4種消毒藥物對綠鰭馬面鲀受精卵孵化的影響

英娜 秦搏 宋學鋒

摘要：為減少表面病原對綠鰭馬面鲀受精卵的影響，提高受精卵的健康出苗率，采用藥物浸泡法，研究甲醛、雙氧水、次氯酸鈉及聚維酮碘在不同藥物濃度下對綠鰭馬面鲀受精卵孵化率以及畸形率的影響，并以健康出苗率作為藥物對受精卵孵化效果的綜合評價指標。研究發(fā)現(xiàn)，聚維酮碘試驗組的健康出苗率相對于對照組差異不顯著，且當藥物質(zhì)量濃度為500 mg/L時，健康出苗率顯著低于對照組;次氯酸鈉組的整體健康出苗率與甲醛試驗組的效果相當，顯著高于對照組，但是均顯著低于雙氧水組，當雙氧水質(zhì)量濃度為1 000 mg/L時，健康出苗率可達69.33%，效果最佳。結(jié)果表明，宜選用雙氧水作為綠鰭馬面鲀受精卵孵化時的消毒藥物，質(zhì)量濃度為1 000 mg/L時消毒效果最佳。

關鍵詞：綠鰭馬面鲀;受精卵;孵化;健康出苗率;消毒藥物

中圖分類號：S961.2?? 文獻標志碼： A? 文章編號：1002-1302（2020）20-0190-05

綠鰭馬面鲀，隸屬于鲀形目（Tetraodontiformes）單角鲀科（Monacanthidae）馬面鲀屬（Thamnaconus），又稱剝皮魚、面包魚等[1-2]。作為經(jīng)濟魚類，具有重要的食用價值和營養(yǎng)價值，其肉質(zhì)鮮嫩，富含豐富的人體必需氨基酸及不飽和脂肪酸EPA、DHA等[3]。綠鰭馬面鲀?yōu)橥夂Ｅ越讓郁~類，在西北太平洋的渤海、黃海、東海、南海以及日本海均有分布，其中，東海是我國綠鰭馬面鲀的主要捕撈區(qū)[4]，但隨著網(wǎng)具的發(fā)展，無序捕撈的加劇，漁業(yè)資源呈現(xiàn)枯竭趨勢，目前的捕撈量已經(jīng)遠不能滿足市場需求[5]，因此工廠化增養(yǎng)殖技術亟需解決。自2011年突破了人工繁育技術以來，綠鰭馬面鲀工廠化養(yǎng)殖數(shù)量呈現(xiàn)遞增趨勢，不僅帶動了相關水產(chǎn)品加工產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，也為魚苗的增殖放流增加了多樣性。

關于綠鰭馬面鲀?nèi)斯し庇夹g中的關鍵點如生殖調(diào)控技術[6]、受精卵孵化條件[7]、胚胎發(fā)育[8]等技術已被探索，但是綠鰭馬面鲀的受精卵為黏性、沉性卵，其表面黏絲使其容易黏附在其他物體上[7]，同時也容易黏附藻類、有害微生物等從而影響受精卵的孵化及后期發(fā)育。實際生產(chǎn)過程中我們發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)任何處理的綠鰭馬面鲀受精卵的孵化率遠低于其他魚類，而畸形率卻遠高于其他魚類。提高受精卵的孵化率并降低畸形率，是綠鰭馬面鲀?nèi)斯し敝尺^程中的一大技術要點。

采用消毒藥物對受精魚卵進行消毒是魚類育苗過程中通常采用的辦法，已有相關研究針對不同魚類的受精卵孵化進行最佳消毒藥物以及最佳濃度方面的探索，但是由于不同種類的魚卵表面理化性質(zhì)不一以及地域水環(huán)境、受精卵本身攜帶的病原有差異，最佳消毒藥物及最佳濃度也將因魚的種類不同而異。本研究使用常見的4種藥物（甲醛、雙氧水、次氯酸鈉、聚維酮碘）對綠鰭馬面鲀受精卵進行消毒處理，觀察不同藥物對孵化情況的影響，希望找到適用于提高綠鰭馬面鲀受精卵出苗率的最佳藥物以及最適濃度。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2019年5月在中國水產(chǎn)科學研究院東海水產(chǎn)研究所贛榆研究中心進行。選擇2齡以上的綠鰭馬面鲀經(jīng)過營養(yǎng)強化和人工生殖調(diào)控作為試驗親魚，在產(chǎn)卵池中自然產(chǎn)卵、授精，池底鋪波紋板用于收集受精卵，用海綿或者軟毛刷于波紋板上將綠鰭馬面鲀受精卵輕輕刷至玻璃燒杯中，于解剖鏡下挑選質(zhì)量較好且發(fā)育至原腸期的同一批受精卵用于試驗。

