅴ類-可疑惡性腫瘤和Ⅵ類-惡性腫瘤。其中Ⅲ類惡性風(fēng)險(xiǎn)10%～30%，IV類惡性風(fēng)險(xiǎn)25%～40%。細(xì)胞病理診斷的局限性就是存在較大比例的不確定類診斷，對(duì)這些良惡性不確定類型進(jìn)行更進(jìn)一步的判斷顯得特別重要。

近年分子檢測(cè)已廣泛應(yīng)用于臨床，目前國(guó)際比較知名的甲狀腺基因檢測(cè)產(chǎn)品主要有4個(gè)，分別是Afirma，ThyGenX/ThyraMIR，ThyroSeq以及RosettaGX Reveal。Afirma用的是基因芯片，稱基因表達(dá)分類器(Gene Expression Classifier，GEC)，檢測(cè)167個(gè)基因的mRNA表達(dá)水平，其中25個(gè)基因用于排除濾髓樣癌、轉(zhuǎn)移癌、甲狀旁腺組織等，142個(gè)基因mRNA用于良惡性判斷，敏感性約90%，特異性約52%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值(positive predictive value，PPV)約37%，陰性預(yù)測(cè)值(negative predictive value，NPV)約94%[14]。ThyGenX/ThyraMIR應(yīng)用兩種檢測(cè)技術(shù)，先以二代測(cè)序檢測(cè)5個(gè)基因突變和3個(gè)基因融合，接著用熒光定量PCR方法檢測(cè)10個(gè)miRNA表達(dá)，最后判斷良惡性，其敏感性為89%，特異性為85%，PPV為74%，NPV為94%，在特異性、PPV和NPV上均比Afirma GEC高[15]。第3個(gè)產(chǎn)品是ThyroSeq，ThyroSeq V3版在V2版的基礎(chǔ)上增加到112個(gè)基因，不僅檢測(cè)基因點(diǎn)突變、融合，還增加了拷貝數(shù)變異檢測(cè)，對(duì)于以基因拷貝數(shù)改變?yōu)樘卣鞯哪[瘤如Hurthle細(xì)胞癌診斷和預(yù)測(cè)提高了檢測(cè)的特異性和敏感性[7]。RosettaGX Reveal主要檢測(cè)miRNA，以24個(gè)miRNA作為良惡性分類指標(biāo)，敏感性為85%，特異性為72%，PPV為59%，NPV為91%[16]。雖然在陽(yáng)性預(yù)測(cè)值上各個(gè)產(chǎn)品的判斷標(biāo)準(zhǔn)可能不同，但總體看，以二代測(cè)序?yàn)榛A(chǔ)的檢測(cè)似乎有更好的應(yīng)用價(jià)值。國(guó)內(nèi)也有多家企業(yè)在研發(fā)或銷售類似產(chǎn)品，相信會(huì)有更多的國(guó)內(nèi)臨床數(shù)據(jù)會(huì)陸續(xù)報(bào)道。

三、基因變異與甲狀腺癌個(gè)體化管理

目前細(xì)胞病理學(xué)診斷不足以準(zhǔn)確評(píng)估甲狀腺癌的低危/高危狀態(tài)，分子檢測(cè)評(píng)估甲狀腺癌生物學(xué)行的研究精尖發(fā)展，有望成為甲狀腺癌惡性風(fēng)險(xiǎn)分層重要的新指標(biāo)，為精準(zhǔn)的個(gè)體化管理提供重要支持。

1.基因變異與積極觀察： Ito等[17]觀察340例PTMC，隨訪5年腫瘤直徑增大3 mm和頸部淋巴轉(zhuǎn)移的病例分別占6.4%、1.4%，10年占15.9%、3.4%，這說(shuō)明有一部分PTMC病人可以臨床積極觀察(active surveillance，AS)，以及等待頸部淋巴結(jié)出現(xiàn)轉(zhuǎn)移仍可以手術(shù)切除治愈，且無(wú)明顯并發(fā)癥；韓國(guó)多中心隨訪370例PTMC，中位隨訪32.5個(gè)月，3.5%出現(xiàn)腫瘤最大直徑增加，23.2%出現(xiàn)腫瘤體積增大，在2、3、4、5年體積增加率分別為6.9%、17.3%、28.2%、36.2%，年齡<45歲病人的體積增加率明顯多于年齡較大者；其中，隨訪的過(guò)程中，58例(15.7%)病人由于焦慮(37.9%)、腫瘤體積增大(32.8%)和中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(8.6%)，實(shí)施了手術(shù)治療；研究結(jié)果顯示，很大一部分PTMC病人積極觀察的過(guò)程中出現(xiàn)生長(zhǎng)的現(xiàn)象，腫瘤體積改變是評(píng)估腫瘤生長(zhǎng)的敏感方式；積極觀察應(yīng)密切觀察中應(yīng)用，對(duì)于年輕的病人來(lái)說(shuō)，盡管不是積極觀察的禁忌，但是對(duì)于年輕人的應(yīng)用要慎重[18]；2015ATA指南對(duì)于低危PTMC也提出積極觀察這一概念，認(rèn)為積極觀察可以作為低危甲狀腺癌一種管理方式，但需要更多證據(jù)支持[12]。但這些研究?jī)H僅涉及臨床觀察，并沒(méi)有探討B(tài)RAF、TERT等變異與甲狀腺腫瘤進(jìn)展變化，同時(shí)由于病例選擇偏差、人群分布等差異，研究結(jié)果需要進(jìn)一步的證據(jù)。

