哈福雙， 韓 濤， 唐 飛， 閆俊卿， 王浩宇

天津市第三中心醫(yī)院，天津市重癥疾病體外生命支持重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 天津市人工細(xì)胞工程技術(shù)研究中心，天津市肝膽研究所， 天津 300170

肝細(xì)胞癌(HCC)是世界范圍內(nèi)最常見(jiàn)的原發(fā)性肝臟惡性腫瘤，在過(guò)去幾十年成為癌癥相關(guān)最主要的死亡原因之一[1]。由于患者不適癥狀出現(xiàn)較晚，難以早期發(fā)現(xiàn)，只有不到20%的HCC患者能夠接受根治性手術(shù)切除、消融或原位肝移植，而大多數(shù)進(jìn)展期HCC患者只能接受姑息性治療[2]。自2007年引入分子靶向藥物索拉非尼以來(lái)，HCC的系統(tǒng)性治療已經(jīng)發(fā)生了巨大變化，特別是2017年9月、2018年11月美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)先后批準(zhǔn)程序性細(xì)胞死亡蛋白1(programmed cell death protein-1, PD-1)抑制劑納武利尤單抗、帕博利珠單抗用于治療進(jìn)展期HCC以來(lái)，HCC的治療進(jìn)入了免疫治療時(shí)代。然而數(shù)據(jù)表明只有少數(shù)HCC患者受益于這種治療方案。目前，大量研究旨在找到免疫治療的優(yōu)化人群，從而提高抗腫瘤療效。

1 HCC患者肝臟的免疫特點(diǎn)

肝臟有肝動(dòng)脈和門(mén)靜脈雙重血供系統(tǒng)，肝血竇中充滿(mǎn)免疫細(xì)胞，肝細(xì)胞同時(shí)暴露在大量腸道病原體及無(wú)害抗原如營(yíng)養(yǎng)抗原中[3]。肝臟為適應(yīng)這種獨(dú)特的抗原暴露環(huán)境而呈現(xiàn)一種固有的免疫耐受狀態(tài)[4]。HBV、HCV、酒精等均可導(dǎo)致肝臟的慢性炎癥反應(yīng)，故HCC是在肝臟慢性炎癥狀態(tài)下發(fā)生的惡性腫瘤。這種慢性炎癥基礎(chǔ)促進(jìn)了抑制性免疫細(xì)胞因子進(jìn)一步抑制免疫反應(yīng)并有利于腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)[5]。在HCC進(jìn)展過(guò)程中，由于這些細(xì)胞因子的分泌，調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞和骨髓來(lái)源的免疫抑制細(xì)胞也被募集到腫瘤部位，進(jìn)一步強(qiáng)化了已經(jīng)存在的免疫抑制狀態(tài)[5-6]。近年來(lái)，人們發(fā)現(xiàn)在HCC病灶中常見(jiàn)的幾種免疫檢查點(diǎn)信號(hào)通路受體會(huì)上調(diào)，使得免疫細(xì)胞無(wú)法激活并攻擊腫瘤細(xì)胞[7]。

2 抑制PD-1及其配體(PD-L1)信號(hào)通路治療HCC的療效

PD-1是一種廣泛表達(dá)于多種免疫細(xì)胞類(lèi)型的細(xì)胞表面蛋白，如CD8+T淋巴細(xì)胞、CD4+T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞等[8]。PD-L1與PD-1連接后，可直接抑制T淋巴細(xì)胞的增殖和其效應(yīng)功能[9]。生理?xiàng)l件下，此信號(hào)通路用以維持炎癥穩(wěn)態(tài)、保護(hù)組織完整性并防止不必要的自身免疫反應(yīng)[10]。在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中，PD-1/PD-L1信號(hào)通路上調(diào)，使得肝臟微環(huán)境中有效的抗腫瘤免疫監(jiān)測(cè)功能受損[11]?；贑heckMate 040及KEYNOTE 224的研究結(jié)果，F(xiàn)DA于2017年9月、2018年11月分別批準(zhǔn)PD-1抑制劑納武利尤單抗、帕博利珠單抗作為進(jìn)展期HCC的二線(xiàn)治療用藥。盡管新的治療方案給HCC患者帶來(lái)了更多的希望，但PD-1/PD-L1受體抑制劑大約在80%的HCC患者中效果欠佳。此外，其治療費(fèi)用高昂，藥物相關(guān)不良反應(yīng)發(fā)生率較高[12]，迫切需要找到治療效果預(yù)測(cè)因素，使患者得到更多臨床獲益。

