丁久玲 鄭凱 史俊

摘要：為研究低溫脅迫下外源乙烯利和硒復(fù)配劑處理對(duì)鐵皮石斛抗寒性的影響，將鐵皮石斛幼苗在2 ℃下低溫脅迫7 d后，用不同濃度的外源乙烯利和硒復(fù)配劑進(jìn)行葉面噴施，其中外源乙烯利和外源硒均設(shè)置了4個(gè)濃度梯度，分別為0、2、5、10 mg/L和0、5、7.5、10 mg/L，采用不完全隨機(jī)設(shè)計(jì)將二者進(jìn)行復(fù)配，共設(shè)12種復(fù)配劑。結(jié)果表明，低溫脅迫下外源乙烯利和硒應(yīng)配合使用，具體表現(xiàn)為可使葉綠素含量和脯氨酸（PRO）含量增加，過氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）活性增強(qiáng)，丙二醛（MDA）含量下降;噴施濃度為2/7.5、5/7.5、2/10（mg/L）/（mg/L）的乙烯利和硒復(fù)配劑可使鐵皮石斛葉綠素含量、PRO含量、抗氧化酶活性增加，MDA含量下降，從而提高鐵皮石斛的抗寒性，降低植物受到的低溫傷害。

關(guān)鍵詞：鐵皮石斛;低溫脅迫;乙烯利;硒;抗寒性

中圖分類號(hào)：S567.23+9.01?? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A? 文章編號(hào)：1002-1302（2020）20-0164-06

鐵皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）是我國傳統(tǒng)的名貴中藥材，具有健胃、滋陰、清熱解毒、提高免疫力等功效。低溫會(huì)抑制鐵皮石斛幼苗的成活和生長，是影響其生存與分布的主要因素。因此，增強(qiáng)鐵皮石斛幼苗的抗寒能力，尋找一種有效緩解低溫傷害的方法是提高鐵皮石斛幼苗成活率及產(chǎn)量的關(guān)鍵，亦是鐵皮石斛種植和生產(chǎn)中亟待解決的問題。

乙烯利是一種植物生長調(diào)節(jié)劑，有研究認(rèn)為，乙烯利可以提高香蕉、葡萄等植物的抗寒性[1-3]。硒（Se）是對(duì)植物生長發(fā)育有益的營養(yǎng)元素，可參與植物體內(nèi)的氧化還原反應(yīng)，清除脂質(zhì)過氧化物等自由基，減少脅迫對(duì)生物膜等造成的機(jī)體過氧化損傷，從而降低脅迫帶來的傷害，在植物抗逆中的作用越來越受到重視。目前，涉及硒提高植物抗寒性的研究較少，孫麗等研究認(rèn)為，適宜濃度的硒可以減弱低溫對(duì)草莓、蘿卜、番茄等幼苗[4-6]的傷害，提高植物的耐寒性。關(guān)于乙烯利和外源硒配合使用提高植物耐寒性的研究至今處于空白狀態(tài)。

目前對(duì)于鐵皮石斛的研究多集中于組培[7-9]、栽培[10-12]、藥用[13-14]等方面，涉及低溫脅迫的文獻(xiàn)相對(duì)較少[15-16]，對(duì)于添加乙烯利、硒緩解低溫脅迫的研究報(bào)道更少，馬環(huán)等研究發(fā)現(xiàn)，乙烯利可提高鐵皮石斛的抗寒性[17];張艷嫣等研究發(fā)現(xiàn)，適量濃度外源硒可使鐵皮石斛幼苗的耐冷性增強(qiáng)[18]。乙烯利和硒配合使用對(duì)低溫脅迫下鐵皮石斛的抗寒性是否有影響尚未見報(bào)道。本研究基于外源物（乙烯利和硒）可有效緩解植物低溫傷害的理論知識(shí)，揭示乙烯利和硒配合使用對(duì)低溫脅迫下鐵皮石斛幼苗的影響和低溫傷害的緩解作用，探討有效緩解鐵皮石斛低溫傷害的外源物（乙烯利和硒復(fù)配劑）的適宜濃度等關(guān)鍵技術(shù)難題，以期為提高鐵皮石斛的產(chǎn)量和低溫脅迫下幼苗成活率等生產(chǎn)問題提供理論指導(dǎo)，并為鐵皮石斛在我國大范圍推廣應(yīng)用提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