1.2 試驗方法

4種消毒藥物分別是甲醛，含量37%，萊陽市康通化工有限公司生產(chǎn);雙氧水，含量3%，廣東恒健制藥有限公司生產(chǎn);次氯酸鈉，含量10%，天津富宇精細化工有限公司生產(chǎn);聚維酮碘溶液，含量10%，廈門惠盈動物藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。依據(jù)相關要求與標準，試驗之前先將各藥物配制試驗液母液，根據(jù)試驗需要逐步稀釋到設定濃度，現(xiàn)配現(xiàn)用?？紤]到實際生產(chǎn)時可操作性，參考相關文獻資料和預試驗結(jié)果，設置各藥物質(zhì)量濃度梯度和處理時間（表1）。甲醛、雙氧水、次氯酸鈉、聚維酮碘4種藥物共設置4個質(zhì)量濃度梯度，處理時間為10 min，每個質(zhì)量濃度設置3組平行，并設置相應的空白對照組。每組采用靜水1次消毒處理，取100粒受精卵，在相應質(zhì)量濃度藥物中浸泡10 min，到時間后迅速將受精卵轉(zhuǎn)至1 000 mL的燒杯中，燒杯內(nèi)提前加好經(jīng)砂濾PP棉（規(guī)格：25.4 cm，孔徑0.5 μm）過濾的海水，微充氧，水溫控制在22 ℃。經(jīng)48 h孵出仔魚后，統(tǒng)計不同試驗組孵出仔魚數(shù)量以及魚苗脊柱彎曲、油球異位或異數(shù)等畸形仔魚數(shù)量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

孵化率=孵出魚苗數(shù)/受精卵數(shù)×100%;

畸形率=畸形個數(shù)/孵出魚苗數(shù)×100%;

健康出苗率=（孵出魚苗數(shù)-畸形魚苗數(shù)）/受精卵數(shù)×100%。

本研究中的各數(shù)據(jù)結(jié)果采用均值±標準差（x±s）表示，數(shù)據(jù)分析軟件采用的是Excel 2017和SPSS 19，以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與分析

消毒試驗前在Olympus顯微鏡100倍下受精卵觀察到表面存在念珠藻、細菌、纖毛蟲等微生物（圖1），也可能存在未觀察到的病毒等病原。不同消毒藥物及相關質(zhì)量濃度對應的綠鰭馬面鲀受精卵孵化率及畸形率見表2。

2.1 甲醛對綠鰭馬面鲀受精卵孵化的影響

甲醛4個不同質(zhì)量濃度處理的綠鰭馬面鲀受精卵孵化情況見表2。孵化率隨著藥物質(zhì)量濃度增加而逐漸升高，均顯著高于對照組，2 000 mg/L質(zhì)量濃度組孵化率顯著高于其他3個質(zhì)量濃度組?；温试?組藥物中隨著藥物質(zhì)量濃度增加而逐漸升高，500、1 000 mg/L質(zhì)量濃度組顯著低于對照組，1 500 mg/L 與對照組差異不顯著，2 000 mg/L質(zhì)量濃度組畸形率顯著高于對照組。孵化率和畸形率隨著藥物質(zhì)量濃度增加均有升高趨勢。

2.2 雙氧水對綠鰭馬面鲀受精卵孵化的影響

由雙氧水4個不同質(zhì)量濃度處理的綠鰭馬面鲀受精卵孵化的情況見表2。隨著藥物質(zhì)量濃度增加，孵化率逐漸升高，處理組顯著高于對照組，2 000 mg/L 質(zhì)量濃度組孵化率高達98.00%，顯著高于500 mg/L質(zhì)量濃度組）;畸形率在4組藥物中隨著藥物質(zhì)量濃度增加逐漸升高，500、1 000 mg/L質(zhì)量濃度組均顯著低于對照組，2 000 mg/L質(zhì)量濃度組的畸形率顯著高于對照組，達到36.73%。

2.3 次氯酸鈉對綠鰭馬面鲀受精卵孵化的影響

孵化率隨著次氯酸鈉質(zhì)量濃度增加持續(xù)降低，但均顯著高于對照組，0.2 mg/L質(zhì)量濃度組的孵化率高達58.67%，畸形率隨著次氯酸鈉質(zhì)量濃度增加持續(xù)升高，0.2 mg/L質(zhì)量濃度組畸形率顯著低于對照組，1.0、2.0 mg/L 質(zhì)量濃度組的畸形率顯著高于對照組（表2）。