2.基因變異與個(gè)體化手術(shù)方案制定：外科手術(shù)是甲狀腺癌治療的主要方式，而對(duì)于部分DTC，是選擇腺葉切除還是全切除、是否預(yù)防性中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)清掃術(shù)還存在爭(zhēng)議[12]；BRAF V600E 和TERT啟動(dòng)子雙突變?cè)谠l(fā)性和轉(zhuǎn)移性PTC中都有報(bào)道，在原發(fā)性PTC發(fā)生率為7.7%，雙突變協(xié)同效應(yīng)預(yù)測(cè)惡性程度高，與單基因BRAF V600E或TERT突變相比，經(jīng)過(guò)15年隨訪，雙基因突變復(fù)發(fā)率明顯升高、死亡率高。研究發(fā)現(xiàn)，RAS和TERT突變也具有協(xié)同作用，雙基因突變與FTC復(fù)發(fā)、死亡率升高相關(guān)[19]；伴有BRAF/RAS合并TERT啟動(dòng)子突變病人，甲狀腺全切除顯著減少術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)、淋巴轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；2015版ATA指南指出[12]，BRAF突變聯(lián)合其他基因突變，如TERT、PIK3CA、TP53等基因預(yù)示甲狀腺癌具有更高的惡性風(fēng)險(xiǎn)，擴(kuò)大手術(shù)范圍使病人有更多獲益。

3.基因變異與碘治療：BRAF突變病人出現(xiàn)碘抵抗、放射碘劑量明顯高于野生型；BARF突變下調(diào)碘代謝相關(guān)基因，如NIS、TSHR、SLC26A4、TPO和TG等相關(guān)基因，誘導(dǎo)BRAF基因突變能夠下調(diào)這些基因表達(dá)，抑制BRAF突變可以恢復(fù)這些基因的表達(dá)；BRAF突變上調(diào)促癌基因VEGF和MET表達(dá)，與腫瘤的侵襲能力和碘治療失敗密切相關(guān)[20]；RAS和TERT突變腫瘤病人行甲狀腺全切除和同位素治療使病人有更多獲益。在碘難治PTC中，應(yīng)用MAPK通路抑制劑能恢復(fù)甲狀腺癌對(duì)放射碘的敏感性；最近研究顯示，TERT啟動(dòng)子突變也與甲狀腺癌吸碘或碘抵抗密切相關(guān)；年輕PTC病人對(duì)碘治療敏感、治療效果好，這通常與BRAF突變率低和TERT啟動(dòng)子突變少見(jiàn)有關(guān)[19]。BRAF突變與碘抵抗、淋巴結(jié)復(fù)發(fā)密切相關(guān)，BRAF聯(lián)合TERT啟動(dòng)子雙突變推薦行頸部淋巴結(jié)的預(yù)防性清掃提高治愈率，因?yàn)榇瞬±龑?duì)放射碘不敏感，同位素治療效果差。在臨床實(shí)踐中，伴BRAF突變的病人并非完全不吸收碘，病人通常對(duì)碘治療部分敏感，增加放射碘劑量和應(yīng)用BRAF抑制劑通常能增加治療效果。