以出瓶栽培1年的鐵皮石斛組培苗為供試材料，將其栽培于江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院農(nóng)博園大棚內(nèi)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

從溫室栽培床上挖出生長均勻、無病蟲害的盆栽鐵皮石斛幼苗，移栽到具有鐵皮石斛專用基質(zhì)的塑料花盆（規(guī)格為高18 cm、底面直徑15 cm）中，每盆6株。置于大棚內(nèi)正常培養(yǎng)15 d后置于醫(yī)用冷藏箱內(nèi)在2 ℃下低溫脅迫7 d，然后進(jìn)行外源乙烯利和硒復(fù)配劑處理。

外源乙烯利和外源硒均設(shè)置了4個(gè)濃度梯度，分別為0、2、5、10 mg/L和0、5、7.5、10 mg/L，采用不完全隨機(jī)設(shè)計(jì)將二者進(jìn)行復(fù)配，共獲得12種復(fù)配劑處理，具體為外源乙烯利濃度/外源硒濃度：0/0、5/0、0/7.5、2/5、2/7.5、2/10、5/5、5/7.5、5/10、10/5、10/7.5、10/10（mg/L）/（mg/L），其相應(yīng)編號(hào)分別為Y1（對(duì)照，即只噴水）、Y2、Y3、Y4、Y5、Y6、Y7、Y8、Y9、Y10、Y11、Y12。每個(gè)處理3次重復(fù)。外源硒用分析純亞硒酸鈉（Na2SeO3），外源乙烯利為40%乙烯利水劑。復(fù)配劑以葉面噴施的形式進(jìn)行施用，噴灑至葉片完全濕潤有水珠滴落為準(zhǔn)，之后置于人工氣候箱內(nèi)培養(yǎng)20 d。人工氣候箱條件設(shè)定：溫度為25 ℃，光照度為4 000 lx，光—暗周期為 12 h—12 h。在培養(yǎng)過程中，定期觀察植物生長狀況并進(jìn)行正常管理。復(fù)配劑處理20 d后采集倒3～5張葉片，置于-75 ℃低溫冰箱中進(jìn)行保存，用于生理指標(biāo)的測定。

1.3 測定項(xiàng)目

葉綠素含量參照《植物生理生化實(shí)驗(yàn)原理與技術(shù)（第二版）》[19]中的葉綠體色素含量測定方法進(jìn)行測定。

脯氨酸（PRO）含量的測定利用脯氨酸分光光度計(jì)試劑盒法。

丙二醛（MDA）含量的測定利用丙二醛分光光度計(jì)試劑盒法。

超氧化物歧化酶（SOD）活性的測定利用超氧化物歧化酶分光光度計(jì)試劑盒法，試劑盒由蘇州科銘生物技術(shù)有限公司（下同）提供。

過氧化物酶（POD）活性的測定利用過氧化物酶分光光度計(jì)試劑盒法。

過氧化氫酶（CAT）活性的測定利用過氧化氫酶分光光度計(jì)試劑盒法。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫脅迫下乙烯利和硒復(fù)配劑對(duì)鐵皮石斛葉綠素含量的影響

葉綠素可以吸收、傳遞光能，其含量多少在一定程度上決定了植物對(duì)光的吸收和利用效率，常常作為研究光合生理的重要指標(biāo)[20]之一。植物體內(nèi)葉綠素含量的增加可以在一定程度上提高其光合速率，促進(jìn)植物生長，進(jìn)而間接提高抗逆性。由圖1可知，不同濃度的外源乙烯利和硒復(fù)配劑對(duì)低溫脅迫下鐵皮石斛葉綠素含量的影響不同。Y5處理的葉綠素含量最高，其次是Y8、Y6、Y7、Y4、Y9處理，這6個(gè)處理間葉綠素含量差異不顯著，除Y9處理外，其他5個(gè)處理均顯著高于對(duì)照（Y1）;Y10、Y11、Y12處理的葉綠素含量均顯著低于對(duì)照，3個(gè)處理間葉綠素含量差異不顯著。低溫脅迫下不同濃度外源乙烯利和硒復(fù)配劑處理的鐵皮石斛葉綠素含量表現(xiàn)為Y5>Y8>Y6>Y7>Y4>Y9>Y3>Y2>Y1>Y11>Y12>Y10。Y2、Y3處理為單一使用外源乙烯利或硒的處理，其葉綠素含量稍高于對(duì)照（Y1），但與對(duì)照差異不顯著。據(jù)此可初步判斷，低溫脅迫下外源乙烯利和硒配合使用可增加鐵皮石斛葉綠素含量，且二者配合使用時(shí)適宜的濃度可使鐵皮石斛葉綠素含量顯著增加，復(fù)配劑的濃度過高或過低均會(huì)影響葉綠素含量的增加。本研究認(rèn)為，適宜濃度的外源乙烯利和硒復(fù)配劑（Y4、Y5、Y6、Y7、Y8處理）可以顯著提高低溫脅迫下鐵皮石斛的葉綠素含量，促進(jìn)植物生長。