2.4 聚維酮碘對綠鰭馬面鲀受精卵孵化的影響

孵化率隨著聚維酮碘質(zhì)量濃度增加而持續(xù)升高，孵化率在4個濃度組之間差異不顯著，200、500 mg/L 質(zhì)量濃度組顯著高于對照組，500 mg/L處理孵化率最高，為41.33%;畸形率隨著聚維酮碘質(zhì)量濃度增加而持續(xù)升高，且顯著高于對照組，畸形率在4個質(zhì)量濃度組之間存在顯著差異，500 mg/L處理畸形率最高，達到88.70%。

2.5 4種藥物對受精卵健康出苗率的影響

為了評估不同藥物的綜合效果，本研究分別對每種藥物及其不同質(zhì)量濃度組的健康出苗率做了比較分析。從圖2可以看出，對照組的健康孵化率為14.0%，雙氧水4個質(zhì)量濃度組（由低到高，下同）對應的健康出苗率分別是68.00%、69.33%、6450%、62.00%，效果優(yōu)于其他3種藥物;其次是甲醛，健康出苗率分別是52%、50.67%、44.67%、

46.67%;次氯酸鈉的健康出苗率分別是47.33%、27.33%、18.67%、17.33%，相對于對照組而言具有一定的作用，但是效果差于前2種藥物;聚維酮碘的健康出苗率分別是13.33%、12.00%、10.67%，467%，與對照組相當，在4種藥物中效果最差。

3 討論與結(jié)論

3.1 消毒藥物在受精卵孵化過程中的應用

在魚類人工繁育過程中，制約魚類孵化率的因素有很多，如受精卵質(zhì)量、環(huán)境因子（溫度、鹽度、pH值、病原）等。由于受精卵攜帶的病原，如神經(jīng)壞死病毒（NNV）[9]、水霉[10]等（這些病原可能通過水體、飼料以及垂直方式傳播而來），不僅會破壞受精卵結(jié)構阻滯其孵化出膜，即使孵化出膜，也可能繼續(xù)危害魚苗，造成其早期死亡。為提高受精卵孵化率、降低后期仔稚魚畸形率，人工育苗過程中使用化學藥物對受精卵進行消毒是非常重要的環(huán)節(jié)。但當化學消毒藥物不適宜或者濃度過高，也存在破壞受精卵卵膜、卵質(zhì)等結(jié)構，造成滲透壓失衡、圍心腔和卵黃囊腫大等畸形問題[11];采用合適的藥物及適宜濃度對受精卵進行消毒，不僅能殺死受精卵的表面病原，提高孵化率，而且能阻止病原內(nèi)侵，降低幼苗畸形率。

孔祥迪等研究了聚維酮碘、甲醛、二氧化氯和臭氧在不同質(zhì)量濃度及不同處理時間的條件下對石斑魚受精卵孵化效果的影響，結(jié)果表明，聚維酮碘20～70 mg/L以及臭氧0.3～0.5 mg/L處理 1 min，在對受精卵進行消毒的同時不會對受精卵造成顯著刺激，而甲醛和二氧化氯因?qū)Ψ趸试斐娠@著影響而不被推薦使用[12]。楊志強等研究4種消毒藥物對錦鯉受精卵孵化的影響，甲醛和聚維酮碘分別因畸形率高于對照組、孵化率低于對照組而不被推薦使用，二氧化氯雖然可以提高孵化率但同時畸形率也隨之升高，因此適宜消毒藥物及質(zhì)量濃度范圍為過氧化氫 500～1 000 mg/L，處理 10 min[13]。吳建紹等研究了聚維酮碘、甲醛、次氯酸鈉、三氯異氰尿酸等藥物對斜帶石斑魚受精卵孵化率的影響，并篩選出了不同藥物使用的最佳濃度[11]。