4.基因變異與靶向治療：靶向用藥是放射碘治療抵抗或手術(shù)不能切除的甲狀腺癌病人具有廣闊應(yīng)用前景的治療方式。靶向藥物主要針對(duì)VEGF、MAPK及PI3K等通路。索拉菲尼是一種同時(shí)靶向VEGFR、 RET/PTC及 BRAF等的小分子酪氨酸激酶抑制劑(TKI)，2013年FDA就已批準(zhǔn)索拉菲尼為治療局部復(fù)發(fā)或者轉(zhuǎn)移、放射碘抵抗的進(jìn)展期DTC。最近一項(xiàng)關(guān)于索拉菲尼對(duì) DTC、MTC及 ATC療效的系統(tǒng)回顧研究表明，部分緩解率和穩(wěn)定率分別是 21%和60%[21]。凡德他尼屬于口服TKI，靶點(diǎn)為VEGFR-1、VEGFR-2和RET，2011年凡德他尼成為第一個(gè)被FDA批準(zhǔn)治療癥狀性或進(jìn)展性MTC靶向藥物。在一個(gè)包括331例受試對(duì)象的Ⅲ期隨機(jī)對(duì)照臨床研究中，凡德他尼治療組病人的反應(yīng)率高、降鈣素和癌胚蛋白下降，無(wú)進(jìn)展生存期明顯延長(zhǎng)和病人死亡率降低[22]?？ú┨婺崾橇硪环N口服TKI，作用 VEGFR-1、 VEGFR-2、 MET 和 RET靶點(diǎn)，2012年也被FDA批準(zhǔn)為治療進(jìn)展期MTC靶向藥物，對(duì)于治療不能切除、局部晚期或轉(zhuǎn)移性MTC效果顯著。2018年FDA批準(zhǔn)針對(duì)NTRK1-3基因融合的靶向藥物拉羅替尼(LOXO-101)上市，成為首個(gè)被批準(zhǔn)的針對(duì)特定基因變異，跨腫瘤種類的廣譜抗癌靶向藥。甲狀腺癌中NTRK基因融合的發(fā)生率雖然僅約1.5%，但考慮到甲狀腺癌龐大的病人基數(shù)以及不斷增長(zhǎng)的發(fā)病率，拉羅替尼的問(wèn)世仍然能為很多晚期甲狀腺癌病人帶來(lái)曙光[23]?？傊?，靶向藥物是難治性或晚期甲狀腺癌治療的新航標(biāo)。

四、基因變異與遺傳性腫瘤

依據(jù)細(xì)胞來(lái)源不同，甲狀腺癌分非甲狀腺髓樣癌(NMTC)和甲狀腺髓樣癌(MTC)[24]。在NMTC中，家族性非甲狀腺髓樣癌(FNMTC)占5%～15%，F(xiàn)NMTC指來(lái)源于濾泡上皮細(xì)胞2代或2代以上直系親屬續(xù)貫性罹患甲狀腺癌，是一種雙側(cè)葉、多灶性疾病，早期出現(xiàn)局部浸潤(rùn)、甲狀腺外浸潤(rùn)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。FNMTC與TCO 19q13.2、PRN1 1q21、NMTC1 2q21位點(diǎn)變異有關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)，這些基因變異可出現(xiàn)在一個(gè)或幾個(gè)家庭中。胚系突變，如ATM、RET、DNA修復(fù)基因XRCC128和XRCC329、外源性代謝基因GSTT1和GSTM1與患病風(fēng)險(xiǎn)亦相關(guān)。

MTC來(lái)源于濾泡旁細(xì)胞，家族性或遺傳性MTC占20%～25%，它可能作為MEN2綜合征的一部分或家族性MTC(FMTC)，其遺傳基礎(chǔ)為RET基因10q11.2位點(diǎn)突變。MEN2綜合征主要分為MEN2A、MEN2B和FMTC。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)MTC與RET 10q11.2基因突變有關(guān)，RET基因長(zhǎng)60kb，包含21個(gè)外顯子。98% MEN2腫瘤突變發(fā)生在富含半胱氨酸的胞外結(jié)構(gòu)域，特別是10號(hào)外顯子(密碼子609、 611、 618、 620 和 634)和11號(hào)外顯子(密碼子 630 和 634)。這些突變與95%的MEN2A和85%的FMTC有關(guān)。突變位點(diǎn)的不同導(dǎo)致致病表型也不同，包括發(fā)病年齡、MTC侵襲性、伴隨其他內(nèi)分泌腫瘤是否發(fā)生和發(fā)生的時(shí)間，這決定手術(shù)時(shí)間選擇、手術(shù)方式和手術(shù)范圍[25]。

五、小結(jié)

基于基因變異對(duì)甲狀腺癌的惡性風(fēng)險(xiǎn)分層和精準(zhǔn)個(gè)體化管理已得到廣泛認(rèn)可，特別是BRAF V600E和TERT啟動(dòng)子突變對(duì)于甲狀腺癌的個(gè)體化管理顯得尤為重要。BRAF V600E或RAS 和TERT 啟動(dòng)子雙基因突變強(qiáng)烈預(yù)示DTC的高侵襲性和預(yù)后不良，對(duì)于臨床上選擇積極觀察還是外科處理、腺葉切除還是甲狀腺全切除、是否行頸部淋巴結(jié)清掃及清掃范圍、同位素治療、靶向治療等具有重要意義。隨著研究的深入，相信將會(huì)有更多的基因變異被證明可以用來(lái)指導(dǎo)甲狀腺癌的個(gè)體化管理。