免疫反應與炎癥損傷在肝衰竭發(fā)病機制中的作用

王挺帥， 王 娜， 張榮臻,， 王明剛， 黃少東， 馬玉珍， 吳 聰， 毛德文

1 湖南中醫(yī)藥大學 研究生學院， 長沙 410000; 2 廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院 肝病一區(qū)， 南寧 530023;3 廣西中醫(yī)藥大學 研究生學院， 南寧 530023

肝衰竭是多種因素引起的嚴重肝臟損傷，導致合成、解毒、代謝和生物轉(zhuǎn)化功能嚴重障礙或失代償，出現(xiàn)以黃疸、凝血功能障礙、肝腎綜合征、肝性腦病、腹水等為主要表現(xiàn)的一組臨床癥候群[1]。在我國引起肝衰竭的主要病因是肝炎病毒(主要是HBV)，其次是藥物及肝毒性物質(zhì)(如乙醇、化學制劑等)[1-2]?；诓∈?、起病特點及病情進展速度，肝衰竭可分為4類：急性肝衰竭(ALF)、亞急性肝衰竭(SALF)、慢加急性(亞急性)肝衰竭(ACLF)和慢性肝衰竭(CLF)[1]。目前，肝衰竭的發(fā)病機制尚未完全明確，免疫損傷、缺血缺氧和內(nèi)毒素血癥在肝衰竭發(fā)生、發(fā)展的過程中起著重要作用，主要通過兩條作用途徑：一是直接損傷肝細胞導致肝細胞死亡；二是激活體內(nèi)免疫炎癥反應間接造成肝細胞損傷和死亡[3-5]。

近年來，越來越多的學者傾向于“以免疫炎癥損傷為核心的二次打擊學說”，即在病毒、病原體、毒性因子等對肝細胞直接損傷的基礎上，通過腸源性內(nèi)毒素介導的“內(nèi)毒素→免疫機制→細胞因子風暴”，產(chǎn)生過度、持久的免疫炎癥反應，進而對肝臟造成“二次打擊”，最終導致了肝衰竭的發(fā)生[6]。肝衰竭存在復雜的免疫、炎癥反應過程，肝臟固有免疫細胞可吞噬、殺傷病原體，從而維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定；過度的免疫反應導致炎癥因子水平增加，進而促進炎癥因子風暴形成，加重肝衰竭；肝臟代償性免疫抑制，免疫功能紊亂導致患全身炎癥反應綜合征和膿毒癥風險提高。本文就免疫反應和炎癥損傷在肝衰竭發(fā)病機制中的作用進行綜述。

1 免疫調(diào)節(jié)與肝衰竭

肝臟在免疫調(diào)節(jié)和宿主防御中起著重要作用，既可保護宿主免受感染，也可防止微生物及其產(chǎn)物經(jīng)胃腸道-門靜脈流入肝臟/體循環(huán)[7]。天然免疫系統(tǒng)是抵御病原體入侵和其他潛在威脅的第一道防線。多種天然免疫細胞間的精細協(xié)調(diào)對于有效地消滅和清除入侵病原體和其他分子威脅至關重要。肝臟富含天然免疫細胞，如巨噬細胞、Kupffer細胞、中性粒細胞、自然殺傷細胞(NK細胞)和樹突狀細胞(DC)等；適應性免疫細胞包括B淋巴細胞、T淋巴細胞、調(diào)節(jié)性T淋巴細胞(Treg)、輔助性T淋巴細胞(Th)17等，對微生物病原體及其產(chǎn)物有獨特的免疫反應，影響肝衰竭的發(fā)生發(fā)展過程。