3.2 綠鰭馬面鲀受精卵的特點

綠鰭馬面鲀屬暖水性中下層洄游魚類[2]，其受精卵具有黏性、沉性的特點，主要通過表面的黏絲及不規(guī)則黏膜將其固定在其他物體上[7]。本研究中未經(jīng)消毒劑處理的對照組，孵化率僅為20.40%，遠低于同類研究中斜帶石斑魚的88%[11]、棕點石斑魚的92.9%、錦鯉的85.67%;同時，綠鰭馬面鲀對照組的畸形率高達31.45%，高于錦鯉的425%[13]、石斑魚的6.25%[12]。這些情況可能是由于綠鰭馬面鲀受精卵是黏性卵容易黏附平鋪在產(chǎn)卵池池底附著基上或水中的念珠藻、親魚糞便和原生動物，導致受精卵因表面附著的病原數(shù)量較多造成受精卵缺氧或與水環(huán)境物質(zhì)交換不暢。

3.3 4種消毒藥物對綠鰭馬面鲀受精卵孵化的影響

與對照組相比，4種消毒藥物消毒處理的受精卵都呈現(xiàn)畸形率升高的趨勢，與吳建邵研究的9種藥物對斜帶石斑魚受精卵孵化率的影響[11]，潘魯青研究的幾種消毒劑對中國對蝦受精卵和無節(jié)幼體的影響結(jié)果[14]相一致。除次氯酸鈉外，其他3種消毒藥物處理的受精卵孵化率呈升高趨勢，與孟思妤等的“菌毒消”能夠提高試驗魚的孵化率，除菌效果明顯結(jié)果[15]相同。說明3種消毒藥物能夠在不破壞卵質(zhì)的基礎上殺滅表面病原，提高孵化率，而次氯酸鈉可能因為具有腐蝕性和氧化性在消毒過程中對受精卵產(chǎn)生一定的破壞，導致受精卵孵化率隨濃度增加而降低，也與吳建紹等研究的次氯酸鈉對斜帶石斑魚受精卵孵化結(jié)果[11]一致。

受精卵孵化率和仔魚畸形率是評價孵化效果的常用指標[12]。消毒藥物的效果評價，不僅要考慮孵化率的高低，也要注意對畸形率的影響。本研究在同類研究中首次使用健康出苗率這一指標，它是指所有試驗受精卵中能孵出健康魚苗的比例，將孵化率和畸形率同時考慮在內(nèi)，可以作為消毒效果的綜合評價指標。聚維酮碘組的健康出苗率與對照組差異不大，且當質(zhì)量濃度達到500 mg/L時的健康出苗率顯著低于對照組，使用低質(zhì)量濃度聚維酮碘健康出苗率與對照組差異不顯著，這與孔祥迪等得出的聚維酮碘對石斑魚孵化率效果穩(wěn)定[12]不一致，可能是因為綠鰭馬面鲀受精卵對聚維酮碘耐受性差，聚維酮碘在殺滅病原的同時破壞了受精卵的滲透壓、卵質(zhì)等造成孵化率低。次氯酸鈉組在質(zhì)量濃度為0.2、0.5 mg/L時，健康出苗率顯著高于對照組，但是最高值僅為47%，且降幅較大，表明次氯酸鈉毒性高于甲醛和聚維酮碘，可能對受精卵后期致畸影響較大，因而在實際生產(chǎn)中要慎用此類藥物。甲醛藥物組的整體健康出苗率顯著高于聚維酮碘和次氯酸鈉，當質(zhì)量濃度為500 mg/L時，健康出苗率最高，為52%，但在使用過程中，由于甲醛刺激性氣味較重，會對人體各個系統(tǒng)產(chǎn)生一定的危害[16]，已經(jīng)在許多國家被禁止使用[17];本研究中，雙氧水消毒后的受精卵健康出苗率均高于其他3種藥物，與Rasowo等的研究結(jié)果[18]一致，且當藥物質(zhì)量濃度為500～1 500 mg/L時，健康出苗率趨于穩(wěn)定，當高于1 500 mg/L時，健康出苗率有下降趨勢，表明高質(zhì)量濃度過氧化氫對受精卵的孵化不利。

本研究通過比較4種藥物對綠鰭馬面鲀受精卵孵化率、畸形率的影響，以健康出苗率作為綜合評價指標，同時從消毒藥物對試驗人員盡量安全的角度，認為雙氧水的消毒效果最佳，當質(zhì)量濃度為 1 000 mg/L 時，健康出苗率最高，達69.33%，并且相對于甲醛、次氯酸鈉等藥物，雙氧水對人體危害程度較低，適合作為綠鰭馬面鲀受精卵孵化時的消毒藥物。

本研究結(jié)果可為人工養(yǎng)殖過程中的綠鰭馬面鲀受精卵孵化時消毒藥物的選擇提供指導，將對提高受精卵健康出苗率具有一定的積極意義。

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