3 應(yīng)用PD-1/PD-L1抑制劑治療效果的可能預(yù)測(cè)因素

HCC患者應(yīng)用PD-1/PD-L1抑制劑治療效果不佳的原因復(fù)雜，包括免疫原性的突變、細(xì)胞因子信號(hào)缺陷和腫瘤細(xì)胞上調(diào)免疫檢查點(diǎn)途徑相關(guān)信號(hào)因子等。迄今為止，關(guān)于HCC應(yīng)用PD-1/PD-L1抑制劑治療效果的預(yù)測(cè)生物標(biāo)志物的報(bào)道甚少。本文將回顧在HCC及其他腫瘤類(lèi)型中進(jìn)行研究的生物標(biāo)志物，這些標(biāo)志物均可能與PD-1/PD-L1抑制劑治療HCC效果預(yù)測(cè)相關(guān)。

3.1 PD-L1的表達(dá) 有研究[13]表明，非小細(xì)胞肺癌患者中，高表達(dá)的PD-L1水平與較高的客觀緩解率和生存率有關(guān)，然而，CheckMate-040研究[14]結(jié)果卻顯示，HCC患者基線(xiàn)腫瘤細(xì)胞PD-L1水平對(duì)客觀緩解率沒(méi)有明顯的影響。在某些腫瘤類(lèi)型中，腫瘤組織浸潤(rùn)免疫細(xì)胞上的PD-L1表達(dá)水平可能比腫瘤細(xì)胞上的PD-L1表達(dá)水平更能預(yù)測(cè)PD-1/PD-L1抑制劑的治療效果[15]。因此，HCC浸潤(rùn)免疫細(xì)胞上的PD-L1表達(dá)水平可能是對(duì)PD-1/PD-L1抑制劑反應(yīng)的潛在標(biāo)志物。為明確此種假設(shè)，需進(jìn)一步解決以下問(wèn)題：如何定義PD-L1高表達(dá)的界限值[16]；統(tǒng)一用于檢測(cè)PD-L1水平的抗PD-L1 抗體，提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性和重復(fù)性[17]。

3.2 腫瘤突變負(fù)荷和微衛(wèi)星不穩(wěn)定 腫瘤在轉(zhuǎn)化和發(fā)展過(guò)程中獲得了不同的體細(xì)胞突變，腫瘤細(xì)胞的遺傳異質(zhì)性是惡性腫瘤的基本特性[18]。腫瘤突變負(fù)荷(tumor mutation burden, TMB)被定義為腫瘤基因組中每個(gè)編碼區(qū)域的突變總數(shù)，其范圍從數(shù)個(gè)到數(shù)千個(gè)不等[19]。體細(xì)胞突變?nèi)琰c(diǎn)突變、框移突變或插入、刪除突變，產(chǎn)生新的蛋白質(zhì)或肽序列被稱(chēng)為新抗原。TMB水平較高的腫瘤一般表達(dá)了更多的新抗原，這些新抗原可能使免疫系統(tǒng)產(chǎn)生更強(qiáng)的抗腫瘤反應(yīng)，因此可能對(duì)免疫治療產(chǎn)生更好的效果。高水平TMB已被證實(shí)為多種惡性腫瘤應(yīng)用PD-1/PD-L1抑制劑更佳療效的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素[20]。但是，如果TMB未能表達(dá)高質(zhì)量的新抗原則可能導(dǎo)致T淋巴細(xì)胞并不攻擊腫瘤細(xì)胞。例如參與MAP激酶通路活化的KRAS和BRAF基因突變或其他突變，可減少Ⅰ類(lèi)MHC分子的表達(dá)或影響肽合成過(guò)程中的重要分子，導(dǎo)致即使在高TMB患者中，抗腫瘤免疫能力依舊不足[21-22]。目前，測(cè)定TMB需要進(jìn)行全外顯子測(cè)序，費(fèi)用昂貴且耗時(shí)較長(zhǎng)[23]。因此，應(yīng)用TMB預(yù)測(cè)HCC患者應(yīng)用PD-1/PD-L1抑制劑治療的效果，仍需進(jìn)一步探討。