2.2 低溫脅迫下乙烯利和硒復(fù)配劑對(duì)鐵皮石斛PRO含量的影響

研究表明，在低溫脅迫下，植物可通過體內(nèi)PRO含量的顯著增加來緩解受到的傷害，從而提高抗寒性[21]。由圖2可知，不同濃度的乙烯利和硒復(fù)配劑對(duì)低溫脅迫下鐵皮石斛PRO含量的影響各不相同。12組處理中，Y5處理的PRO含量最高，其次是Y6、Y8、Y4、Y9、Y7處理，這6個(gè)處理的PRO含量差異不顯著，均高于對(duì)照，其中Y5、Y6處理顯著高于對(duì)照;Y10處理的PRO含量最低，其次是Y11、Y2、Y12、Y3、Y1、Y7、Y9處理，8個(gè)處理間PRO含量差異不顯著且均較低。低溫脅迫下不同濃度乙烯利和硒復(fù)配劑處理的鐵皮石斛PRO含量表現(xiàn)為Y5>Y6>Y8>Y4>Y9>Y7>Y1>Y3>Y12>Y2>Y11>Y10。Y2、Y3處理為單一使用乙烯利或硒的處理，其PRO含量與對(duì)照相比差異不顯著且均較低。據(jù)此可判斷，低溫脅迫下乙烯利和硒應(yīng)配合使用才可明顯地增加鐵皮石斛的PRO含量。乙烯利和硒配合使用時(shí)濃度過高或過低均不利于PRO含量的增加，只有在濃度適宜時(shí)才可顯著提高鐵皮石斛的PRO含量。本研究認(rèn)為，Y5、Y6處理的乙烯利和硒復(fù)配劑可以顯著提高低溫脅迫下鐵皮石斛的PRO含量，進(jìn)而提高其抗寒性。

2.3 低溫脅迫下乙烯利和硒復(fù)配劑對(duì)鐵皮石斛MDA含量的影響

植物器官在低溫逆境下，往往會(huì)發(fā)生膜脂過氧化作用，MDA是膜脂過氧化作用的產(chǎn)物之一，通常將其含量作為脂質(zhì)過氧化指標(biāo)，反映細(xì)胞膜脂過氧化程度和植物對(duì)低溫逆境條件反應(yīng)的強(qiáng)弱，其含量高低與植物抗寒性強(qiáng)弱呈反比。由圖3可知，不同濃度的外源乙烯利和硒復(fù)配劑對(duì)低溫脅迫下鐵皮石斛MDA含量的影響不同。Y6處理的MDA含量最低，與對(duì)照相比下降最為顯著，其次是Y8、Y4、Y9、Y7、Y5處理，這6個(gè)處理的MDA含量差異不顯著，且后5個(gè)處理與對(duì)照相比差異不顯著。Y10處理的MDA含量最高，其次是Y1、Y12、Y3、Y2、Y11處理，這6個(gè)處理差異不顯著且均較高。低溫脅迫下不同濃度的外源乙烯利和硒復(fù)配劑處理的鐵皮石斛MDA含量表現(xiàn)為Y6