1.1 先天性免疫

1.1.1 巨噬細胞 巨噬細胞是肝臟中重要的抗原遞呈細胞，Kupffer細胞占肝內(nèi)巨噬細胞總數(shù)的80%～90%[8-9]。Kupffer細胞具有大量的病原識別受體(pattern recognition receptors, PRR)、補體受體和Fc受體，通過這些受體以增強吞噬活性和產(chǎn)生炎性細胞因子，在免疫調(diào)節(jié)、組織修復和肝臟再生等方面具有重要作用[10-11]。Toll樣受體4(TLR4)主要在巨噬細胞上表達，在介導巨噬細胞活化和促炎細胞因子的產(chǎn)生中起重要作用。無論什么原因所致肝衰竭都伴隨著腸上皮屏障完整性的破壞，無論是直接的細胞毒性或是腸道微生態(tài)紊亂，都會增加肝臟的負擔[12-13]。在ACLF過程中，PRR和損傷相關分子模式(damage associated molecular pattern, DAMP)聯(lián)合作用引起的損傷是導致ACLF多器官損傷和衰竭的主要原因，組織損傷和細胞死亡又可進一步加劇DAMP及炎癥狀態(tài)，造成惡性循環(huán)[14]。

1.1.2 中性粒細胞 中性粒細胞是血液中含量最豐富的天然免疫細胞，其吞噬和清除細菌病原體的能力是天然免疫的關鍵一環(huán)[15]。中性粒細胞可發(fā)揮胞外抗菌作用以限制各種抗菌性顆粒蛋白的擴散，從而減少中性粒細胞引起的組織損傷，但同時中性粒細胞的形成及清除障礙募集級聯(lián)反應又會加重炎癥損傷程度[16]。有研究[17]發(fā)現(xiàn)，ACLF患者中性粒細胞功能障礙與死亡率增加之間存在相關性。王福生教授團隊[18]發(fā)現(xiàn)ACLF患者(除外合并腹膜炎、肺炎、腸炎等感染)的中性粒細胞/淋巴細胞比值顯著高于健康對照組與慢性乙型肝炎組，且比值隨著臨床分期的加重而升高。因此，中性粒細胞上調(diào)促使慢性肝病患者易受感染，也可能促進胃腸道的失調(diào)，增加循環(huán)中的微生物或微生物成分的數(shù)量，從而使慢性肝病的不適狀態(tài)持續(xù)下去，有助于增加發(fā)展CLF、ACLF的風險。

1.1.3 自然殺傷細胞(NK細胞) NK細胞占肝臟淋巴細胞總數(shù)的一半，其數(shù)量遠高于在外周血中[19]。NK細胞可表達多種激活和抑制性免疫受體，是調(diào)節(jié)肝臟免疫活性的關鍵前哨細胞[20]。NK細胞在ACLF病理過程中的作用較復雜，一方面，活化的NK細胞可通過增強細胞毒性而導致肝細胞損傷和死亡[21]；另一方面，NK細胞功能減弱的ACLF患者由于免疫反應削弱而更易受感染[22]。有研究[23]發(fā)現(xiàn)，NK細胞在ALF和HBV-ACLF的發(fā)病機制中起著關鍵作用，大量NK細胞從外周血、脾臟和骨髓中進入肝臟；同時，隨著細胞內(nèi)IFNγ和TNFα的產(chǎn)生，NK細胞的細胞毒活性也顯著增強；其中Fas/FasL和NKG2D/NKG2D配體通路參與了肝臟NK細胞介導的肝細胞損傷。

1.1.4 樹突狀細胞(DC) DC是一種特異性抗原遞呈細胞，在肝臟中較為豐富。在正常生理條件下，肝內(nèi)DC可以維持肝臟的免疫耐受環(huán)境；當病毒等病原體感染后，過量的免疫反應又可致肝損傷[24]。DC主要分為2種：髓樣DC和漿性DC，前者主要發(fā)揮抗原遞呈功能，后者在于局部的免疫調(diào)節(jié)作用。李保森等[25]發(fā)現(xiàn)HBV-ACLF患者肝內(nèi)浸潤大量的漿性DC和髓樣DC，并優(yōu)先分泌IL-10，發(fā)揮局部的免疫調(diào)節(jié)作用。除此之外，DC細胞有趨炎性效應，炎性組織中趨化因子的分泌增加可誘導DC的移位和聚集，髓樣DC可以通過激活初始T淋巴細胞分化成Th1或Th17，從而增強肝臟的免疫應答；然而，調(diào)節(jié)性DC由于表面分子表達量低，會誘導初始T淋巴細胞向Treg分化，起反向調(diào)控免疫反應的作用，導致免疫耐受或不應答[26-27]。