微衛(wèi)星不穩(wěn)定(microsatellite stability, MSI)是由錯(cuò)配修復(fù)缺陷引起的超突變表型，是FDA批準(zhǔn)的首個(gè)PD-1抑制劑治療的預(yù)測(cè)生物標(biāo)志物[24]。然而目前數(shù)據(jù)表明，在HCC患者中,很少能觀察到MSI[25]。

3.3 腫瘤微環(huán)境 目前，普遍認(rèn)為腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment, TME)的異質(zhì)性可能是導(dǎo)致腫瘤特異性T淋巴細(xì)胞活化、克隆增殖以及腫瘤免疫治療效果差異的部分原因[26]。腫瘤微環(huán)境大體分為兩個(gè)類(lèi)型:其一，“熱”免疫炎癥型TME：表現(xiàn)為更高密度的CD8+腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞；更高水平的干擾素和干擾素刺激趨化因子,如CXCL9、CXCL11等[27]。一項(xiàng)薈萃分析[28]表明，CD8+T淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn)與多種實(shí)體腫瘤類(lèi)型的化療和免疫治療反應(yīng)的改善有關(guān)。有研究[29]顯示，腫瘤細(xì)胞對(duì)PD-1抑制劑的應(yīng)答需要預(yù)先存在CD8+T淋巴細(xì)胞，這些細(xì)胞受PD-1/PD-L1介導(dǎo)的適應(yīng)性免疫耐受負(fù)調(diào)控。故“熱”免疫炎癥型TME可能預(yù)示PD-1/PD-L1抑制劑的治療獲益。其二，“冷”免疫炎癥型TME，通常表達(dá)與免疫抑制或耐受相關(guān)的細(xì)胞因子，如IL-10、IL-35、IL-4、TGFβ等，這類(lèi)腫瘤通常對(duì)PD-1/PD-L1抑制劑治療反應(yīng)較差[30-31]。但在HCC患者中，對(duì)腫瘤微環(huán)境的評(píng)估仍存在不可忽視的問(wèn)題。首先，此類(lèi)檢查需要肝組織活檢，并需要幾種抗體的組合、應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法來(lái)驗(yàn)證，實(shí)驗(yàn)過(guò)程復(fù)雜；其次，HCC患者尤其是多灶性HCC患者存在腫瘤異質(zhì)性，活檢樣本難以反應(yīng)腫瘤病灶全貌。因此，現(xiàn)階段應(yīng)用TME預(yù)測(cè)HCC患者對(duì)PD-1/PD-L1抑制劑的治療反應(yīng)仍然是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)。