2.4 乙烯利和硒復(fù)配劑對(duì)低溫脅迫下鐵皮石斛抗氧化酶活性的影響

2.4.1 乙烯利和硒復(fù)配劑對(duì)低溫脅迫下鐵皮石斛SOD活性的影響 超氧陰離子自由基是在生物氧化、電子傳遞過程中產(chǎn)生的，可參與物質(zhì)代謝過程、誘發(fā)細(xì)胞的一些不良反應(yīng)等。當(dāng)植物遭遇低溫脅迫時(shí)，細(xì)胞中的超氧陰離子自由基積累過多，從而氧化、破壞生物大分子，甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡，而SOD可清除超氧陰離子自由基，緩解植物受到的不良傷害。由圖4可知，不同濃度的乙烯利和硒復(fù)配劑對(duì)低溫脅迫下鐵皮石斛SOD活性的影響有所不同。Y5、Y7、Y8處理與對(duì)照相比，SOD活性明顯上升;Y3、Y4、Y6這3個(gè)處理的SOD活性稍高于對(duì)照，與對(duì)照差異不顯著;Y9、Y10、Y11、Y12處理的SOD活性低于對(duì)照。低溫脅迫下不同濃度的乙烯利和硒復(fù)配劑處理的鐵皮石斛SOD活性表現(xiàn)為Y8>Y5>Y7>Y4>Y6>Y3>Y1>Y2>Y9>Y11>Y10>Y12。

Y2處理和Y3處理分別為單一使用乙烯利和硒的處理，與對(duì)照相比，SOD活性差異不顯著，故認(rèn)為，低溫脅迫下乙烯利和硒應(yīng)配合使用才可明顯增加鐵皮石斛的SOD活性，從而提高其抗寒性。本研究認(rèn)為，適宜濃度的乙烯利和硒復(fù)配劑（Y5、Y7、Y8處理）可明顯提高低溫脅迫下鐵皮石斛的SOD活性，可在一定程度上減少低溫脅迫造成的超氧陰離子自由基的積累，從而有效緩解鐵皮石斛受到的低溫傷害。

2.4.2 乙烯利和硒復(fù)配劑對(duì)低溫脅迫下鐵皮石斛POD活性的影響 研究表明，POD是植物體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的組成部分，具有抵御組織細(xì)胞發(fā)生膜質(zhì)過氧化的作用，POD活性高低與植物抗寒性強(qiáng)弱密切相關(guān)[22]。從圖5可以看出，不同濃度的乙烯利和硒復(fù)配劑對(duì)低溫脅迫下鐵皮石斛POD活性的影響不同。Y6處理的POD活性最高，顯著高于其他處理;其次是Y4、Y8、Y7、Y9、Y5處理，這5個(gè)處理間POD活性差異不顯著;Y11處理的POD活性最低，其次是Y2、Y3、Y10、Y12、Y1處理，均較低。低溫脅迫下不同濃度的乙烯利和硒復(fù)配劑處理的鐵皮石斛POD活性表現(xiàn)為Y6>Y4>Y8>Y7>Y9>Y5>Y10>Y3>Y2>Y12>Y1>Y11。Y2處理和Y3處理分別為單一使用外源乙烯利和硒的處理，其POD活性與對(duì)照相比差異不顯著且均較低。由此可知，單一施用乙烯利或硒也可以提高POD活性，但是效果不佳，只有在二者相互配合且乙烯利濃度不得過高的情況下POD活性才會(huì)顯著增加，POD活性的增強(qiáng)可提高鐵皮石斛的抗寒能力，緩解低溫脅迫的傷害。乙烯利和硒復(fù)配劑可以在一定程度上提高鐵皮石斛的POD活性，但復(fù)配劑的濃度過高或過低均不利于POD活性穩(wěn)定增加，只有在濃度適宜時(shí)才可顯著提高鐵皮石斛的POD活性。本研究認(rèn)為，Y6處理的乙烯利和硒復(fù)配劑可以顯著提高低溫脅迫下鐵皮石斛的POD活性。

2.4.3 乙烯利和硒復(fù)配劑對(duì)低溫脅迫下鐵皮石斛CAT活性的影響 CAT是植物在逆境條件下酶促防御系統(tǒng)的關(guān)鍵酶之一，在植物脅迫應(yīng)答以及控制細(xì)胞的氧化還原平衡等方面起著重要的作用，可催化H2O2分解為H2和O2[23]。由圖6可知，不同濃度的乙烯利和硒復(fù)配劑對(duì)低溫脅迫下鐵皮石斛CAT活性的影響均不顯著。Y5、Y8處理的CAT活性較高，對(duì)照的CAT活性最低。低溫脅迫下不同濃度的外源乙烯利和硒復(fù)配劑處理的鐵皮石斛CAT活性表現(xiàn)為Y5>Y8>Y6>Y7>Y4>Y9>Y12>Y3>Y10>Y11>Y2>Y1。外源乙烯利和硒復(fù)配劑對(duì)鐵皮石斛CAT活性有一定的促進(jìn)作用，但效果不顯著。