1.2 適應性免疫

1.2.1 T淋巴細胞 T淋巴細胞是來源于骨髓的多能干細胞(胚胎期則來源于卵黃囊和肝)，在胸腺內(nèi)發(fā)育為T淋巴細胞，隨后移行至外周免疫器官的胸腺依賴區(qū)定居，并可經(jīng)淋巴管、外周血和組織液等進行再循環(huán)，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能[28]。依據(jù)T淋巴細胞表面標志物及生物學功能的不同，可分為多種亞群，包括Th、抑制性T淋巴細胞、細胞毒性T淋巴細胞(CTL)等[29]。與肝衰竭存活組相比較，肝衰竭死亡組患者外周血CD3+、CD8+T淋巴細胞和CD4+/CD25+Treg比值降低更顯著，提示肝衰竭的發(fā)生發(fā)展過程與免疫功能密切相關[30]。

1.2.2 調(diào)節(jié)性T淋巴細胞(Treg) Treg在調(diào)控肝臟免疫應答中也起著至關重要的作用。CD4+CD25+Treg可通過TGF依賴性途徑限制ConA致肝損傷模型的肝損傷，IL-10也可通過表達CD4+CD25+Treg和Kupffer細胞，在ConA致肝損傷的肝臟耐受誘導中起重要作用[31]。Stoop等[32]研究發(fā)現(xiàn)，慢性乙型肝炎患者外周血CD4+T淋巴細胞中Treg比例明顯高于恢復期患者和健康人群，且Treg的比例及數(shù)量與血清HBV DNA的含量呈正相關；同時Treg能抑制HBV特異性T淋巴細胞反應，促進HBV持續(xù)慢性感染。在ACLF患者中，外周血CD4+CD25+Treg數(shù)量明顯低于HBV感染者，提示ACLF的發(fā)病機制可能由于患者外周血CD4+CD25+Treg數(shù)量過低從而引起CTL擴增失去控制，激發(fā)強烈的CD8+CTL反應，從而導致大量的肝細胞壞死，最終觸發(fā)凋亡機制引起肝細胞大量凋亡[33-34]。

1.2.3 輔助性T淋巴細胞(Th)17 Th17主要是在TGF和IL-6共同誘導下分化產(chǎn)生的，通過分泌細胞因子(主要為IL-17、IL-21、IL-22)以促進中性粒細胞的動員、招募及活化，從而介導促炎反應[35]。Th17和Treg不僅在發(fā)育過程中，而且在其效應功能上也存在相互關系。TGFβ可誘導Treg特異性轉(zhuǎn)錄因子Forkhead box P3(FOXP3)，而TGFβ中加入IL-6可抑制Treg的生成，誘導Th17，這提示Th17/Treg之間的良好平衡是維持免疫穩(wěn)態(tài)的關鍵[36]。Zhai等[37]研究顯示，ACLF患者外周血Th17和FoxP3(+)Treg均增加，且Th17與Treg的比值與ACLF患者的生存率成反比。有研究[38]發(fā)現(xiàn)，Th17相關的炎癥與抗原遞呈細胞分泌的IL-23水平呈正相關，IL-23是Th17擴增及維持促炎性應答所必需的細胞因子。

2 炎癥反應與肝衰竭

炎癥反應在肝衰竭的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用[39]。ACLF患者血清中多種促炎細胞因子(包括TNFα、IL-1β、IL-6、IL-8和單核細胞趨化蛋白1)水平明顯升高；同時，抗內(nèi)擾介質(zhì)如IL-10升高，但抗內(nèi)擾代償機制不足以抵消刺激反應拮抗肝衰竭的進程[40]。目前認為，炎癥反應通路可概括為“炎癥誘導物→感受細胞→炎癥介質(zhì)→靶組織”4個步驟。炎癥反應是一個多因素-多細胞-多通路-多層次的復雜病理生理反應，且與肝臟的免疫調(diào)節(jié)密切相關。