3.4 液體活檢 “液體活檢”是指對(duì)血液或其他體液進(jìn)行低侵入性或非侵入性檢測(cè)以提供患者腫瘤遺傳信息的一種檢查方法，避免了有創(chuàng)肝組織活檢中腫瘤異質(zhì)性及取樣變異性的弊端[32-33]?！耙后w活檢”的腫瘤信息來(lái)源包括循環(huán)腫瘤游離DNA、循環(huán)腫瘤細(xì)胞、從體液中(如血清、血漿、尿液、唾液)循環(huán)的外泌體等。雖然“液體活檢”已經(jīng)在結(jié)直腸癌、乳腺癌和肺癌中用以預(yù)測(cè)治療反應(yīng)和監(jiān)測(cè)復(fù)發(fā)[33]，但在HCC臨床應(yīng)用的數(shù)據(jù)仍舊有限。下面列舉相對(duì)有前景的“液體活檢”檢測(cè)項(xiàng)目及目前研究結(jié)果：(1)中性粒細(xì)胞與淋巴細(xì)胞比率是非小細(xì)胞肺癌對(duì)納武利尤單抗治療效果的預(yù)測(cè)因素之一[34]。(2)在HCC中，PD-1等免疫檢查點(diǎn)分子在腫瘤組織中的表達(dá)水平，可部分由檢測(cè)血液循環(huán)中免疫細(xì)胞的檢查點(diǎn)分子的表達(dá)間接反應(yīng)[35]。(3)基線(xiàn)高水平抗炎癥細(xì)胞因子TGFβ可能與進(jìn)展期HCC患者PD-1抑制劑治療后預(yù)后差相關(guān)[36]。(4)基線(xiàn)高水平可溶性PD-L1水平與HCC患者較差預(yù)后相關(guān)[37]。(5) 細(xì)胞外囊泡如外泌體和微囊泡從包括腫瘤細(xì)胞在內(nèi)的各種細(xì)胞釋放，并攜帶影響免疫系統(tǒng)的生物活性分子。有研究[38]表明，對(duì)PD-1抑制劑有治療應(yīng)答的黑色素瘤患者，在治療早期循環(huán)外分泌體中PD-L1水平增加。(6)有證據(jù)表明，評(píng)估循環(huán)腫瘤游離DNA中的TMB可能是可行的，它避免了肝活檢中同一患者不同病灶的腫瘤的異質(zhì)性和取樣的變異性[39]。綜上，“液體活檢”有可能成為預(yù)測(cè)HCC患者對(duì)PD-1/PD-L1抑制劑治療反應(yīng)的重要工具。

3.5 腸道菌群 越來(lái)越多的證據(jù)表明，腸道菌群在肝臟炎癥和HCC發(fā)生的過(guò)程中起到關(guān)鍵作用[40]。對(duì)免疫檢查點(diǎn)抑制劑的原發(fā)耐藥可能是由患者的腸道微生物成分異常導(dǎo)致的(如抗生素相關(guān)的腸道菌群失調(diào))[41]。而且，腸道微生物菌落特性還可能與免疫相關(guān)的藥物不良事件的發(fā)生有關(guān)，如治療導(dǎo)致的免疫相關(guān)性小腸結(jié)腸炎[42]。目前，腸道菌群對(duì)免疫檢查點(diǎn)抑制劑應(yīng)答的影響尚未在HCC中得到明確驗(yàn)證，仍需進(jìn)一步研究。

3.6 性別及年齡 一項(xiàng)對(duì)免疫檢查點(diǎn)抑制劑的隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)進(jìn)行的薈萃分析發(fā)現(xiàn)，男性的總體生存獲益明顯高于女性[43]。一項(xiàng)回顧性研究[44]指出，與男性相比，年齡<65歲的女性患者對(duì)PD-1抑制劑治療的客觀反應(yīng)率較低。另有研究[45]表明，年齡在60歲以上的患者對(duì)PD-1抑制劑治療有更好的反應(yīng)。無(wú)論男性還是女性，衰老都與性激素的喪失有關(guān)，因此，性別相關(guān)的差異可能會(huì)隨著年齡的增長(zhǎng)而部分消失。目前，關(guān)于性別和年齡對(duì)療效的影響還需要進(jìn)一步研究。

4 未來(lái)展望

目前，HCC已跨入免疫治療的新時(shí)代，PD-1/PD-L1抑制劑給HCC患者帶來(lái)了新的希望，但目前絕大部分患者療效欠佳。尋找高敏感性、高特異性預(yù)測(cè)治療效果的生物標(biāo)志物，對(duì)于優(yōu)化治療方案是必要的。盡管目前在其他腫瘤的治療中已有一些有希望的預(yù)測(cè)因素進(jìn)入了研究者的視野，但關(guān)于預(yù)測(cè)HCC患者治療效果的生物標(biāo)志物的報(bào)道甚少，仍需要大量的研究予以探索。