2.1 炎癥誘導物 外源性炎癥誘導物主要為病原體相關分子模式，是致病微生物的一些高度保守成分，如脂多糖、肽聚糖、脂蛋白、細菌DNA和病毒雙鏈RNA等[41]。病原體相關分子模式可通過PRR識別刺激信號級聯(lián)，匯集并激活NF-κB、IFN、激活蛋白1(AP-1)等轉(zhuǎn)錄因子，激活的轉(zhuǎn)錄因子誘導了多種基因，編碼抗菌效應物、細胞因子和趨化因子等，這些基因與誘導免疫反應有關[42-43]。PRR主要有4個亞家族：TLR、NLR、維甲酸誘導基因1樣受體和C型凝集素受體，PRR與先天性免疫細胞的結(jié)合誘導了適應性免疫細胞的共刺激信號[44-45]。TLR是一類高度保守的PRR，能夠識別PAMP從而迅速啟動免疫反應來抵抗入侵的病原微生物[46]。TLR4能特異性地識別PAMP，通過跨膜結(jié)構(gòu)將病原相關分子刺激信號轉(zhuǎn)導入細胞內(nèi)，產(chǎn)生復雜的級聯(lián)信號反應，激活NF-κB，釋放內(nèi)源性致炎因子TNFα、IL-1、IL-6等，誘導肝細胞壞死和凋亡，趨化中性粒細胞和淋巴細胞浸潤，加重肝細胞損傷[47]。NLR基因家族的一些成員，例如NLRP3(由NLRP3、ASC和Caspase-1構(gòu)成)，參與了“炎癥體”大分子蛋白質(zhì)復合物的組裝，這種復合物可激活炎癥半胱氨酸蛋白酶Caspase-1切割pro-IL-1β或pro-IL-18，導致這些炎癥細胞因子的成熟和分泌[48]。

內(nèi)源性炎癥誘導物是在組織或細胞損傷的情況下產(chǎn)生的，包括壞死細胞釋放的分子和細胞外基質(zhì)分解的產(chǎn)物，這些內(nèi)源性的炎癥誘導因子被稱為DAMP[49]。在生理狀態(tài)下，DAMP分子大多數(shù)存在于細胞中并起到維持細胞正常功能的作用；但細胞激活或受損、壞死后，DAMP可從被激活的免疫細胞或壞死細胞、細胞外基質(zhì)中被釋放出來，從而識別危險信號、刺激炎癥反應、調(diào)節(jié)免疫過程等[50-51]。DAMP分子IL-33可協(xié)同脂多糖促進TNFα、IL-6、IL-1β等促炎活性，且IL-33的表達增加與HBV-ACLF的嚴重程度呈正相關[52]。

肝臟炎癥可由各種DAMP和PAMP引起，是多種肝病(包括ALF、ACLF、肝硬化、酒精性肝病、肝纖維化和癌癥等)免疫病理學的主要組成部分。對乙酰氨基酚致ALF導致肝細胞氧化應激和線粒體損傷，從而釋放出可被Kupffer細胞識別的PAMP；反過來，活化的Kupffer細胞又可分泌促炎細胞因子(如TNFα)、活性氧和趨化因子(如CCL2)，放大促炎信號，增加骨髓源性細胞(主要是中性粒細胞和單核細胞)進入肝臟的募集，從而增強炎癥過程[53]。高遷移率族蛋白B1(HMGB-1)是最具特征的DAMP之一，在細胞壞死過程中，隨著細胞膜完整性的喪失，HMGB-1被釋放到局部組織環(huán)境和循環(huán)中，通過Kupffer細胞上的TLR4和晚期糖基化終產(chǎn)物受體上調(diào)NF-κB依賴的促炎細胞因子的分泌[54]。乙?；疕MGB-1可由激活的單核細胞和巨噬細胞分泌，高水平的HMGB-1和乙?；疕MGB-1與ALF患者預后不良相關[55]。

2.2 炎癥介質(zhì)

2.2.1 腫瘤壞死因子α(TNFα) TNFα在肝臟中主要由巨噬細胞(Kupffer細胞)產(chǎn)生，具有免疫調(diào)節(jié)和促炎活性，既可促使炎癥細胞募集、增強活性，從而啟動瀑布式炎癥級聯(lián)反應，又可促進肝細胞增殖，在肝再生過程中起著中心作用[56]。在肝衰竭過程中，TNFα是促進還是抑制肝細胞增殖，是拮抗還是加重肝衰竭，這是由發(fā)病時期、病情進展程度等決定。在肝損傷早期，高濃度的TNFα可保護肝細胞、促進肝細胞修復和再生；然而，持續(xù)增加的TNFα反而會誘導肝細胞的凋亡，加重肝損傷[57]。近年來，“內(nèi)毒素-巨噬細胞-炎癥因子風暴”的肝衰竭發(fā)病機制受到了高度重視，而TNFα是由內(nèi)毒素刺激產(chǎn)生的重要促炎細胞因子。在肝衰竭發(fā)生過程中，TNFα可直接損害肝細胞，又可通過促進炎癥因子的釋放，激活炎癥級聯(lián)反應，從而加重肝細胞壞死；可誘發(fā)中性粒細胞向內(nèi)皮細胞黏附或活化中性粒細胞，促使其趨化聚集于肝臟，釋放蛋白酶或氧自由基造成肝細胞損傷；可引起血管內(nèi)皮細胞損傷，微循環(huán)功能紊亂，導致缺血性肝細胞壞死[5]。

2.2.2 白細胞介素1(IL-1) IL-1超家族可分為3部分，包括IL-1亞家族[IL-1α、IL-β、IL-33和IL-1受體拮抗劑(IL-1Ra)]、IL-18亞家族(IL-18和IL-37)及IL-36亞家族(IL-36α、β、γ和IL-38)。上述的所有受體均為雜多聚體，其中至少有1個亞單位是IL-1受體家族的成員，其特征是胞外免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)Toll/IL-1R(TIR)結(jié)構(gòu)域。細胞刺激后，IL-1R亞單位通過TIR結(jié)構(gòu)域寡聚，隨后MyD88與TIR結(jié)構(gòu)域結(jié)合，觸發(fā)NF-κB向細胞核的轉(zhuǎn)移，激活MAPK(如p38和c-Jun氨基末端激酶)，從而導致促炎反應[57]。IL-1Ra可與IL-1R競爭性結(jié)合，阻斷IL-1引發(fā)的信號傳遞從而起到抗炎作用。有研究[58]表明，IL-1Ra可通過抑制炎癥反應,減少肝細胞凋亡,促進肝細胞修復和再生,拮抗肝衰竭。 IL-18能夠誘導Th1、NK細胞、NKT細胞等增殖，并具有抗感染、介導炎癥反應等多種生物學活性，在先天性和后天性免疫中起著重要的作用。IL-18可促進Th1亞群分化誘導產(chǎn)生大量INFγ、TNFα、FasL和穿孔素等，增強NK細胞和CTL殺傷肝細胞活性，導致肝衰竭[50]。IL-32可促使TNFα、IL-1β、IL-8等炎癥介質(zhì)或趨化因子的釋放，介導免疫損傷，加重炎癥反應[59]。

綜上所述，肝衰竭是臨床上常見而嚴重的臨床癥候群，其病情進展迅速、預后差、病死率極高。先天性免疫和適應性免疫都參與免疫介導的肝損傷，與肝衰竭的發(fā)病機制密切相關。炎癥反應是由炎癥誘導物→感受細胞→炎癥介質(zhì)→靶組織構(gòu)成的復雜過程，又與免疫反應密切相關共同參與肝衰竭的發(fā)生發(fā)展過程。宿主免疫反應與炎癥級聯(lián)反應在肝衰竭發(fā)病機制中極為重要，研究其作用機制對于提高臨床診療水平、研發(fā)新藥(例如TLR4拮抗劑、腸道失調(diào)調(diào)節(jié)劑、FXR激動劑、TNFα拮抗劑等)有著重要的意義。